Här beskriver vi kirurgiska ingrepp för att producera en tillförlitlig ryggmärg laterala hemisection (HX) på9: e bröst nivå i vuxna råttor och neurobehavioral bedömningar avsedda för att upptäcka asymmetriska underskott efter en sådan ensidig skada.
Ofullständig ryggmärgsskada (SCI) leder ofta till försämringar av sensorimotoriska funktioner och är kliniskt den vanligaste typen av SCI. Human Brown-Séquard syndrom är en vanlig typ av ofullständig SCI orsakas av en lesion till hälften av ryggmärgen som resulterar i förlamning och förlust av proprioception på samma (eller ipsilesional) sida som skadan, och förlust av smärta och temperatur känsla på motsatt (eller preventivmedel) sida. Adekvata metoder för att producera en ryggmärg laterala hemisection (HX) och bedöma neurologiska funktionsnedsättningar är nödvändiga för att fastställa en tillförlitlig djurmodell av Brown-Séquard syndrom. Även om laterala hemisection modellen spelar en central roll i grundläggande och translationell forskning, standardiserade protokoll för att skapa en sådan hemisection och bedöma ensidiga funktion saknas. Målet med denna studie är att beskriva steg-för-steg förfaranden för att producera en råtta spinal laterala HX på9: e bröst (T9) vertebral nivå. Vi beskriver sedan en kombinerad beteende skala för HX (CBS-HX) som ger en enkel och känslig bedömning av asymmetriska neurologiska prestanda för ensidiga SCI. CBS-HX, från 0 till 18, består av 4 individuella bedömningar som inkluderar ensidiga hindlimb stepping (UHS), koppling, kontakt placering, och rutnät promenader. För CBS-HX bedöms de ensidig och kontralaterala bakbenen separat. Vi fann att, efter en T9 HX, visade ensidig hindlimb nedsatt beteende funktion medan kontralateral hindlimb visade betydande återhämtning. CBS-HX diskriminerande effektivt beteendemässiga funktioner mellan ensidig och kontralateral hindlimbs och upptäckta tidsmässiga progression av återvinning av ensidig hindlimb. CBS-HX-komponenterna kan analyseras separat eller i kombination med andra åtgärder vid behov. Även om vi endast lämnat visuella beskrivningar av kirurgiska ingrepp och beteendemässiga bedömningar av en bröst HX, kan principen tillämpas på andra ofullständiga SFI och på andra nivåer av skadan.
De ofullständiga ryggmärgsskadorna (SCI) leder ofta till allvarliga och ihållande funktionsnedsättningar av sensorimotoriska funktioner och är kliniskt den vanligaste typen av SCI1. Brown-Séquard syndrom hos människor orsakas av en lesion till hälften av ryggmärgen som resulterar i förlamning och förlust av proprioception på samma (eller ipsilesional) sida som skadan, och förlust av smärta och temperatur känsla på motsatt (eller kontralesional) sida2,3,4. Spinal laterala hemisection djurmodeller används i stort sett för att efterlikna mänskliga Brown-Séquard syndrom och de har rapporterats hos råttor5,,6,7,8,9, opossums10, och apor7,11,12,13 av olika laboratorier på olika spinal nivåer. Detaljerade visualiserade procedurer för att producera en standard lateral hemisection har dock inte beskrivits. Att tillhandahålla steg-för-steg-förfaranden för en lateral hemisection bör optimera modellen och underlätta jämförelse eller replikering av experimentella resultat i grundläggande och translationell forskning.
En ensidig SCI producerar asymmetriska och oproportionella beteende underskott som är svåra att mäta med konventionella bedömningar för symmetriska skador. En lämplig metod för att bedöma neurologiska funktionsnedsättningar för en ensidig SCI är en viktig del av utvecklingen av en ensidig SCI-modell. Trots den centrala roll en ensidig spinal skada, standardiserade protokoll för att utvärdera sensorimotor underskott hos djur med en sådan skada saknas. Den Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) rörelse klassning skala har varit den mest använda mätning av funktionen efter SCI för vuxna råttor 14 som ger en semiquantitative beskrivning av förflyttning som helhet. Den mäter dock inte varje bakben oberoende av varandra.
