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उपंयास Photoacoustic माइक्रोस्कोपी और ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी दोहरे-मोडल Chorioretinal इमेजिंग खरगोश आंखों में रहने का

Published: February 8, 2018 doi: 10.3791/57135
Automatic Translation
1, 2,3, 1, 2,4, 1,2
1Kellogg Eye Center, Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Michigan, 2Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, 3Institute of Biomedical Engineering, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 4Department of Radiology, University of Michigan

Summary

इस पांडुलिपि का वर्णन उपंयास सेटअप और एक photoacoustic माइक्रोस्कोपी और ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी दोहरी के संचालन की प्रक्रिया-इनवेसिव, लेबल मुक्त ऐसे खरगोश के रूप में बड़े पशुओं, के chorioretinal इमेजिंग के लिए रूपरेखा प्रणाली ।

Abstract

Photoacoustic नेत्र इमेजिंग एक उभरती हुई नेत्र इमेजिंग प्रौद्योगिकी है कि आक्रामक ध्वनि तरंगों में प्रकाश ऊर्जा परिवर्तित करके नेत्र ऊतक कल्पना कर सकते है और गहन जांच के तहत वर्तमान में है । हालांकि, सबसे तारीख को काम की सूचना दी छोटे जानवरों की आंखों के पीछे खंड के इमेजिंग पर ध्यान केंद्रित है, जैसे चूहों और चूहों, जो नैदानिक मानव छोटे गोलक आकार के कारण अनुवाद के लिए चुनौतियां बन गया है । इस पांडुलिपि का वर्णन एक उपंयास photoacoustic माइक्रोस्कोपी (पाम) और ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी (अक्टूबर) दोहरे पीछे खंड के लिए प्रणाली बड़े जानवरों की आंखों की, जैसे खरगोशों के रूप में इमेजिंग । प्रणाली विंयास, प्रणाली संरेखण, पशु तैयारी, और दोहरी-रूपरेखा के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल vivo में, इनवेसिव, लेबल मुक्त chorioretinal इमेजिंग खरगोशों में विस्तृत रहे हैं । विधि की प्रभावशीलता के प्रतिनिधि प्रयोगात्मक परिणामों के माध्यम से प्रदर्शन किया, रेटिना और धमनियां द्वारा प्राप्त vasculature सहित, पाम और OCT. इस पांडुलिपि खरगोश में इमेजिंग परिणाम reproducing और बड़े पशुओं में photoacoustic नेत्र इमेजिंग आगे बढ़ने के लिए एक व्यावहारिक गाइड प्रदान करता है ।

Introduction

हाल के दशकों में बायोमेडिकल photoacoustic इमेजिंग1,2,3,4,5,6,7 के क्षेत्र के विस्फोटक विकास देखा है ,8. ध्वनि में प्रकाश की ऊर्जा रूपांतरण के आधार पर, उभरते photoacoustic इमेजिंग organelles से तराजू पर जैविक नमूनों की कल्पना कर सकते हैं, कोशिकाओं, ऊतकों, छोटे जानवर पूरे शरीर के लिए अंगों और अपनी शारीरिक, कार्यात्मक, आणविक, आनुवंशिक प्रकट कर सकते हैं, और मेटाबोलिक जानकारी1,2,9,10,11,12. Photoacoustic इमेजिंग जैव चिकित्सा क्षेत्रों की एक श्रेणी में अद्वितीय अनुप्रयोगों पाया गया है, जैसे सेल बायोलॉजी13,14, संवहनी जीव विज्ञान15,16, न्यूरोलॉजी17,18 , कैंसर विज्ञान19,20,21,22, त्वचा विज्ञान23, 15 औषध विज्ञान24, और रुधिर25,26। नेत्र विज्ञान में अपने आवेदन, कि है, photoacoustic नेत्र इमेजिंग, दोनों वैज्ञानिकों और चिकित्सकों से पर्याप्त हितों को आकर्षित किया है और सक्रिय जांच के तहत वर्तमान में है ।

