Her beskriver vi kirurgiske prosedyrer for å produsere en pålitelig ryggmargslateral hemiseksjon (HX) på 9th thoraxnivå hos voksne rotter og nevroatferdsvurderinger designet for å oppdage asymmetriske underskudd etter en slik ensidig skade.
Ufullstendig ryggmargsskade (SCI) fører ofte til svekkelse av sensoriske funksjoner og er klinisk den hyppigste typen SCI. HumanT Brun-Séquard syndrom er en vanlig type ufullstendig SCI forårsaket av en lesjon til den ene halvdelen av ryggmargen som resulterer i lammelse og tap av proprioception på samme (eller ipsilesional) side som skaden, og tap av smerte og temperaturfølelse på motsatt (eller kontralesjons) side. Tilstrekkelige metoder for å produsere en ryggmargslateral hemiseksjon (HX) og vurdere nevrologiske funksjonsnedsettelser er avgjørende for å etablere en pålitelig dyremodell av Brown-Séquard syndrom. Selv om lateral hemisection modell spiller en avgjørende rolle i grunnleggende og translasjonell forskning, standardiserte protokoller for å skape en slik hemisection og vurdere ensidig funksjon mangler. Målet med denne studien er å beskrive trinnvise prosedyrer for å produsere en rotte spinal lateral HX på 9th thorax (T9) vertebral nivå. Vi beskriver da en kombinert atferdsskala for HX (CBS-HX) som gir en enkel og sensitiv vurdering av asymmetrisk nevrologisk ytelse for ensidig SCI. CBS-HX, fra 0 til 18, består av 4 individuelle vurderinger som inkluderer ensidig bakbenstepping (UHS), kobling, kontaktplassering og rutenettgange. For CBS-HX vurderes de ipsilaterale og kontralaterale bakbenene separat. Vi fant at etter en T9 HX viste det ipsilaterale bakbenet nedsatt atferdsfunksjon, mens det kontralaterale bakbenet viste betydelig gjenoppretting. CBS-HX effektivt diskriminerte atferdsfunksjoner mellom ipsilaterale og kontralaterale bakben og oppdaget temporal progresjon av utvinning av det ipsilaterale bakbenet. CBS-HX-komponentene kan analyseres separat eller i kombinasjon med andre tiltak ved behov. Selv om vi bare ga visuelle beskrivelser av kirurgiske prosedyrer og atferdsvurderinger av en thorax HX, kan prinsippet brukes på andre ufullstendige SCIer og på andre nivåer av skaden.
Ufullstendige ryggmargsskader (SCI) fører ofte til alvorlige og vedvarende svekkelser av sensoriske funksjoner og er klinisk den hyppigste typen SCI1. Brown-Séquard syndrom hos mennesker er forårsaket av en lesjon til halvparten av ryggmargen som resulterer i lammelse og tap av proprioception på samme (eller ipsilesional) side som skaden, og tap av smerte og temperatur følelse på motsatt (eller contralesional) side2,3,4. Spinal lateral hemisection dyr modeller brukes bredt for å etterligne menneskelig Brown-Séquard syndrom og de har blitt rapportert i rotter5,6,7,8,9, opossums10, og aper7,11,12,13 av ulike laboratorier på ulike spinal nivåer. Detaljerte visualiserte prosedyrer for produksjon av en standard lateral hemiseksjon er imidlertid ikke beskrevet. Å gi trinnvise prosedyrer for en lateral hemiseksjon bør optimalisere modellen og legge til rette for sammenligning eller replikering av eksperimentelle resultater i grunnleggende og translasjonell forskning.
En ensidig SCI produserer asymmetriske og uforholdsmessige atferdsunderskudd som er vanskelige å måle ved hjelp av konvensjonelle vurderinger for symmetriske skader. En tilstrekkelig metodikk for å vurdere nevrologiske funksjonsnedsettelser for en ensidig SCI er en viktig del av utviklingen av en ensidig SCI-modell. Til tross for den avgjørende rollen som en ensidig ryggskade mangler standardiserte protokoller for evaluering av sensoriske underskudd hos dyr med en slik skade. Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) lokomotor rating skala har vært den mest brukte måling av funksjon etter SCI for voksne rotter 14 som gir en semikvantitativ beskrivelse av bevegelse som helhet. Det måler imidlertid ikke hvert bakben uavhengig.