I denna studie rapporterar vi steg-för-steg förfaranden för att producera en gnagare spinal HX vid9: e bröst (T9) vertebral nivå. Vi introducerar också en kombinerad beteende skala för hemisection (CBS-HX) som inkluderar ensidiga hindlimb stepping (UHS), koppling, placering kontakt och rutnät promenader bedömningar för utvärdering neurologiska nedskrivningar och återvinning efter en ensidig SCI. Vi hoppas att denna modell kommer att vara en användbar modell för att undersöka skademekanismer och terapeutiska effektivitetsvinster för ensidiga s.o.m.
I denna studie rapporterar vi steg-för-steg förfaranden för att producera en enkel, konsekvent och reproducerbara T9 spinal HX hos vuxna råttor som härmar Brown-Séquard syndrom hos människor. Vi introducerar vidare ett kombinerat beteende poängsystem för hemisection (CBS-HX) som är känslig för att utvärdera asymmetrisk neurologisk försämring och progression av återhämtning, mätt med en kombination av ensidiga hindlimb stepping (UHS), koppling (CPL), kontakt och rutnätsgång. Även om vi visar skadan på T9 nivå, kan detta förfarande tillämpas på andra regioner i ryggmärgen inklusive massundersökning och ländryggen sladdar på ett enkelt och krävande sätt. Vi hoppas att denna modell, tillsammans med unilateraliserade beteendemässiga bedömningar, kommer att vara användbart för att undersöka skademekanismer och terapeutiska effektivitetsvinster för sådana typer av SCI.
Eftersom den laterala HX-modellen endast organskador den ipsilaterala halvan av sladden, är den kontralaterala sidan av sladden till stor del bevarad och kan användas som en intern kontroll. Många fallande och stigande vägar är ensidigt projiceras och en lateral hemisection i många fall ger skador på en axonal tarmkanalen på ena sidan och bevarar samma tarmkanalen på motsatt sida, vilket möjliggör jämförelse av omorganisation och funktionella konsekvenserna av dessa områden hos samma djur. Dessutom kan producera en mer lokaliserad lesion tillåta inriktning av specifika vägar. Till exempel, en ventrala och ventrolateral lesion kan påverka reticulospinal och vestibulospinal vägar. En dorsal eller dorsolateral lesion kan påverka korticospinal och rubrospinal vägar. Den hemisection eller partiell skada modell kan också användas för att studera anatomi och funktion av andra vägar, såsom propriospinal, noradrenergic eller serotonerga vägar. Således kan hemisection modellen vara unikt anställd för att studera ersättning av sensoriska afferenter, genom fallande vägar, och av inneboende spinal kretsar. Denna modell är också lämplig för att undersöka mekanismer för rörelsedrivande återhämtning efter HX.