नियमित रूप से इस तरह के fluorescein एंजियोग्राफी (एफए) और indocyanine ग्रीन एंजियोग्राफी (ICGA) (प्रतिदीप्ति कंट्रास्ट के आधार पर), ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी (OCT) (ऑप्टिकल कैटरिंग कंट्रास्ट के आधार पर) के रूप में, आंख इमेजिंग प्रौद्योगिकियों27इस्तेमाल करने के लिए इसके विपरीत , और उसके व्युत्पंन अक्टूबर एंजियोग्राफी (लाल रक्त कोशिकाओं के प्रस्ताव के विपरीत के आधार पर), photoacoustic नेत्र इमेजिंग विपरीत तंत्र के रूप में ऑप्टिकल अवशोषण का उपयोग करता है । यह पारंपरिक नेत्र इमेजिंग प्रौद्योगिकियों से अलग है और आंख के ऑप्टिकल अवशोषण गुणों का अध्ययन है, जो आम तौर पर नेत्र ऊतक28के pathophysiological स्थिति के साथ जुड़े रहे है के लिए एक अनूठा उपकरण प्रदान करता है । तिथि करने के लिए, महत्वपूर्ण उत्कृष्ट कार्य photoacoustic नेत्र इमेजिंग29,30,31,३२,३३,३४,३५में किया गया है, ३६,३७, लेकिन इन अध्ययनों चूहों और चूहों जैसे छोटे जानवरों की आंखों के पीछे खंड पर ध्यान केंद्रित । अग्रणी अध्ययन अच्छी तरह से नेत्र विज्ञान में photoacoustic इमेजिंग की व्यवहार्यता का प्रदर्शन लेकिन वहां अभी भी एक लंबा रास्ता है के लिए प्रौद्योगिकी के नैदानिक अनुवाद की ओर जाने के बाद से चूहों और चूहों की गोलक आकार बहुत छोटे है (एक तिहाई से कम) है कि मनुष्यों की । एक महत्वपूर्ण लंबी दूरी पर अल्ट्रासाउंड तरंगों के प्रचार के कारण, संकेत तीव्रता और छवि गुणवत्ता बहुत जब तकनीक इमेजिंग के लिए बड़ा आंखों के पीछे खंड के लिए प्रयोग किया जाता है पीड़ित हो सकता है ।

इस लक्ष्य की ओर, हमने हाल ही में इनवेसिव, लेबल मुक्त chorioretinal इमेजिंग एकीकृत photoacoustic माइक्रोस्कोपी (पाम) और वर्णक्रमीय-डोमेन oct (SD-oct)३८का उपयोग कर रहने वाले खरगोशों में रिपोर्ट । प्रणाली उत्कृष्ट प्रदर्शन किया है और अंतर्जात अवशोषण और नेत्र ऊतक के विपरीत बिखरने के आधार पर बड़े पशुओं की आंखों की रेटिना और रंजित कल्पना सकता है । खरगोश में प्रारंभिक परिणाम बताते है कि पाम इनवेसिव व्यक्तिगत रेटिना और धमनियां रक्त वाहिकाओं एक लेज़र जोखिम खुराक (~ ८० एनजे) काफी नीचे अमेरिकी राष्ट्रीय मानक संस्थान (ANSI) सुरक्षा सीमा (१६० एनजे) ५७० पर का उपयोग कर भेद सकता है एनएम३९; और OCT स्पष्ट रूप से अलग रेटिना परतों, रंजित, और श्वेतपटल हल कर सकता है । यह बड़ा पाम का उपयोग पशुओं के पीछे खंड इमेजिंग के बहुत पहले प्रदर्शन है और विचार प्रौद्योगिकी के नैदानिक अनुवाद की दिशा में एक बड़ा कदम हो सकता है कि खरगोश (१८.१ mm) के गोलक आकार४० के अक्षीय लंबाई के लगभग ८०% है मनुष्य (२३.९ मिमी).

इस काम में, हम दोहरे-मोडल इमेजिंग प्रणाली और प्रायोगिक प्रोटोकॉल का एक विस्तृत विवरण प्रदान करते है इनवेसिव, लेबल मुक्त chorioretinal इमेजिंग में रहने वाले खरगोश में और प्रतिनिधि रेटिना के माध्यम से प्रणाली के प्रदर्शन का प्रदर्शन और धमनियां इमेजिंग परिणाम ।

