Burada erişkin sıçanlarda9’uncu torasik düzeyde güvenilir bir spinal kord lateral hemiksiyon (HX) üretmek için yapılan cerrahi prosedürleri ve böyle bir tek taraflı yaralanma sonrası asimetrik açıkları tespit etmek için tasarlanmış nörodavranışsal değerlendirmeleri açıklıyoruz.
Tamamlanmamış omurilik yaralanması (SCI) genellikle sensorimotor fonksiyonların bozukluklarına yol açar ve klinik olarak SCI.Human Brown-Séquard sendromunun en sık görülen tipidir. Bir omurilik lateral hemisection (HX) üretmek ve nörolojik bozuklukların değerlendirilmesi için yeterli metodolojiler Brown-Séquard sendromu güvenilir bir hayvan modeli kurmak için gereklidir. Lateral hemikesit modeli temel ve çevirisel araştırmalarda önemli bir rol oynasa da, böyle bir hemisitin oluşturulması ve tek taraflı fonksiyonun değerlendirilmesi için standart laştırılmış protokoller eksiktir. Bu çalışmanın amacı, 9torasik (T9) vertebra düzeyinde bir sıçan spinal lateral HX üretmek için adım adım prosedürleri tanımlamaktır. Biz, daha sonra, HX için kombine bir davranış ölçeği tarif (CBS-HX) tek taraflı SCI için asimetrik nörolojik performans basit ve hassas bir değerlendirme sağlar. CBS-HX, 0 ile 18 arasında değişen, tek taraflı hindlimb stepping (UHS), kaplin, kontak yerleştirme ve ızgara yürüyüş dahil olmak üzere 4 ayrı değerlendirmeler oluşur. CBS-HX için ipsilateral ve kontralateral arka bacaklar ayrı ayrı değerlendirilir. T9 HX’ten sonra ipsilateral arka ekstremitenin davranış bozukluğu gösterdiğini, kontralateral arka ekstremitenin ise önemli ölçüde iyileştiğini gördük. CBS-HX, ipsilateral ve kontralateral arka bacaklar arasında etkili bir şekilde davranışsal fonksiyonları ayırarak ipsilateral arka ekstremitenin iyileşmesinin zamansal ilerlemesini saptamıştır. CBS-HX bileşenleri gerektiğinde ayrı ayrı veya diğer önlemlerle birlikte analiz edilebilir. Sadece torasik HX’in cerrahi prosedürleri ve davranışsal değerlendirmeleri hakkında görsel açıklamalar sağlasak da, bu ilke diğer eksik SCI’lere ve yaralanmanın diğer düzeylerinde uygulanabilir.
Tamamlanmamış omurilik yaralanmaları (SCI) genellikle sensorimotor fonksiyonların ciddi ve kalıcı bozukluklarına yol açar ve klinik olarak EN sık görülen SCI1tipidir. İnsanlarda Brown-Séquard sendromu felç ve yaralanma aynı (veya ipsilesional) tarafında propriosepsiyon kaybı ile sonuçlanan omurilik yarısına bir lezyon neden olur ve ters ağrı ve sıcaklık hissi kaybı (veya contralesional) yan2,3,4. Spinal lateral hemisection hayvan modelleri insan Brown-Séquard sendromu taklit etmek için geniş kullanılır ve sıçanlarda bildirilmiştir5,6,7,8,9, opossums10, ve maymunlar7,11,12,13 çeşitli spinal düzeylerde çeşitli laboratuvarlar tarafından. Ancak, standart bir lateral hemiyon üretmek için ayrıntılı görselleştirilmiş prosedürler açıklanmamıştır. Lateral hemisection için adım adım prosedürlerin sağlanması modeli optimize etmeli ve temel ve çevirisel araştırmalarda deneysel sonuçların karşılaştırılmasını veya çoğaltılmasını kolaylaştırmalıdır.
Tek taraflı BIR SCI, simetrik yaralanmalar için konvansiyonel değerlendirmeler kullanılarak ölçülmesi zor asimetrik ve orantısız davranış açıkları üretir. Tek taraflı bir SCI için nörolojik bozuklukları değerlendirmek için yeterli bir metodoloji tek taraflı SCI modeli geliştirmenin önemli bir bileşenidir. Tek taraflı spinal yaralanmanın kilit rolüne rağmen, böyle bir yaralanmaya sahip hayvanlarda sensorimotor açıklarının değerlendirilmesi için standart protokoller eksiktir. Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) lokomotor derecelendirme ölçeği, bir bütün olarak lokomotion’ın yarı kantitatif bir tanımını veren yetişkin sıçanlar 14 için SCI’den sonra fonksiyonun en sık kullanılan ölçümü olmuştur. Ancak, her hindlimb bağımsız olarak ölçmek değildir.
