Qui descriviamo le procedure chirurgiche per produrre un’emisezione laterale del midollo spinale affidabile (HX) al 9esimo livello toracico nei ratti adulti e valutazioni neurocomportamentali progettate per rilevare deficit asimmetrici dopo tale lesione unilaterale.
Lesione incompleta del midollo spinale (SCI) spesso porta a compromissione delle funzioni sensomotorie ed è clinicamente il tipo più frequente di SCI. La sindrome di Human Brown-Séquard è un tipo comune di SCI incompleta causata da una lesione a una metà del midollo spinale che si traduce in paralisi e perdita di propriocezione sullo stesso lato (o ipsilesionale) della lesione e perdita di dolore e sensazione di temperatura sul lato opposto (o controscienziale). Metodologie adeguate per la produzione di un’emisezione laterale del midollo spinale (HX) e la valutazione dei disturbi neurologici sono essenziali per stabilire un modello animale affidabile della sindrome di Brown-Séquard. Sebbene il modello di emisezione laterale svolga un ruolo fondamentale nella ricerca di base e traslazionale, mancano protocolli standardizzati per la creazione di tale emisezione e la valutazione della funzione unilateralizzata. L’obiettivo di questo studio è descrivere le procedure passo-passo per produrre un HX spinale al ratto allivello vertebrale del torace (T9). Descriviamo quindi una scala di comportamento combinata per HX (CBS-HX) che fornisce una valutazione semplice e sensibile delle prestazioni neurologiche asimmetriche per sCI unilaterale. Il CBS-HX, che va da 0 a 18, è composto da 4 valutazioni individuali che includono il stepping unilaterale dell’arto posteriore (UHS), l’accoppiamento, il posizionamento dei contatti e la camminata della griglia. Per CBS-HX, gli arti posteriori ipsilaterali e contralaterali vengono valutati separatamente. Abbiamo scoperto che, dopo un HX T9, l’arto posteriore ipsilaterale mostrava una funzione di comportamento compromessa, mentre l’arto posteriore contralaterale mostrava un recupero sostanziale. Il CBS-HX discriminava efficacemente le funzioni comportamentali tra gli arti posteriori ipsilaterali e contralaterali e rilevava la progressione temporale del recupero dell’arto posteriore ipsilaterale. I componenti CBS-HX possono essere analizzati separatamente o in combinazione con altre misure quando necessario. Anche se abbiamo fornito solo descrizioni visive delle procedure chirurgiche e valutazioni comportamentali di un HX toracico, il principio può essere applicato ad altre SCI incomplete e ad altri livelli della lesione.
Le lesioni incomplete del midollo spinale (SCI) spesso portano a gravi e persistenti menomazioni delle funzioni sensomotorie e sono clinicamente il tipo più frequente di SCI1. La sindrome di Brown-Séquard negli esseri umani è causata da una lesione a metà del midollo spinale che si traduce in paralisi e perdita di propriocezione sullo stesso lato (o ipsilesionale) come la lesione, e la perdita di dolore e sensazione di temperatura sul lato opposto (o contrale)2,3,4. I modelli animali di emisezione laterale spinale sono ampiamente utilizzati per imitare la sindrome umana di Brown-Séquard e sono stati segnalati nei ratti5,6,77,8,9, opossum10e scimmie7,11,12,13 da vari laboratori a vari livelli spinali. Tuttavia, non sono state descritte procedure dettagliate visualizzate per la produzione di un’emisezione laterale standard. La fornitura di procedure dettagliate per un’emisezione laterale dovrebbe ottimizzare il modello e facilitare il confronto o la replica dei risultati sperimentali nella ricerca di base e traslazionale.
Una SCI unilaterale produce deficit di comportamento asimmetrici e sproporzionati che sono difficili da misurare utilizzando valutazioni convenzionali per lesioni simmetriche. Una metodologia adeguata per valutare le menomazioni neurologiche per una SCI unilaterale è una componente essenziale per lo sviluppo di un modello SCI unilaterale. Nonostante il ruolo fondamentale di una lesione spinale unilaterale, mancano protocolli standardizzati per valutare i deficit sensomotori negli animali con tale lesione. La scala di valutazione locomotor Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) è stata la misurazione più frequentemente utilizzata della funzione dopo la SCI per i ratti adulti 14 che produce una descrizione semiquantitativa della locomozione nel suo complesso. Tuttavia, non misura ogni limb posteriore in modo indipendente.