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Protocol

खरगोश एक संयुक्त राज्य अमेरिका के कृषि विभाग (USDA) प्रजातियों कवर कर रहे हैं । जैव चिकित्सा अनुसंधान में इसके उपयोग के लिए सख्त नियमों का पालन करने की जरूरत है । सभी खरगोश प्रयोगों के अनुसार ARVO (दृष्टि और नेत्र विज्ञान में अनुसंधान के लिए एसोसिएशन) नेत्र और विजन अनुसंधान में पशुओं के उपयोग के लिए बयान, विश्वविद्यालय द्वारा प्रयोगशाला पशु प्रोटोकॉल के अनुमोदन के बाद प्रदर्शन किया गया उपयोग और जानवरों की देखभाल पर समिति (UCUCA) मिशिगन विश्वविद्यालय के (प्रोटोकॉल PRO00006486, PI Yannis Paulus) ।

1. सिस्टम विन्यास

  1. Photoacoustic माइक्रोस्कोपी (पाम)
    1. पाम के प्रकाश स्रोत के रूप में एक डायोड पंप ठोस राज्य लेजर द्वारा पंप एक ऑप्टिकल पैरामीट्रिक थरथरानवाला (ओपो) लेजर का प्रयोग करें । जैसे नाड़ी पुनरावृत्ति दर 1 kHz, पल्स अवधि 3-6 एनएस, और स्वरित्र तरंग दैर्ध्य रेंज ४०५-२६०० एनएम के रूप में उचित तकनीकी विनिर्देशों, का चयन करें ।
    2. दो से ५७० एनएम पर लेजर से उत्पंन बीम प्रतिबिंबित (M1 और M2), तो यह एक आधा लहर प्लेट क्षीणन के माध्यम से पारित एक मोटर चालित रोटेशन मंच पर घुड़सवार, और अंत में ध्यान केंद्रित, फिल्टर, और यह एक बीम संधानक द्वारा collimate (चित्रा 1) । बीम संधानक के डिजाइन का अनुकूलन । बीम संधानक का एक उदाहरण विन्यास एक ध्यान केंद्रित लेंस L1 (फोकल लंबाई २५० मिमी), एक pinhole (व्यास ५० µm), और एक collimating लेंस L2 (फोकल लंबाई 30 मिमी) भी शामिल है ।
    3. एक बीम अलगानेवाला द्वारा collimated बीम विभाजन (BS1) 90/10 के एक विभाजन के अनुपात के साथ (प्रतिबिंब/ पल्स करने वाली पल्स लेजर ऊर्जा की निगरानी के लिए एक photodiode द्वारा प्रेषित भाग रिकॉर्ड । क्रमिक एक दर्पण (एम 3) और एक dichroic मिरर (डीएम) और रैस्टर-यह एक दो आयामी गैल्वेनोमीटर का उपयोग कर स्कैन द्वारा प्रतिबिंबित भाग से ध्यान हटाने । गैल्वेनोमीटर वर्णक्रमीय डोमेन (SD)-OCT सिस्टम के साथ एक साझा घटक है (नीचे वर्णित) ।
    4. एक एक स्कैन लेंस से बना दूरबीन के माध्यम से स्कैन बीम उद्धार (फोकल लंबाई ३६ मिमी) और एक नेत्र लेंस (राजभाषा, फोकल लंबाई 10 मिमी) और अंत में यह fundus पर खरगोश आंख प्रकाशिकी द्वारा ध्यान केंद्रित ।
    5. उचित तकनीकी विनिर्देशों के साथ एक सुई के आकार का अल्ट्रासोनिक transducer का चयन करें, उदाहरण के लिए, केंद्र आवृत्ति 27 मेगाहर्ट्ज, दो तरह − 6 dB बैंडविड्थ ६०% । यह केंद्रीय दृश्य धुरी बंद कंजाक्तिवा के साथ संपर्क में जगह उत्तेजित photoacoustic संकेत पर कब्जा ।
    6. एक अल्ट्रासोनिक एम्पलीफायर (उदाहरण के लिए, लाभ ५७ dB) का उपयोग कर संकेत बढ़ाना, यह एक कम पास फिल्टर द्वारा फिल्टर (उदाहरण के लिए, कटऑफ आवृत्ति ३२ मेगाहर्ट्ज), और एक नमूना दर पर एक उच्च गति डिजिटलर द्वारा यह अंकीयकरण २०० MS/
    7. खरगोश आंख के ऊपर एक बिजली मीटर प्लेस और खरगोश कॉर्निया पर लेजर पल्स ऊर्जा को मापने के लिए यह ANSI सुरक्षा सीमा १६० एनजे पर ५७० एनएम३८नीचे रखने के लिए । बीम ब्लॉक एक लेजर शटर एक तुल्यकालन इलेक्ट्रॉनिक्स के माध्यम से Matlab से नियंत्रित का उपयोग लेजर जोखिम से बचने के लिए ।
    8. एक डाटा अधिग्रहण (DAQ) बोर्ड के माध्यम से लेजर, गैल्वेनोमीटर, और डिजिटलर सिंक्रनाइज़ करें । प्रोग्राम Matlab में सिस्टम नियंत्रण और डेटा प्राप्ति के लिए सॉफ़्टवेयर ।
  2. वर्णक्रमीय-डोमेन ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी (एसडी-OCT)
    1. स्कैन लेंस (SL) और संदर्भ बांह (चित्रा 1) में फैलाव मुआवजा ग्लास (DCG) का एक टुकड़ा के बाद एक नेत्र लेंस (राजभाषा) जोड़कर एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रणाली के आधार पर एसडी-OCT प्रणाली अनुकूलन । संशोधन सक्षम बनाता है कि अक्टूबर प्रणाली खरगोश आंख के पीछे खंड छवि कर सकते हैं ।
    2. नमूना बांह की ऑप्टिकल पथ लंबाई के साथ अपने मैच को सुनिश्चित करने के लिए संदर्भ हाथ की लंबाई को समायोजित करने के लिए एक ज़ूम आवास ट्यूब का प्रयोग करें । एक आईरिस का प्रयोग करें रेट्रो परिलक्षित संदर्भ प्रकाश की तीव्रता को नियंत्रित करने के लिए खरगोश fundus से वापस बिखरे हुए प्रकाश की तीव्रता के साथ अपने मैच सुनिश्चित करने के लिए अधिकतम छवि कंट्रास्ट प्राप्त ।
    3. एक प्रदीप्ति प्रकाश उत्सर्जक डायोड के साथ एक बाहरी रोशनी स्रोत (एलईडी) के साथ खरगोश fundus के वास्तविक समय दृश्य के लिए स्कैन सिर में समझाया एक आरोप-युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरा रोजगार ।