Bu çalışmada, 9torasik (T9) vertebra düzeyinde bir kemirgen spinal HX üretmek için adım adım prosedürleri rapor. Ayrıca tek taraflı arka bacak adımlama (UHS), kaplin, temas yerleştirme ve tek taraflı sci sonrası nörolojik bozukluklar ve iyileşme değerlendirmek için ızgara yürüyüş değerlendirmeleri içeren hemisite (CBS-HX) için kombine bir davranış ölçeği sokulmaktadır. Biz bu model yaralanma mekanizmaları ve tek taraflı SCIs için terapötik etkinliğini incelemek için yararlı bir model olacağını umuyoruz.
Bu çalışmada, erişkin sıçanlarda erkeklerde Brown-Séquard Sendromu’nu taklit eden basit, tutarlı ve tekrarlanabilir T9 spinal HX üretmek için adım adım prosedürler rapor ediyoruz. Ayrıca, tek taraflı arka ekstremite adım (UHS), kaplin (CPL) kombinasyonu ile ölçülen asimetrik nörolojik bozukluk ve iyileşme ilerlemesini değerlendirmek için hassas hemisit (CBS-HX) için kombine davranış skor sistemi sokulmaktadır. temas ve ızgara yürüyüş yerleştirerek. Yaralanmayı T9 düzeyinde göstermesek de bu işlem omuriliğin servikal ve lomber kordonlar da dahil olmak üzere diğer bölgelerine basit ve talepsiz bir şekilde uygulanabilir. Biz bu model, tek taraflı davranışdeğerlendirmeleri ile birlikte, SCI bu tür için yaralanma mekanizmaları ve terapötik etkinliğini incelemek için yararlı olacağını umuyoruz.
Lateral HX modeli sadece kordonun ipsilateral yarısını leziz olduğundan, kordonun kontralateral tarafı büyük ölçüde korunur ve iç kontrol olarak kullanılabilir. Birçok alçalan ve yükselen yollar tek taraflı olarak yansıtılır ve birçok durumda lateral hemisection bir tarafta aksonal bir yol hasara neden olan ve karşı tarafta aynı yolu korur, yeniden yapılanma karşılaştırma sağlar ve aynı hayvanda bu yollar fonksiyonel sonuçları. Buna ek olarak, daha lokalize bir lezyon üretmek belirli yolların hedeflemesine izin verebilir. Örneğin, bir ventral ve ventrolateral lezyon retikülospinal ve vestibulospinal yolları etkileyebilir. Bir dorsal veya dorsolateral lezyon kortikospinal ve rubrospinal yolları etkileyebilir. Hemisection veya parsiyel yaralanma modeli de anatomi ve propriospinal gibi diğer yolların fonksiyonu çalışmak için kullanılabilir, noradrenerjik veya serotonerjik yollar. Böylece, hemikesit modeli benzersiz duyusal afferents tarafından tazminat çalışma için istihdam edilebilir, inen yollar tarafından, ve içsel spinal devre tarafından. Bu model aynı zamanda HX sonrası lokomotor kurtarma mekanizmaları araştırmak için uygundur.
Lateral HX, otomatik yürüyüş analizi için motor görevler (örneğin, Treadscan veya Treadmill) paradigması altında değerlendirilebilir belirgin davranış bozuklukları, yol açar 19. Ayrıca, lezyonun kontralateral tarafındaki aksonal yollarin iletkenliği elektrofizyolojik kayıtlar kullanılarak ölçülebilir ve bu değerlendirme çeşitli tedaviler sonrasında fonksiyonel bir yeniden yapılanma oluşturma imkanı sağlar. Ayrıca, belirli bir yolun nöronlar içine anatomik izleyicilerin tek taraflı enjeksiyonlar anterogradely etiketli orta hat geçiş lifleri ve retrograd etiketli nöronlar ile bunların bağlantı görselleştirme izin20,21,22,23,24,25.