I denne studien rapporterer vi trinnvise prosedyrer for å produsere en gnagerspinal HX på 9th thorax (T9) vertebral nivå. Vi introduserer også en kombinert atferdsskala for hemisection (CBS-HX) som inkluderer ensidig bakbensstepping (UHS), kobling, plassering av kontakt og grid walking vurderinger for evaluering av nevrologiske funksjonsnedsettelser og gjenoppretting etter en ensidig SCI. Vi håper denne modellen vil være en nyttig modell for å undersøke skademekanismer og terapeutiske efficacies for ensidige SCIer.
I denne studien rapporterer vi trinnvise prosedyrer for å produsere en enkel, konsekvent og reproduserbar T9 spinal HX hos voksne rotter som etterligner Brown-Séquard syndromet hos mennesker. Vi introduserer videre et kombinert atferdsskårsystem for hemisection (CBS-HX) som er følsomfor å evaluere asymmetrisk nevrologisk svekkelse og progresjon av utvinning, målt ved en kombinasjon av ensidig bakbensstepping (UHS), kobling (CPL), å plassere kontakt, og rutenett gange. Selv om vi demonstrerer skaden på T9-nivå, kan denne prosedyren brukes på andre områder av ryggmargen, inkludert livmorhals- og lumballedninger på en enkel og lite krevende måte. Vi håper denne modellen, sammen med ensidige atferdsvurderinger, vil være nyttig for å undersøke skademekanismer og terapeutiske efficacies for slike typer SCI.
Siden den laterale HX-modellen bare lesjoner den ipsilaterale halvdelen av ledningen, er den kontralaterale siden av ledningen i stor grad bevart og kan brukes som en intern kontroll. Mange synkende og stigende veier projiseres ensidig, og en lateral hemiseksjon gir i mange tilfeller skade på en aksonalkanal på den ene siden og bevarer den samme kanalen på motsatt side, slik at sammenligning av omorganisering og funksjonelle konsekvenser av disse kanalene i samme dyr. I tillegg kan det å produsere en mer lokalisert lesjon tillate målretting av spesifikke veier. For eksempel kan en ventral og ventrolateral lesjon påvirke reticulospinal og vestibulospinalveier. En ryggeller dorsolateral lesjon kan påvirke kortikospinal- og rubrospinalbanene. Hemiseksjonen eller delvis skademodell kan også brukes til å studere anatomien og funksjonen til andre veier, for eksempel propriospinal, noradrenerge eller serotonerge veier. Dermed kan hemisection modellen være unikt ansatt for å studere kompensasjon av sensoriske afferents, ved synkende veier, og ved iboende spinal kretser. Denne modellen er også egnet for å undersøke mekanismer for lokomotor utvinning etter HX.
Den laterale HX fører til åpenbare atferdshemminger, som kan vurderes under motoriske oppgaver (f.eks. tredeskan eller tredemølle) paradigme for den automatiserte ganganalyse 19. Også konduktiviteten av aksonalkanalene på den kontralaterale siden til lesjonen kan måles ved hjelp av elektrofysiologiske opptak, og denne evalueringen gir mulighet til å etablere en funksjonell omorganisering etter ulike behandlinger. Videre ensidige injeksjoner av anatomiske tracers i nevroner av en bestemt vei tillate visualisering av anterogradly merket midtlinje krysset fibre og deres forbindelse med retrogradly merkede nevroner20,21,22,23,24,25.