Den laterala HX leder till uppenbara beteendemässiga nedskrivningar, som kan bedömas under motoriska uppgifter (t.ex. Treadscan eller Löpband) paradigm för den automatiserade gånganalys 19. Dessutom kan ledningsförmågan hos axonal skrifter på kontralateral sidan till lesion mätas med hjälp av elektrofysiologiska inspelningar, och denna utvärdering ger möjlighet att upprätta en funktionell omorganisation efter olika behandlingar. Dessutom ensidiga injektioner av anatomiska spårämnen i nervceller i en viss väg tillåta visualisering av anterogradely märkt mittlinjen korsning fibrer och deras samband med bakåtsträvande märkta nervceller20,21,22,23,24,25.21
Även om en typisk spinal HX kirurgi tar mindre än 20 minuter att avsluta, det kräver viss praxis för att uppnå en exakt och konsekvent HX. För det första är det viktigt att spinal HX-nivån är konsekvent från djur till djur. Därför är det viktigt att lämpliga vertebral segmentet för laminectomy identifieras. För det andra, se till att HX är klar. För att göra en komplett HX, kan man använda en 30-gauge nål införas vertikalt genom mittlinjen för att styra skärande med hjälp av mikroscisser. Nålen insättning också undviker skador på den bakre ryggmärgskärl eller sladd över lesioning. Den andra funktionen av 30-gauge nålen är att den kan fungera som en kniv för att spåra snittet för att se till att det inte finns någon tvetydighet av lesionen. För det tredje, placera gelatin på lesion webbplats kan minimera ryggmärgsvätskan läckage, och placera cement ovanpå gelatin och överbrygga vertebral lamina kan stärka stabiliteten hos spinal kotor vid lesion plats och underlätta sårläkning. För att undvika signalstörningar med tillämpning av elektrofysiologiska inspelningar bör muskler, fascia och hud sys i lager med 4-0 silkestråd. Slutligen bör alla ansträngningar göras för att minimera skadorna på den kontralaterala ryggmärgen. Histologiska kontroller bör fastställas för att bekräfta en fullständig lateral hemisection på ena sidan och bevarande av den andra halvan av sladden på den andra sidan (som visas i figur 6E).
För att förbättra förflyttningen efter SCI har tidigare studier använt sig av ett brett spektrum av strategier, inklusive celltransplantation, axonregenerering 8,,18,26,27och aktivitetsbaserad rehabilitering 28,29,30. Samtidigt har flera beteendetester fastställts för funktionell bedömning och för att screena för de bästa behandlingarna efter SCI. BBB-kolmotorska klassificeringsskalan har utformats för rörelsepassningsbedömning av ryggradssymmetriska skador såsom en midline kontusion eller transection skador som påverkar bilaterala hindlimbs 14,31. Vissa parametrar för BBB, såsom samordning och tå clearance, registreras genom att observera båda bakbenen. Om en hindlimb är intakt och den andra visar underskott som ses i asymmetriska skador, då intakt hindlimb kommer att förvirra poängen för den drabbade hindlimb. Eftersom BBB-poänggörandet inte rymmer en bakbenspoäng från den andra efter den ensidiga skadan, är den inte idealisk för att bedöma ensidiga ryggmärgsskador. Om gemensamma rörelser och viktstöd på varje sida bedöms separat och inte beräknas som en del av BBB, kommer dock den intakta bakbenet (liknande en simulerad kontroll) inte att blanda ihop poängen för det drabbade hindlimb. Dessutom kommer den intakta sidan inte bias den totala poängen för djuret, eftersom den intakta hindlimb inte har dramatiska underskott i gemensamma rörelser, viktstöd, eller kliva.
Den kombinerade beteende poäng för hemisection är utformad för att vara en känslig och lätt utförd utvärdering av beteendemässiga återhämtning i råtta modell av laterala hemisection. Det kan användas för att bedöma beteenden av både tidiga och sena faser av återhämtning. Den tidiga fasen är inom 7-10 dagar efterinjury. Under de första 3-5 dagarna efter HX, den ensiella hindlimb aktiviteten ökade stadigt och bör bedömas oftare för att registrera spontana eller behandling-medierad hindlimb rörelse återvinningar. Vid 5-7 dag post-HX, råtta började till göra svepande hindlimb rörelserna utan vikt stöd. Vid 7-10 dag, råtta typiskt börja till stå och steg. Under denna fas bör uppmärksamhet på stegmönstret ägnas. I slutet av fasen (14-28 dagar) var den enpsilateral hindlimb aktiviteten stabil och nära det normala.
