Hier beschrijven we chirurgische ingrepen om een betrouwbare ruggenmerglaterale hemisectie (HX) te produceren op het9e thoracale niveau bij volwassen ratten en neurogedragsbeoordelingen die zijn ontworpen voor het opsporen van asymmetrische tekorten na zo’n eenzijdige verwonding.
Onvolledige dwarslaesie (SCI) leidt vaak tot beperkingen van sensorimotorische functies en is klinisch het meest voorkomende type SCI. Human Brown-Séquard syndroom is een veel voorkomend type van onvolledige SCI veroorzaakt door een laesie aan de ene helft van het ruggenmerg, wat resulteert in verlamming en verlies van proprioceptie aan dezelfde (of ipsilesional) kant als de schade, en verlies van pijn en temperatuur gevoel aan de tegenovergestelde (of contraionalles) kant. Adequate methoden voor het produceren van een ruggenmerg laterale hemisectie (HX) en het beoordelen van neurologische stoornissen zijn essentieel om een betrouwbaar diermodel van het Bruin-Séquard syndroom vast te stellen. Hoewel het laterale hemisectiemodel een centrale rol speelt in fundamenteel en translationeel onderzoek, ontbreken gestandaardiseerde protocollen voor het creëren van een dergelijke hemisectie en het beoordelen van unilaterale functie. Het doel van deze studie is om stapsgewijze procedures te beschrijven om een rat spinale laterale HX te produceren op het9e thoracale (T9) wervelniveau. We beschrijven dan een gecombineerde gedragsschaal voor HX (CBS-HX) die een eenvoudige en gevoelige beoordeling biedt van asymmetrische neurologische prestaties voor eenzijdige SCI. De CBS-HX, variërend van 0 tot 18, bestaat uit 4 individuele beoordelingen die eenzijdige achterpoot stappen (UHS), koppeling, contact plaatsen, en grid lopen omvatten. Voor CBS-HX worden de ipsilaterale en contralaterale achterpoten afzonderlijk beoordeeld. We ontdekten dat, na een T9 HX, de ipsilaterale achterpoot een verminderde gedragsfunctie vertoonde, terwijl de contralaterale achterpoot een aanzienlijk herstel vertoonde. De CBS-HX effectief gediscrimineerd gedragsfuncties tussen ipsilaterale en contralaterale achterpoten en gedetecteerdtemporeze progressie van het herstel van de ipsilaterale achterpoot. De CBS-HX componenten kunnen afzonderlijk of in combinatie met andere maatregelen worden geanalyseerd wanneer dat nodig is. Hoewel we alleen visuele beschrijvingen hebben verstrekt van de chirurgische ingrepen en gedragsbeoordelingen van een thoracale HX, kan het principe worden toegepast op andere onvolledige SGB’s en op andere niveaus van de schade.
De onvolledige dwarslaesie (SCI) leiden vaak tot ernstige en aanhoudende aantasting van sensorimotorische functies en zijn klinisch het meest voorkomende type SCI1. Het Brown-Séquard syndroom bij de mens wordt veroorzaakt door een laesie aan de helft van het ruggenmerg, wat resulteert in verlamming en verlies van proprioceptie aan dezelfde (of ipsilesional) kant als de schade, en verlies van pijn en temperatuur sensatie aan de tegenovergestelde (of contralesional) kant2,3,4. Spinale laterale hemisectie dierlijke modellen worden in grote lijnen gebruikt om de menselijke Brown-Séquard syndroom na te bootsen en ze zijn gemeld bij ratten5,6,7,8,9, opossums10, en apen7,11,12,13 door verschillende laboratoria op verschillende spinale niveaus. Gedetailleerde gevisualiseerde procedures voor het produceren van een standaard laterale hemisectie zijn echter niet beschreven. Het bieden van stapsgewijze procedures voor een laterale hemisectie moet het model optimaliseren en de vergelijking of replicatie van experimentele resultaten in fundamenteel en translationeel onderzoek vergemakkelijken.
Een eenzijdige SCI produceert asymmetrische en onevenredige gedragstekorten die moeilijk te meten zijn met behulp van conventionele beoordelingen voor symmetrische verwondingen. Een adequate methodologie voor de beoordeling van neurologische stoornissen voor een eenzijdige SCI is een essentieel onderdeel van de ontwikkeling van een eenzijdig SCI-model. Ondanks de centrale rol van een eenzijdige dwarslaesie ontbreken gestandaardiseerde protocollen voor de evaluatie van sensorimotorische tekorten bij dieren met een dergelijke verwonding. De Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) locomotor rating schaal is de meest gebruikte meting van de functie na SCI voor volwassen ratten 14 die een semikwantitatieve beschrijving van de bewegingsvrijheid als geheel levert. Het meet echter niet elke achterpoot onafhankelijk.