2. सिस्टम संरेखण

  1. गैल्वेनोमीटर की स्थिति शुरू करने और फाइबर संधानक माउंट और beamsplitter घन के शिकंजा समायोजित करके OCT प्रणाली संरेखित करें ।
    नोट: कदम दर कदम प्रक्रियाओं वाणिज्यिक अधिग्रहीत OCT प्रणाली के मैनुअल में उपलब्ध है और यहां शामिल नहीं किया जाएगा । यह कदम मुख्य रूप से फाइबर संधानक के सही संरेखण सुनिश्चित करने के लिए है, संदर्भ हाथ, और स्कैन लेंस OCT प्रणाली के प्रदर्शन को अधिकतम करने के लिए ।
  2. ध्यान केंद्रित लेंस के ध्यान के आसपास pinhole के एक्स, वाई, और जेड की स्थिति को समायोजित करने के लिए विशेष रूप से लेजर बीम बाहर फिल्टर और अधिक से अधिक लेजर ऊर्जा संचारित । लेजर बीम की ऊंचाइयों की जांच करने से पहले और बाद pinhole एक ऊंचाई माप उपकरण का उपयोग कर सुनिश्चित करें कि वे एक ही हैं ।
  3. झुकाव, केंद्र, और collimating लेंस L2 के z स्थिति को समायोजित करने के लिए फ़िल्टर्ड बीम collimate । यह सुनिश्चित करें कि बीम लगभग एक ही आकार और ऊंचाई है जब पास के मैदान और सुदूर क्षेत्र में मनाया ।
  4. सह-अक्षीय दर्पण और डीएम के झुकाव को ट्यूनिंग द्वारा पाम लेजर बीम और OCT प्रकाश बीम गठबंधन । इस कदम के बाद, पाम लेजर और OCT प्रकाश पूरी तरह से संपाती होना चाहिए और खरगोश fundus पर स्कैनिंग क्षेत्र ही हैं ।
  5. झुकाव और राजभाषा लेंस के केंद्र को समायोजित करने के लिए सही ढंग से यह ऑप्टिकल पथ में संरेखित करें । एक बार किया, दोहरे-मोडल प्रणाली इमेजिंग के लिए तैयार है ।
    नोट: एक ऑटो collimation विधि का उपयोग करने के लिए इस हासिल कर सकते हैं, अर्थात्, वापस प्रकाश की जांच-राजभाषा लेंस की सतह से परिलक्षित सुनिश्चित करें कि यह घटना प्रकाश के रूप में उसी तरह के साथ वापस चला जाता है ।