In questo studio, riportiamo procedure passo-passo per produrre un HX spinale del roditore al livello vertebrale del 9thoracico (T9). Introduciamo anche una scala di comportamento combinata per l’emisezione (CBS-HX) che include il stepping unilaterale degli arti posteriori (UHS), l’accoppiamento, il contatto e le valutazioni della griglia per valutare i danni neurologici e il recupero dopo una SCI unilaterale. Ci auguriamo che questo modello sia un modello utile per esaminare i meccanismi di lesione e gli effetti terapeutici per le SIS unilaterali.
In questo studio, riportiamo procedure passo-passo per produrre un HX spinale T9 semplice, coerente e riproducibile nei ratti adulti che imita la sindrome di Brown-Séquard negli esseri umani. Introduciamo inoltre un sistema combinato di punteggio comportamentale per l’emisezione (CBS-HX) che è sensibile alla valutazione di una compromissione neurologica asimmetrica e alla progressione del recupero, misurata da una combinazione di stepping unilaterali dell’arto posteriore (UHS), accoppiamento (CPL), contatto e la camminata in griglia. Anche se dimostriamo la lesione a livello di T9, questa procedura può essere applicata ad altre regioni del midollo spinale, comprese le corde cervicali e lombari in modo semplice e poco impegnativo. Ci auguriamo che questo modello, insieme a valutazioni comportamentali unilaterali, sia utile per esaminare i meccanismi di lesione e gli effetti terapeutici per tali tipi di SCI.
Poiché il modello HX laterale lega solo la metà ipsilaterale del cavo, il lato contralaterale del cavo è in gran parte conservato e può essere utilizzato come controllo interno. Molte vie discendenti e ascendenti sono proiettate unilateralmente e un’emisezione laterale in molte circostanze produce danni a un tratto assonale da un lato e conserva lo stesso tratto sul lato opposto, consentendo il confronto della riorganizzazione e conseguenze funzionali di questi tratti nello stesso animale. Inoltre, la produzione di una lesione più localizzata può consentire il targeting di percorsi specifici. Ad esempio, una lesione ventrale e ventrolaterale può influenzare le vie reticulospinale e vestibulospinali. Una lesione dorsale o dorsolaterale può influenzare le vie corticospinali e rubrospinali. L’emisezione o il modello di lesione parziale può anche essere utilizzato per studiare l’anatomia e la funzione di altri percorsi, come le vie propriospinali, noradrenergiche o sierotonergiche. Così, il modello di emisezione può essere impiegato in modo univoco per studiare la compensazione da afferenti sensoriali, da percorsi discendenti, e da circuiti spinali intrinseci. Questo modello è adatto anche per studiare i meccanismi di recupero locomotore dopo HX.