In deze studie rapporteren we stapsgewijze procedures om een knaagdier spinale HX te produceren op het9e thoracale (T9) wervelniveau. We introduceren ook een gecombineerde gedragsschaal voor hemisectie (CBS-HX) die eenzijdige achterpootstepping (UHS), koppeling, het plaatsen van contact en rasterwandelbeoordelingen omvat voor het evalueren van neurologische stoornissen en herstel na een eenzijdige SCI. We hopen dat dit model een nuttig model zal zijn voor het onderzoeken van letselmechanismen en therapeutische werkzaamheid voor unilaterale SKU’s.
In deze studie rapporteren we stapsgewijze procedures voor het produceren van een eenvoudige, consistente en reproduceerbare T9 spinale HX bij volwassen ratten die het Brown-Séquard Syndroom bij de mens nabootsen. Verder introduceren we een gecombineerd gedragsscoresysteem voor hemisectie (CBS-HX) dat gevoelig is voor het evalueren van asymmetrische neurologische stoornissen en progressie van herstel, gemeten door een combinatie van eenzijdige achterpootstepping (UHS), koppeling (CPL), het plaatsen van contact, en grid lopen. Hoewel we de schade op T9-niveau aantonen, kan deze procedure op een eenvoudige en niet-veeleisende manier worden toegepast op andere gebieden van het ruggenmerg, waaronder de cervicale en lendenkoorden. We hopen dat dit model, samen met unilaterale gedragsbeoordelingen, nuttig zal zijn voor het onderzoeken van schademechanismen en therapeutische werkzaamheid voor dergelijke soorten SCI.
Aangezien het laterale HX-model alleen de ipsilaterale helft van het snoer aangeeft, is de contralaterale zijde van het snoer grotendeels bewaard gebleven en kan het als interne controle worden gebruikt. Veel dalende en opgaande paden worden eenzijdig geprojecteerd en een zijdelingse hemisectie veroorzaakt in veel omstandigheden schade aan een axonale darmkanaal aan de ene kant en behoudt hetzelfde traktaat aan de andere kant, waardoor een vergelijking van reorganisatie en functionele gevolgen van deze traktaten bij hetzelfde dier. Bovendien kan het produceren van een meer gelokaliseerde laesie het mogelijk maken om specifieke trajecten te targeten. Bijvoorbeeld, een ventrale en ventrolaterale laesie kan invloed hebben op reticulospinale en vestibulospinale paden. Een dorsale of dorsolaterale laesie kan de corticospinale en rubrospinale paden beïnvloeden. De hemisectie of gedeeltelijke schade model kan ook worden gebruikt om de anatomie en functie van andere trajecten te bestuderen, zoals de propriospinale, noradrenergic of serotonergic trajecten. Zo kan het hemisectiemodel op unieke wijze worden gebruikt om compensatie te bestuderen door zintuiglijke affiniteiten, door dalende paden en door intrinsieke spinale circuits. Dit model is ook geschikt voor het onderzoeken van mechanismen van motorisch herstel na HX.
De laterale HX leidt tot duidelijke gedragsstoornissen, die kunnen worden beoordeeld onder motorische taken (bijvoorbeeld Treadscan of Loopband) paradigma voor de geautomatiseerde ganganalyse 19. Ook de geleidbaarheid van de axonale traktaten aan de contralaterale kant van de laesie kan worden gemeten met behulp van elektrofysiologische opnames, en deze evaluatie biedt de mogelijkheid om een functionele reorganisatie na verschillende behandelingen vast te stellen. Bovendien, eenzijdige injecties van de anatomische tracers in neuronen van een bepaalde route mogelijk visualisatie van anterogradely gelabeld midline kruising vezels en hun verbinding met retrograde ly gelabeldneuronen20,21,22,23,24,25.