3. खरगोश की तैयारी

  1. पशु सुविधा से एक ंयूजीलैंड सफेद खरगोश ले लो और इस तरह के शरीर के वजन और पशु संख्या के रूप में व्यक्तिगत जानकारी, रिकॉर्ड ।
  2. माउंट खरगोश प्लेटफार्मों, शरीर का समर्थन और इमेजिंग प्रणाली के नीचे ऑप्टिकल मेज पर सिर समर्थन भी शामिल है । शरीर के समर्थन पर एक पानी परिसंचारी हीटिंग कंबल रखो और ३८ डिग्री सेल्सियस के लिए परिचालित पानी के तापमान सेट करने में मदद प्रयोग और वसूली की अवधि के लिए खरगोश गर्म के शरीर के तापमान रखने के लिए ।
  3. समग्र पशु राज्य, श्लेष्मा झिल्ली का रंग, हृदय गति, श्वसन दर, और मलाशय के शरीर के तापमान सहित पूर्व प्रक्रिया महत्वपूर्ण है, रिकॉर्ड. Anesthetize ketamine (४० मिलीग्राम/किग्रा) और xylazine (5 मिलीग्राम/इंट्रामस्क्युलर (आईएम) इंजेक्शन के माध्यम से और ketamine (अनुसूची III नियंत्रित पदार्थ) का उपयोग रिकॉर्ड के मिश्रण के साथ खरगोश । अपने दिल की दर, श्वसन दर, और समग्र राज्य की जाँच करके संज्ञाहरण स्तर की पुष्टि करें ।
  4. एक बूंद का उपयोग खरगोश विद्यार्थियों का फैलाव Tropicamide 1% नेत्र और phenylephrine हाइडरोक्लॉराइड २.५% नेत्र ।
  5. एक वीक्षक का उपयोग करने के लिए रास्ते से बाहर पलकें पकड़ और आंख स्नेहक की एक बूंद लागू करने के लिए कॉर्निया गीला । आंख में सामयिक Tetracaine ०.५% की एक बूंद टपकाना इमेजिंग प्रक्रिया से पहले ।
    नोट: पशु के लिए संभव असुविधा के साथ अब प्रक्रियाओं या प्रक्रियाओं के लिए, खरगोश पशु आराम सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग से पहले meloxicam के एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन दे ।

4. SD-OCT इमेजिंग

  1. एक नैदानिक fundus कैमरे के इमेजिंग मंच के लिए खरगोश स्थानांतरण और अक्टूबर इमेजिंग सत्र से पहले ५० डिग्री fundus, रेड फ्री, और autofluorescence छवियों ले । यह आंखों की ऑप्टिकल पारदर्शिता की जांच में मदद करता है और ऐसे ऑप्टिक तंत्रिका और दिमाग़ी रे रेटिना vasculature के रूप में fundus पोत आकृति विज्ञान और स्थलों, पहचान ।
  2. अक्टूबर प्रणाली के मंच के लिए खरगोश स्थानांतरण और मोटे तौर पर एक राजभाषा के तहत आंखों की स्थिति के लिए अपनी मुद्रा समायोजित करें । एलईडी लाइट का उपयोग कर आंख रोशन ।
    नोट: तकनीक के नैदानिक अनुवाद की सुविधा के लिए, खरगोश आंखों किसी भी अन्य तरीकों का उपयोग कर स्थिर नहीं कर रहे हैं और खरगोश सिर सिर्फ किसी भी निर्धारण के बिना सिर समर्थन पर डाल दिया है.
  3. OCT सॉफ्टवेयर खोलें और पहले fundus की सीसीडी कैमरा छवि की जांच करें । ऊंचाई और सिर समर्थन के कोण को समायोजित अगर हितों के क्षेत्र (ROIs), धमनियां वाहिकाओं और रेटिना वाहिकाओं के रूप में सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है, कैमरे के देखने के क्षेत्र (FOV) के भीतर हैं ।
    नोट: यदि खरगोश एक अच्छा संज्ञाहरण स्तर के तहत है, एक अनुक्रमिक इमेजिंग सत्र के रूप में लंबे समय के रूप में के रूप में 10 मिनट पुनः की आवश्यकता के बिना पिछले कर सकते है खरगोश सिर समायोजन ।
  4. एक सीधी रेखा ड्रा OCT बी का प्रतिनिधित्व करने के लिए ब्याज की स्कैन और स्कैनिंग शुरू करते हैं । संदर्भ हाथ लंबाई को समायोजित oct छवि कल्पना और oct सॉफ्टवेयर में फैलाव क्षतिपूर्ति कारक अनुकूलन करने के लिए तेज छवियों को मिलता है ।
    नोट: जब संदर्भ बांह लंबाई समायोजित, दो प्रतिबिंबित अक्टूबर छवियां एक के बाद एक दूसरे को दिखाई देगा । सही छवि fundus शरीर रचना विज्ञान के पूर्व ज्ञान के आधार पर प्रतिष्ठित किया जा सकता है ।
  5. डेटा प्राप्ति पैरामीटर्स सेट करें, जैसे पिक्सेल और औसत की संख्या, और छवियां सहेजें ।
  6. श्वसन दर और खरगोश की हृदय गति संज्ञाहरण स्तर और पशु आराम का अनुमान लगाने के लिए निरीक्षण । अब सत्र के लिए, पूरक ketamine या सांस isoflurane की एक तिहाई खुराक endotracheal इंटुबैषेण, एक वी जेल, या एक चेहरा मुखौटा संज्ञाहरण के विमान को बनाए रखने के लिए जब आवश्यक के साथ विचार किया जा सकता है ।
  7. corneal सतह निर्जलीकरण और corneal सतही कबरा उपकला keratopathy को रोकने के प्रयोग के दौरान हर 2 मिनट बहाना के साथ खरगोश कॉर्निया कुल्ला । मॉनिटर और रिकॉर्ड पशु जीवन हर 15 मिनट ।