L’HX laterale porta a evidenti menomazioni comportamentali, che sono valutabili nell’ambito di compiti motori (ad esempio, Treadscan o Treadmill) paradigma per l’analisi automatica dell’andatura 19. Inoltre, la conduttività dei tratti assonali sul lato contralaterale della lesione potrebbe essere misurata utilizzando registrazioni elettrofisiologiche, e questa valutazione offre la possibilità di stabilire una riorganizzazione funzionale a seguito di vari trattamenti. Inoltre, iniezioni unilaterali dei traccianti anatomici nei neuroni di un particolare percorso permettono la visualizzazione di fibre di attraversamento della linea mediana etichettate per viaroce e la loro connessione con neuroni retrogradelmente etichettati20,21,22,23,24,25.25
Anche se una tipica chirurgia HX spinale richiede meno di 20 minuti per finire, richiede una certa pratica per ottenere un HX preciso e coerente. In primo luogo, è importante che il livello di HX spinale sia coerente da animale a animale. Pertanto, è fondamentale identificare il segmento vertebrale appropriato per la laminectomia. In secondo luogo, assicurarsi che l’HX sia completo. Per fare un HX completo, si può usare un ago di 30 calibro inserito verticalmente attraverso la linea mediana per guidare il taglio utilizzando microscisors. L’inserimento dell’ago evita anche danni ai vasi spinali o al midollo posteriori rispetto alla consione. La seconda funzione dell’ago calibro 30 è che può servire come un coltello per tracciare il taglio per assicurarsi che non vi sia ambiguità della lesione. In terzo luogo, l’inserimento della gelatina sul sito di lesione può ridurre al minimo la perdita del liquido cerebrospinale e posizionare il cemento sopra la gelatina e colmare la lamina vertebrale può rafforzare la stabilità delle vertebre spinali nel sito di lesione e facilitare la guarigione della ferita. Per evitare l’interferenza del segnale con l’applicazione di registrazioni elettrofisiologiche, muscoli, fascia e pelle devono essere suturati in strati con filo di seta 4-0. Infine, ogni sforzo dovrebbe essere fatto per ridurre al minimo il danno al midollo spinale contralaterale. La verifica istologica deve essere stabilita per confermare una completa emisezione laterale su un lato e la conservazione dell’altra metà del cavo sull’altro lato (come mostrato nella figura 6E).
Per migliorare la locomozione dopo SCI, studi precedenti hanno utilizzato una vasta gamma di strategie tra cui il trapianto di cellule, la rigenerazione degli assoni 8,18,26,27, e la riabilitazione basata sull’attività 28,29,30. Nel frattempo, sono stati stabiliti diversi test comportamentali per la valutazione funzionale e per lo screening per i migliori trattamenti dopo SCI. La scala di valutazione locomotore BBB è stata progettata per la valutazione locomotoria di lesioni simmetriche spinali come una contusione mediana o lesioni da transezione che colpiscono le zampe posteriori bilaterali 14,31. Alcuni parametri della BBB, come il coordinamento e l’altezza delle punta, sono registrati osservando entrambi gli arti posteriori. Se un limb posteriore è intatto e l’altro mostra deficit come visto in lesioni asimmetriche, l’arto posteriore intatto confonderà il punteggio dell’arto posteriore interessato. Poiché il punteggio BBB non ospita un punteggio dell’arto posteriore dall’altro dopo la lesione unilaterale, non è ideale per valutare le lesioni unilaterali del midollo spinale. Tuttavia, se il movimento articolare e il supporto del peso su ciascun lato sono valutati separatamente e non sono calcolati come parte della BBB, l’arto posteriore intatto (simile a un controllo fittizio) non confonderà il punteggio dell’arto posteriore interessato. Inoltre, il lato intatto non smista il punteggio complessivo dell’animale, perché l’arto posteriore intatto non ha deficit drammatici nel movimento articolare, nel supporto del peso o nel passo.
Il punteggio di comportamento combinato per l’emisezione è progettato per essere una valutazione sensibile e facilmente eseguito del recupero comportamentale nel modello di ratto dell’emisezione laterale. Può essere utilizzato per valutare i comportamenti delle fasi iniziali e tardive del ripristino. La fase iniziale è entro 7-10 giorni postinfortuni. Nei primi 3-5 giorni dopo l’HX, l’attività degli arti posteriori ipsilaterali è aumentata costantemente e deve essere valutata più frequentemente per registrare recuperi di movimento degli arti posteriori spontanei o mediati dal trattamento. Entro 5-7 giorni dopo l’HX, i ratti hanno iniziato a fare movimenti spazzare i movimenti dell’arto posteriore senza il supporto del peso. Da 7-10 giorni, i ratti in genere cominciarono a stare in piedi e a fare passo. Durante questa fase, dovrebbe essere prestata attenzione al modello di stepping. Nella fase avanzata (14-28 giorni), l’attività dell’arto posteriore ipsilaterale era stabile e vicina alla normalità.