Tipik bir spinal HX ameliyatı bitirmek için az 20 dakika sürer rağmen, kesin ve tutarlı bir HX elde etmek için bazı uygulama gerektirir. İlk olarak, spinal HX düzeyi nin hayvandan hayvana tutarlı olması önemlidir. Bu nedenle laminektomi için uygun vertebra segmentinin belirlenmesi önemlidir. İkinci olarak, HX’in tamamlandığından emin olun. Tam bir HX yapmak için, mikrosksorkullanarak kesme kılavuzu için orta hatta dikey olarak yerleştirilen 30-gauge iğne kullanabilirsiniz. İğne takılması da lezyon üzerinde posterior spinal damarlar veya kordon hasarı önler. 30-gauge iğnenin ikinci işlevi, lezyonun belirsizliği olmadığından emin olmak için kesiği takip etmek için bıçak görevi görebilmektir. Üçüncü olarak, lezyon sitesine jelatin yerleştirerek beyin omurilik sıvısı sızıntısı en aza indirebilirsiniz, ve jelatin üstüne çimento yerleştirerek ve vertebral lamina köprülelelele lezyon yerinde spinal vertebra istikrarını güçlendirmek ve yara iyileşmesini kolaylaştırmak. Elektrofizyolojik kayıtların uygulanması ile sinyal parazitini önlemek için, kaslar, fasya ve cilt 4-0 ipek iplik ile katmanlar halinde dikilmelidir. Son olarak, kontralateral omurilik hasarı en aza indirmek için her türlü çaba gösterilmelidir. Histolojik doğrulama bir tarafta tam bir lateral hemiyon onaylamak ve diğer tarafta kordonun diğer yarısının korunması için kurulmalıdır (Şekil 6E’degösterildiği gibi).
SCI sonra hareket geliştirmek için, önceki çalışmalarda hücre nakli, akson rejenerasyon 8,18,,26,27, ve aktivite tabanlı rehabilitasyon 28,29,30dahil olmak üzere stratejiler geniş bir yelpazede yararlanmıştır. Bu arada, fonksiyonel değerlendirme ve SCI aşağıdaki en iyi tedaviler için tarama için çeşitli davranış testleri kurulmuştur. BBB lokomotor derecelendirme ölçeği, bilateral hindlimbs etkileyen bir orta hat kontüzyonu veya transection yaralanmaları gibi spinal simetrik yaralanmaların lokomotor değerlendirilmesi için tasarlanmıştır 14,31. Koordinasyon ve ton lama gibi BBB’nin bazı parametreleri her iki arka bacak gözlemlenerek kaydedilir. Eğer bir arka bacak sağlamsa ve diğeri asimetrik yaralanmalarda görüldüğü gibi açıkları gösteriyorsa, o zaman bozulmamış arka ekstremite etkilenen arka ekstremitenin skorunu sarsacaktır. BBB skoru tek taraflı yaralanma sonrası diğerinden bir arka bacak skoru na uygun olmadığından, tek taraflı omurilik yaralanmalarını değerlendirmek için ideal değildir. Ancak, her iki taraftaki eklem hareketi ve ağırlık desteği ayrı ayrı değerlendirilir ve BBB’nin bir parçası olarak hesaplanmaz ise, o zaman bozulmamış arka bacak (şam kontrolüne benzer) etkilenen arka ekstremitenin skoru na bulamayacaktır. Ayrıca, bozulmamış tarafı hayvanın genel puanı önyargı olmaz, bozulmamış arka bacak eklem hareketi dramatik açıkları yok çünkü, ağırlık desteği, ya da adım.
Hemisection için kombine davranış skoru lateral hemisection sıçan modelinde davranışsal iyileşme hassas ve kolay gerçekleştirilen bir değerlendirme olarak tasarlanmıştır. Hem erken hem de geç iyileşme evrelerinin davranışlarını değerlendirmek için kullanılabilir. Erken evre yaralanma sonrası 7-10 gün içindedir. HX sonrası ilk 3-5 gün içinde ipsilateral hindlimb aktivitesi sürekli olarak artmış ve spontan veya tedavi aracılı arka bacak hareketlerinin iyileşmekaydedilmesi için daha sık değerlendirilmelidir. HX sonrası 5-7 gün ile sıçanlar ağırlık desteği olmadan süpürme arka bacak hareketleri yapmaya başladılar. 7-10 gün içinde, sıçanlar genellikle ayakta durmaya ve adım atmaya başladılar. Bu aşamada, basamak paternine dikkat edilmelidir. Geç fazda (14-28 gün) ipsilateral arka bacak aktivitesi stabil ve normale yakındı.