Selv om en typisk spinal HX kirurgi tar mindre enn 20 minutter å fullføre, det krever litt praksis for å oppnå en presis og konsekvent HX. For det første er det viktig at spinal HX-nivået er konsistent fra dyr til dyr. Derfor er det avgjørende at riktig vertebral segment for laminektomi er identifisert. For det andre må du kontrollere at HX er fullført. For å lage en komplett HX, kan man bruke en 30-gauge nål satt vertikalt gjennom midtlinjen for å veilede skjæringen ved hjelp av mikrosaks. Nålen innsetting unngår også skade på bakre ryggbeholdere eller ledning over lesjon. Den andre funksjonen til 30-gauge nålen er at den kan tjene som en kniv for å spore kuttet for å sikre at det ikke er tvetydighet av lesjonen. For det tredje kan det å plassere gelatin på lesjonsstedet minimere cerebrospinalvæskelekkasjen, og plassere sementen på toppen av gelatinen og bygge bro over vertebrallamina kan styrke stabiliteten av spinalryggvirvler på lesjonsstedet og lette sårheling. For å unngå signalforstyrrelser med bruk av elektrofysiologiske opptak, bør muskler, fascia og hud sutureres i lag med 4-0 silketråd. Til slutt bør alle anstrengelser gjøres for å minimere skaden på den kontralaterale ryggmargen. Histologisk verifisering bør etableres for å bekrefte en fullstendig lateral hemiseksjon på den ene siden og bevaring av den andre halvdelen av ledningen på den andre siden (som vist i figur 6E).
For å forbedre bevegelse etter SCI, tidligere studier har benyttet et bredt spekter av strategier, inkludert celletransplantasjon, axon regenerering 8,18,26,27, og aktivitetsbasert rehabilitering 28,29,30. I mellomtiden er det etablert flere atferdstester for funksjonell vurdering og for å screene for de beste behandlingene etter SCI. BBB lokomotor rating skala ble designet for lokomotor vurdering av spinal symmetriske skader som en midline kontusjon eller transection skader som påvirker bilaterale bakben 14,31. Visse parametere av BBB, som koordinering og tåklaring, registreres ved å observere begge bakbenene. Hvis den ene bakbenet er intakt og den andre viser underskudd sett i asymmetriske skader, vil det intakte bakbenet forvirre poengsummen til det berørte bakbenet. Siden BBB-scoringen ikke rommer den ene bakbensskåren fra den andre etter den ensidige skaden, er det ikke ideelt for å vurdere ensidige ryggmargsskader. Men hvis felles bevegelse og vektstøtte på hver side vurderes separat og ikke beregnes som en del av BBB, vil det intakte bakbenet (lik en bløffkontroll) ikke forvirre poengsummen til det berørte bakbenet. Videre vil den intakte siden ikke forutse dyrets samlede poengsum, fordi det intakte bakbenet ikke har dramatiske underskudd i felles bevegelse, vektstøtte eller stepping.
Den kombinerte atferdsscoren for hemisection er utformet for å være en følsom og lett utført evaluering av atferdsgjenoppretting i rottemodellen for lateral hemiseksjon. Den kan brukes til å vurdere atferd av både tidlige og sene faser av utvinning. Den tidlige fasen er innen 7-10 dager etterskade. I de første 3-5 dagene etter HX økte den ipsilaterale bakbensaktiviteten jevnt og bør vurderes oftere for å registrere spontane eller behandlingsmedierte bakbensbevegelsesgjenopprettinger. Ved 5-7 dager etter HX begynte rotter å gjøre feiende bakbensbevegelser uten vektstøtte. Ved 7-10 dager begynte rotter vanligvis å stå og gå. I løpet av denne fasen bør det utbetales oppmerksomhet til steppingmønsteret. I sen fase (14-28 dager) var den ipsilaterale bakbensaktiviteten stabil og nær normal.