Hoewel een typische spinale HX-operatie minder dan 20 minuten in beslag neemt, vereist het enige oefening om een nauwkeurige en consistente HX te bereiken. Ten eerste is het belangrijk dat het HX-niveau van dier tot dier consistent is. Daarom is het van cruciaal belang dat het juiste wervelsegment voor laminectomie wordt geïdentificeerd. Ten tweede, zorg ervoor dat de HX is voltooid. Om een complete HX te maken, kan men een 30-gauge naald verticaal ingebracht door de middellijn gebruiken om het snijden met behulp van microscissors te begeleiden. Het inbrengen van de naald voorkomt ook schade aan de achterste spinale vaten of koord over laesies. De tweede functie van de 30-gauge naald is dat het kan dienen als een mes om de snede te traceren om ervoor te zorgen dat er geen dubbelzinnigheid van de laesie. Ten derde kan het plaatsen van gelatine op de laesieplaats de lekkage van hersenvocht minimaliseren en het cement bovenop de gelatine plaatsen en het overbruggen van de wervellamina de stabiliteit van de wervelkolom op de laesieplaats versterken en wondgenezing vergemakkelijken. Om te voorkomen dat het signaal interferentie met de toepassing van elektrofysiologische opnamen, spieren, fascia, en de huid moet worden gehecht in lagen met 4-0 zijden draad. Ten slotte moet alles in het werk worden gesteld om de schade aan het contralaterale ruggenmerg te minimaliseren. Er moet een histologische controle worden ingesteld om een volledige zijdelingse hemisectie aan de ene kant en het behoud van de andere helft van het koord aan de andere kant te bevestigen (zoals afgebeeld in figuur 6E).
Om de bewegingsvrijheid na SCI te verbeteren, hebben eerdere studies gebruik gemaakt van een breed scala aan strategieën, waaronder celtransplantatie, axonregeneratie 8,18,26,27en op activiteiten gebaseerde revalidatie 28,29,30. Ondertussen zijn verschillende gedragstests vastgesteld voor functionele beoordeling en om te screenen op de beste behandelingen na SCI. De BBB locomotorische ratingschaal is ontworpen voor motorische beoordeling van spinale symmetrische verwondingen, zoals een middenlijnkneuzing of transsectieletsels die van invloed zijn op bilaterale achterpoten 14,31. Bepaalde parameters van BBB, zoals coördinatie en teenklaring, worden geregistreerd door beide achterpoten te observeren. Als een achterpoot intact is en de andere vertoont tekorten zoals gezien in asymmetrische verwondingen, dan is de intacte achterpoot zal verwarren de score van de aangetaste achterpoot. Aangezien de BBB-score niet geschikt is voor de ene achterpoot score van de andere na de eenzijdige blessure, is het niet ideaal voor de beoordeling van eenzijdige dwarslaesie. Echter, als gezamenlijke beweging en gewichtssteun aan elke kant afzonderlijk worden beoordeeld en niet worden berekend als onderdeel van de BBB, dan zal de intacte achterpoot (vergelijkbaar met een schijncontrole) de score van de aangetaste achterpoot niet verwarren. Bovendien zal de intacte kant niet bias de totale score van het dier, omdat de intacte achterpoot heeft geen dramatische tekorten in gezamenlijke beweging, gewichtsondersteuning, of intensivering.
De gecombineerde gedragsscore voor hemisectie is ontworpen om een gevoelige en gemakkelijk uitgevoerde evaluatie van gedragsherstel in het rattenmodel van laterale hemisectie te zijn. Het kan worden gebruikt om gedrag van zowel vroege als late fasen van herstel te beoordelen. De vroege fase is binnen 7-10 dagen na de blessure. In de eerste 3-5 dagen na HX nam de activiteit van de ipsilaterale achterpoot gestaag toe en moet vaker worden beoordeeld om spontane of door de behandeling gemedieerde herstelbewegingen van de achterpoot op te nemen. Door 5-7 dagen na-HX, ratten begon te vegen achterbeen bewegingen te maken zonder gewichtssteun. Door 7-10 dagen, ratten meestal begon te staan en stap. Tijdens deze fase moet aandacht worden besteed aan het stappenpatroon. In de late fase (14-28 dagen) was de activiteit van de ipsilaterale achterpoot stabiel en dicht bij normaal.