5. पाम इमेजिंग

  1. उपयुक्त लेजर सुरक्षा चश्मे पहनें और ओपो लेजर पर बारी ।
  2. पाम नियंत्रण सॉफ्टवेयर शुरू, लक्षित chromophores के अवशोषण चोटियों में से एक को लेजर तरंग दैर्ध्य धुन (जैसे, ५७० हीमोग्लोबिन के लिए एनएम), गैल्वेनोमीटर की स्थिति प्रारंभ, और खरगोश कॉर्निया से पहले लेजर ऊर्जा की निगरानी सुनिश्चित करने के लिए कि यह ANSI सुरक्षा सीमा के नीचे है ।
  3. एक तीन आयामी (3 डी) अनुवाद मंच पर अल्ट्रासोनिक transducer माउंट और fundus की ओर इशारा करते हुए खरगोश कंजाक्तिवा के साथ संपर्क में transducer टिप की स्थिति । बेहतर जोड़ी के लिए आंख स्नेहक की एक बूंद का प्रयोग करें transducer टिप और खरगोश कंजाक्तिवा ।
  4. एलईडी रोशनी प्रकाश पर बारी और Matlab सॉफ्टवेयर के माध्यम से खरगोश fundus कल्पना ।
  5. स्कैनिंग रॉय (या तो रेटिना वाहिकाओं या धमनियां वाहिकाओं), केंद्र और भौतिक आकार सहित सेट करें । लेजर शटर खोलें और बीम का बी-स्कैन शुरू करें । मोटे तौर पर transducer संरेखित करके, एक आस्टसीलस्कप पर पता लगाया photoacoustic संकेत देखने में सक्षम होना चाहिए । यदि नहीं, तो थोड़ा कॉर्निया के एक अलग क्षेत्र को स्कैन या दूसरी आंख के लिए स्विच और ऊपर प्रक्रियाओं दोहराने के लिए आंख की स्थिति को समायोजित करें ।
  6. आस्टसीलस्कप पर पाया photoacoustic संकेत निरीक्षण और पतले पूरे बी स्कैन के साथ संकेत तीव्रता को अधिकतम करने के लिए transducer स्थिति धुन ।
    नोट: सीमित बीम चौड़ाई के कारण, अल्ट्रासोनिक transducer आमतौर पर एक छोटा सा FOV४१है । इस कदम के अंतिम पाम छवियों की पृष्ठभूमि मॉडुलन निर्धारित करता है । ग़लत संरेखण विषम पृष्ठभूमि और नीचा छवि गुणवत्ता के साथ पाम छवियों को बहुत ले जाएगा ।
  7. डेटा प्राप्ति पैरामीटर सेट करें । इसमें पिक्सेल की संख्या (उदा, 256 × 256 पिक्सेल), नमूना दर (उदा., २०० MS/, और समय में देरी शामिल है । डेटा प्राप्ति प्रारंभ करें । Matlab सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से शटर खोलने के लिए लेजर बीम जब पास शुरू कर दिया और शटर बंद करने के लिए बीम जब लेजर जोखिम से बचने के लिए समाप्त हो जाएगा ।
    नोट: पल्स पुनरावृत्ति दर (1 kHz) लेजर के द्वारा सीमित है, यह के बारे में 1 मिनट लेता है २५६ × २५६ पिक्सल के साथ एक छवि के डेटा अधिग्रहण खत्म ।
  8. कच्चे डेटा की प्रक्रिया और volumetric प्रतिपादन३८के माध्यम से अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण (मिप)13 या 3 डी में के माध्यम से दो आयामों (2d) में पाम छवि कल्पना ।
  9. unmount अल्ट्रासोनिक transducer, कुल्ला पानी का उपयोग टिप, और इसे वापस भंडारण मामले में डाल दिया ।
  10. fundus कैमरे के लिए खरगोश स्थानांतरण और फिर से fundus की जांच । यह चरण इमेजिंग सत्र के बाद fundus के किसी भी रूपात्मक परिवर्तन हैं या नहीं, यह जाँच करने में मदद करता है ।
  11. corneal सतह निर्जलीकरण और keratopathy को रोकने के लिए प्रयोग के दौरान हर दो मिनट बहाना के साथ खरगोश कॉर्निया कुल्ला । मॉनिटर और रिकॉर्ड पशु जीवन हर 15 मिनट ।
    नोट: पाम, अक्टूबर, और fundus इमेजिंग सत्र लगभग 1 एच ले ।