Det bør også være nøye hensyn til koblingskapasitet (CPL). CPL-testen (gangtegning) kan utføres enten med en video (f.eks. Treadscan/Catwalk) eller en filmvideo under en åpen felttest. Det andre alternativet gir fleksibilitet hvis forskerne ikke har tilgang til ganganalysesystemet. For begge videoopptaksøktene er det nødvendig med minst to touchdowns på rad for hver fot for denne testen. For analysen er det tre koblingsparametere: homolog, homolateral og diagonal kobling (trinn 6.2). Hver kobling innebærer en referansefot og den gitte foten. Ta homolog kobling (foran venstre foran høyre, eller bak venstre-bak høyre) for eksempel, det er den første touchdown tiden på den gitte foten delt med en hel skritttid av referansefoten. Siden venstre og høyre fot skal være ute av fase, bør den perfekte koblingen være 0,5. Dette er det samme tilfellet i homolateral kobling (venstre foran-venstre bak, eller høyre foran høyre bak). Men for diagonalkobling (venstre foran høyre bak, eller høyre forside-venstre bak), bør den perfekte koblingen være 0 eller 1 siden de to føttene skal være i fase. I trinn 6.4 tilordner vi en poengsum for hver CPL fra 0 til 2. I detaljer skal en poengsum 0 representere den gitte foten ikke er i stand til å flytte for å fullføre en touchdown, derav ingen CPL; en score 1 representerer noen uregelmessig eller klønete CPL siden den gitte foten fullfører en touchdown, men ikke i den perfekte koblingen; en score 2 betyr en perfekt kobling på 0,5. De tre koblingsparameterbegrepene er godt beskrevet i de forrige publikasjonene32,33. CPL kan kombineres med vurderinger av kontaktplassering og rutenettgange. Individuelle komponenter i det kombinerte atferdspoengsystemet vil være mer eller mindre effektive i forskjellige rottemodeller av SCI. For CPL ble underskuddene åpenbart synlige i vekslingshastigheten og fullstendigheten av sekvensen. Proprioceptive hindlimb plassere underskudd kan tydelig avsløres etter ensidig HX. I vår studie viste alle rotter ipsilesional hindlimb plassere underskudd mens den kontralaterale bakben plassering viste ingen underskudd. Rutenettet strekktest bør vurderes når kontaktplassering, som innebærer kortikospinalkanalen, begynner å komme seg. For å utelukke eventuelle tretthetsproblemer, kan sekvensen av atferdstester bli randomisert ved hver test.
Til slutt rapporterer vi trinnvise prosedyrer for å skape en reproduserbar in vivo rottemodell av T9 spinal HX som etterligner Brown-Séquard syndromet hos mennesker. Det kombinerte atferdspoengsystemet for hemisection gir et mer diskriminerende mål på individuelle bakbensatferdsresultater for evaluering av skademekanismer og behandlinger etter en ensidig SCI. Selv om vi bare gir en visuell beskrivelse av kirurgiske prosedyrer og atferdsvurderinger av en thorax HX, kan metoder som er beskrevet her, brukes på andre ufullstendige SCIer på ulike skadenivåer.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Mr. Jeffrey Recchia-Rife for hans utmerkede tekniske hjelp. Dette arbeidet ble delvis støttet av stiftelsen av direktør for generalhospitalet i Jinan Military Region of Chines PLA 2016ZD03 og 2014ZX01 (XJL og TBZ). Forskning i Xu-laboratoriet støttes av NIH 1R01 100531, 1R01 NS103481 og Merit Review Award I01 BX002356, I01 BX003705, I01 RX002687 fra det amerikanske veterandepartementet.
Baby-Mixter Hemostat | FST | 13013-14 | Can be any brand of choice |
Elevated plastic coated wire mesh grid | Any | 36×38 cm with 3 cm2 openings | |
Gel foam | Moore Medical | 2928 | Can be any brand of choice. |
Grip cement kit, powder and solvent | Dentsply | 675570 | Can be any brand of choice. |
Microbead Sterilizer | FST | NA | Can be any brand of choice |
Pearson Rongeur | FST | 16015-17 | Can be any brand of choice. |
Retractors | Jinxie surgical tools | 6810 | Can be any brand of choice |
Scalpel Handle | FST | 10003-12 | Can be any brand of choice |
Simplex-P cement | Stryker | Can be any brand of choice. | |
TreadScan automatic gait analysis | CleverSys Inc | NA | Can be any brand of choice |