Er moet ook veel aandacht worden besteed aan de capaciteit van de koppeling (CPL). De CPL-test (loopkoppeling) kan worden uitgevoerd met een video (bijvoorbeeld Treadscan/Catwalk) of een filmvideo tijdens een open-veldtest. De tweede optie biedt flexibiliteit als de onderzoekers geen toegang hebben tot het loopanalysesysteem. Voor beide video-opnamesessies is minimaal twee opeenvolgende touchdowns voor elke voet vereist voor deze test. Voor de analyse zijn er drie koppelingsparameters: homologe, homolaterale en diagonale koppeling (stap 6.2). Elke koppeling omvat een referentievoet en de gegeven voet. Neem homologe koppeling (linksvoor rechts, of achterlinks-achter rechts) bijvoorbeeld, het is de eerste touchdown tijd van de gegeven voet gedeeld door een hele pas tijd van de referentie voet. Aangezien de linker- en rechtervoet uit fase moeten zijn, moet de perfecte koppeling 0,5 zijn. Dit is hetzelfde geval in homolaterale koppeling (links voor-links achter, of rechts voor-rechts achter). Echter, voor diagonale koppeling (links voor-rechts achter, of rechts voor-links achter), moet de perfecte koppeling 0 of 1, omdat de twee voeten moeten worden in fase. In stap 6.4 wijzen we voor elke CPL een score toe van 0 tot 2. In details, een score 0 zal vertegenwoordigen de gegeven voet niet in staat is om te bewegen om een touchdown te voltooien, dus geen CPL; een score 1 vertegenwoordigt een onregelmatige of onhandige CPL sinds de gegeven voet een touchdown voltooit, maar niet in de perfecte koppeling; een score 2 betekent een perfecte koppeling van 0,5. De drie koppelingsparameterconcepten zijn goed beschreven in de vorige publicaties32,33. CPL kan worden gecombineerd met de beoordelingen van contactplaatsing en grid walking. Individuele componenten van het gecombineerde gedragsscoresysteem zullen min of meer effectief zijn in verschillende rattenmodellen van SCI. Voor CPL werden de tekorten duidelijk zichtbaar in de mate van afwisseling en de volledigheid van de sequentie. Proprioceptive achterpoot plaatsen van tekorten kan duidelijk worden onthuld na eenzijdige HX. In onze studie, alle ratten toonde ipsilesional achterpoot plaatsen van tekorten, terwijl de contralaterale achterpoot plaatsen toonde geen tekorten. De grid walking test moet worden overwogen wanneer contact plaatsen, waarbij het corticospinale kanaal, begint te herstellen. Om eventuele vermoeidheidsproblemen uit te sluiten, kan de volgorde van gedragstests bij elke test worden gerandomiseerd.
Tot slot rapporteren we stapsgewijze procedures om een reproduceerbaar in vivo rattenmodel te maken van de T9 spinale HX die het Brown-Séquard Syndroom bij de mens nabootst. Het gecombineerde gedragsscoresysteem voor hemisectie biedt een meer discriminerende maat voor individuele gedragsresultaten achterpoten voor de evaluatie van letselmechanismen en behandelingen na een eenzijdige SCI. Hoewel we alleen een visuele beschrijving geven van de chirurgische ingrepen en gedragsbeoordelingen van een thoracale HX, kunnen hier beschreven methoden worden toegepast op andere onvolledige SGB’s op verschillende letselniveaus.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken de heer Jeffrey Recchia-Rife voor zijn uitstekende technische bijstand. Dit werk werd mede ondersteund door de Stichting van directeur van het Algemeen Ziekenhuis van Jinan Militaire Regio Chines PLA 2016ZD03 en 2014ZX01 (XJL en TBZ). Onderzoek in het Xu-laboratorium wordt ondersteund door NIH 1R01 100531, 1R01 NS103481 en Merit Review Award I002356, I01 BX003705, I01 RX002687 van het Amerikaanse Ministerie van Veteranenzaken.
Baby-Mixter Hemostat | FST | 13013-14 | Can be any brand of choice |
Elevated plastic coated wire mesh grid | Any | 36×38 cm with 3 cm2 openings | |
Gel foam | Moore Medical | 2928 | Can be any brand of choice. |
Grip cement kit, powder and solvent | Dentsply | 675570 | Can be any brand of choice. |
Microbead Sterilizer | FST | NA | Can be any brand of choice |
Pearson Rongeur | FST | 16015-17 | Can be any brand of choice. |
Retractors | Jinxie surgical tools | 6810 | Can be any brand of choice |
Scalpel Handle | FST | 10003-12 | Can be any brand of choice |
Simplex-P cement | Stryker | Can be any brand of choice. | |
TreadScan automatic gait analysis | CleverSys Inc | NA | Can be any brand of choice |