Stor uppmärksamhet bör också ägnas åt kopplingskapacitet (CPL). CPL-testet (gångkoppling) kan utföras antingen med en video (t.ex. Treadscan/Catwalk) eller en filmvideo under ett test med öppna fält. Det andra alternativet ger flexibilitet om forskarna inte har tillgång till gånganalyssystemet. För båda videoinspelningssessionerna krävs minst två på varandra följande touchdowns för varje fot för det här testet. För analysen finns tre kopplingsparametrar: homolog, homolateral och diagonal koppling (steg 6.2). Varje koppling innebär en referensfot och den givna foten. Ta homolog koppling (främre vänster-främre höger, eller bak vänster-hind höger) till exempel är det den första touchdown tid av den givna foten dividerat med en hel steg tid referensfoten. Eftersom vänster och höger fot ska vara ur fas, bör den perfekta kopplingen vara 0,5. Detta är samma fall i homolateral koppling (vänster främre vänster bak, eller höger fram-höger bak). För diagonal koppling (vänster fram-höger bak, eller höger fram-vänster bak), bör den perfekta kopplingen vara 0 eller 1 eftersom de två fötterna bör vara i fas. I steg 6.4 tilldelar vi en poäng för varje CPL från 0 till 2. I detaljer ska en poäng 0 representera den givna foten inte kan röra sig för att avsluta en touchdown, därav ingen CPL; en poäng 1 representerar oregelbunden eller klumpig CPL eftersom den givna foten avslutar en touchdown men inte i den perfekta kopplingen. en poäng 2 betyder en perfekt koppling på 0,5. Begreppen de tre kopplingsparametern beskrivs väl i de tidigare publikationerna32,33. CPL kan kombineras med bedömningar av kontaktplacering och rutnätsgång. Enskilda komponenter i det kombinerade beteende poängsystemet kommer att vara mer eller mindre effektiva i olika råtta modeller av SCI. För CPL blev underskotten uppenbarligen synliga i alterneringen och sekvensens fullständighet. Proprioceptive hindlimb placering underskott kan tydligt avslöjas efter ensidiga HX. I vår studie visade alla råttor ipsilesional hindlimb placera underskott medan kontralateral hindlimb placering visade inga underskott. Rutnätet gångtest bör beaktas när kontakt placering, vilket innebär corticospinal tarmkanalen, börjar återhämta sig. För att utesluta eventuella trötthetsproblem kan sekvensen av beteendetester randomiseras vid varje test.
Sammanfattningsvis rapporterar vi steg-för-steg förfaranden för att skapa en reproducerbar in vivo råtta modell av T9 spinal HX som härmar Brown-Séquard syndrom hos människor. Det kombinerade beteende poängsystemet för hemisection erbjuder ett mer diskriminerande mått på enskilda hindlimb beteendemässiga resultat för att utvärdera skada mekanismer och behandlingar efter en ensidig SCI. Även om vi bara ger en visuell beskrivning av kirurgiska ingrepp och beteendemässiga bedömningar av en bröst HX, metoder som beskrivs här kan tillämpas på andra ofullständiga SFI på olika skada nivåer.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Jeffrey Recchia-Rife för hans utmärkta tekniska hjälp. Detta arbete stöddes delvis av stiftelsen för generaldirektören för Jinan military region of Chines PLA 2016ZD03 och 2014ZX01 (XJL och TBZ). Forskning i Xu laboratoriet stöds av NIH 1R01 100531, 1R01 NS103481, och Merit Review Award I01 BX002356, I01 BX003705, I01 RX002687 från US Department of Veterans Affairs.
Baby-Mixter Hemostat | FST | 13013-14 | Can be any brand of choice |
Elevated plastic coated wire mesh grid | Any | 36×38 cm with 3 cm2 openings | |
Gel foam | Moore Medical | 2928 | Can be any brand of choice. |
Grip cement kit, powder and solvent | Dentsply | 675570 | Can be any brand of choice. |
Microbead Sterilizer | FST | NA | Can be any brand of choice |
Pearson Rongeur | FST | 16015-17 | Can be any brand of choice. |
Retractors | Jinxie surgical tools | 6810 | Can be any brand of choice |
Scalpel Handle | FST | 10003-12 | Can be any brand of choice |
Simplex-P cement | Stryker | Can be any brand of choice. | |
TreadScan automatic gait analysis | CleverSys Inc | NA | Can be any brand of choice |