Kaplin (CPL) kapasitesine de dikkat edilmelidir. CPL testi (yürüyüş kaplini) açık alan testi sırasında bir video (örneğin, Treadscan/Catwalk) veya bir film çekimi videosu ile gerçekleştirilebilir. Araştırmacıların yürüyüş analiz sistemine erişimi yoksa ikinci seçenek esneklik sağlar. Her iki video kayıt oturumu için, bu test için her ayak için en az iki ardışık touchdown gereklidir. Analiz için üç bağlantı paramı vardır: homolog, homolateral ve diyagonal bağlantı (adım 6.2). Her kaplin bir referans ayak ve verilen ayak içerir. Örneğin homolog bağlantı (ön sol-ön sağ veya arka sol-arka sağ) atın, verilen ayağın referans ayağının bir adım lık bir süreye bölündüğü ilk touchdown zamanıdır. Sol ve sağ ayak faz dışında olması gerektiğinden, mükemmel bağlantı 0.5 olmalıdır. Bu homolateral kaplin (sol ön-sol arka veya sağ ön-sağ arka) aynı durumdur. Ancak, diyagonal bağlantı için (sol ön-sağ arka, veya sağ ön-sol arka), iki ayak faz olmalıdır beri mükemmel kaplin 0 veya 1 olmalıdır. Adım 6.4 olarak, her CPL için 0’dan 2’ye bir puan atıyoruz. Ayrıntılı olarak, bir puan 0 verilen ayak temsil edecek bir touchdown bitirmek için hareket edemiyor, dolayısıyla hiçbir CPL; verilen ayak bir touchdown bitirir ama mükemmel kaplin değil beri bir puan 1 herhangi bir düzensiz veya beceriksiz CPL temsil eder; bir puan 2 0.5 mükemmel bir kaplin anlamına gelir. Üç bağlantı parametresi kavramları iyi önceki yayınlarda32,33açıklanmıştır. CPL kontak yerleştirme ve ızgara yürüyüş değerlendirmeleri ile kombine edilebilir. Birleşik davranış skorlama sisteminin tek tek bileşenleri SCI’nin farklı sıçan modellerinde az ya da çok etkili olacaktır. CPL için, açıkları açıkça değişim oranı ve dizi bütünlüğü görünür hale geldi. Proprioseptif arka ekstremite yerleştirerek açıkları açıkça tek taraflı HX sonra ortaya olabilir. Çalışmamızda, tüm sıçanlar ipsilezyonal hindlimb ekstremite açıkları yerleştirerek gösterdi kontralateral hindlimb yerleştirerek hiçbir açıkları gösterdi. Kortikospinal yolu içeren kontak yerleştirme de değerlendirilmesi göz önünde bulundurulmalıdır. Olası yorgunluk sorunlarını elemek için, davranışsal testlerin sırası her testte randomize edilebilir.
Sonuç olarak, insanlarda Brown-Séquard Sendromu’nu taklit eden T9 spinal HX’in vivo sıçan modelinin tekrarlanabilir bir modelini oluşturmak için adım adım prosedürler rapor ediyoruz. Hemiseksiyon için kombine davranış skorlama sistemi tek taraflı bir SCI sonra yaralanma mekanizmaları ve tedavileri değerlendirmek için bireysel hindlimb davranışsal sonuçların daha ayrımcı bir ölçü sunuyor. Torasik HX’in cerrahi prosedürleri ve davranışsal değerlendirmelerinin sadece görsel bir açıklamasını sağlasak da, burada tanımlanan yöntemler farklı yaralanma düzeylerindeki diğer eksik STI’lere uygulanabilir.
The authors have nothing to disclose.
Bay Jeffrey Recchia-Rife’ye mükemmel teknik yardımları için teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Chines PLA 2016ZD03 ve 2014ZX01 (XJL ve TBZ) Jinan Askeri Bölgesi Genel Hastanesi Müdürü Vakfı tarafından desteklenmiştir. Xu laboratuvarındaki araştırmalar NIH 1R01 100531, 1R01 NS103481 ve Merit Review Award I01 BX002356, I01 BX003705, I01 RX002687 tarafından ABD Gaziler İşleri Bakanlığı’ndan desteklenmiştir.
Baby-Mixter Hemostat | FST | 13013-14 | Can be any brand of choice |
Elevated plastic coated wire mesh grid | Any | 36×38 cm with 3 cm2 openings | |
Gel foam | Moore Medical | 2928 | Can be any brand of choice. |
Grip cement kit, powder and solvent | Dentsply | 675570 | Can be any brand of choice. |
Microbead Sterilizer | FST | NA | Can be any brand of choice |
Pearson Rongeur | FST | 16015-17 | Can be any brand of choice. |
Retractors | Jinxie surgical tools | 6810 | Can be any brand of choice |
Scalpel Handle | FST | 10003-12 | Can be any brand of choice |
Simplex-P cement | Stryker | Can be any brand of choice. | |
TreadScan automatic gait analysis | CleverSys Inc | NA | Can be any brand of choice |