Occorre inoltre prestare molta attenzione alla capacità di accoppiamento (CPL). Il test CPL (gait coupling) può essere eseguito sia con un video (ad esempio, Treadscan/Catwalk) sia con un video di ripresa durante un test in campo aperto. La seconda opzione offre flessibilità se i ricercatori non hanno accesso al sistema di analisi dell’andatura. Per entrambe le sessioni di registrazione video, per questo test è necessario almeno due touchdown consecutivi per ogni piede. Per l’analisi, ci sono tre parametri di accoppiamento: omologa, omolaterale e diagonale di accoppiamento (passaggio 6.2). Ogni accoppiamento comporta un piede di riferimento e il piede dato. Prendiamo l’accoppiamento omologato (anteriore-sinistro-anteriore destro, o posteriore sinistro-destra) per esempio, è il primo tempo di touchdown del piede dato diviso da un tempo intero del piede di riferimento. Poiché il piede sinistro e destro dovrebbe essere fuori fase, l’accoppiamento perfetto dovrebbe essere 0,5. Questo è lo stesso caso nell’accoppiamento omolaterale (posteriore anteriore sinistro sinistro o posteriore destro-destro). Tuttavia, per l’accoppiamento diagonale (posteriore anteriore-destro sinistro o anteriore sinistro destro posteriore), l’accoppiamento perfetto dovrebbe essere 0 o 1 poiché i due piedi dovrebbero essere in fase. Nel passaggio 6.4 assegniamo un punteggio per ogni CPL da 0 a 2. Nei dettagli, un punteggio 0 rappresenta il piede dato non è in grado di muoversi per finire un touchdown, quindi nessun CPL; un punteggio 1 rappresenta qualsiasi CPL irregolare o goffo dal momento che il piede dato termina un touchdown, ma non nell’accoppiamento perfetto; un punteggio 2 significa un accoppiamento perfetto di 0,5. I tre concetti relativi ai parametri di accoppiamento sono ben descritti nelle pubblicazioni precedenti32,33. CPL può essere combinato con le valutazioni del posizionamento dei contatti e della camminata nella griglia. I singoli componenti del sistema combinato di punteggio del comportamento saranno più o meno efficaci nei diversi modelli di ratti di SCI. Per la CPL, i disavanzi sono diventati ovviamente visibili nel tasso di alternanza e nella completezza della sequenza. I deficit di posizionamento degli arti posteriori propriocettivi potrebbero essere chiaramente rivelati dopo HX unilaterale. Nel nostro studio, tutti i ratti hanno mostrato deficit di posizionamento dell’arto posteriore ipsilesionale mentre il posizionamento degli arti posteriori contralaterale non mostrava deficit. Il test di camminata della griglia deve essere considerato quando il posizionamento di contatto, che coinvolge il tratto corticospinale, inizia a recuperare. Per escludere eventuali problemi di fatica, la sequenza dei test comportamentali potrebbe essere randomizzata ad ogni test.
In conclusione, riportiamo procedure passo-passo per creare un modello riproducibile di ratti in vivo dell’HX spinale T9 che imita la sindrome Brown-Séquard negli esseri umani. Il sistema combinato di punteggio del comportamento per l’emisezione offre una misura più discriminativa dei risultati comportamentali individuali degli arti posteriori per valutare i meccanismi e i trattamenti di lesione dopo una SCI unilaterale. Anche se forniamo solo una descrizione visiva delle procedure chirurgiche e delle valutazioni comportamentali di un HX toracico, i metodi qui descritti possono essere applicati ad altre SCI incomplete a diversi livelli di lesioni.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo il signor Jeffrey Recchia-Rife per la sua eccellente assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla Fondazione di Direttore dell’Ospedale Generale della Regione Militare Jinan di Chines PLA 2016-D03 e 2014-X01 (XJL e TB) . La ricerca nel laboratorio Xu è supportata da NIH 1R01 100531, 1R01 NS103481, e meritetto Review Award I01 BX002356, I01 BX003705, I01 RX002687 dal Dipartimento degli Affari Veterani degli Stati Uniti.
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