6. पोस्ट इमेजिंग

  1. fundus कैमरे का उपयोग कर fundus पुनः परीक्षा के बाद, अगर कनेक्ट वी जेल डिस्कनेक्ट । बहाना का उपयोग कर आंख कुल्ला, लागू flurbiprofen नेत्र और निओमायसिन और polymyxin बी सल्फेट और डेक्समेतएसॉनी नेत्र मरहम, और आंख बंद करो ।
  2. एक ठीक चैंबर के लिए पानी परिचालित कंबल के साथ खरगोश हस्तांतरण । प्रकाश से बॉक्स ढाल और खरगोश स्वाभाविक रूप से जाग जब तक इंतजार । इस अवधि के दौरान, निगरानी पशु हर 15 मिनट के लिए महत्वपूर्ण है और रिकॉर्ड रखने के लिए और रिकॉर्डकीपिंग के लिए पशु सुविधा के लिए एक प्रति वापस ।
  3. एक बार खरगोश जाग और सक्रिय है, चेतावनी और सामांय रूप से चलने, यह पशु सुविधा के लिए वापस परिवहन । यदि एक तीव्र प्रयोग की योजना बनाई है, euthanize पशु इच्छामृत्यु समाधान का उपयोग कर (उदा, Beuthanasia, ०.२२ मिलीलीटर/किग्रा, सीमांत कान की नस में नसों में इंजेक्शन) और लोथ के निपटान ।
  4. सॉफ्टवेयर और लेजर बंद कर दें । ऑप्टिकल बेंच को साफ करे ।

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Representative Results

दोहरे मोडल इमेजिंग प्रणाली और प्रायोगिक प्रोटोकॉल का सफलतापूर्वक परीक्षण किया गया है लेखकों की प्रयोगशाला में चार ंयूजीलैंड सफेद खरगोश का उपयोग कर । निंनलिखित कुछ प्रतिनिधि परिणाम दिखाता है ।

चित्रा 1 पाम और एसडी अक्टूबर दोहरी-मोडल इमेजिंग प्रणाली की योजनाबद्ध दिखाता है । photoacoustic प्रकाश स्रोत, चर लेजर क्षीणन, बीम संधानक, ऊर्जा मीटर, स्कैन सिर, photoacoustic का पता लगाने और अधिग्रहण मॉड्यूल, अक्टूबर इकाई, और तुल्यकालन इलेक्ट्रॉनिक्स: यह निम्नलिखित मॉड्यूल से बना है । विस्तृत सिस्टम कॉन्फ़िगरेशन खंड १.१ में आइटम हैं ।

चित्रा 2 खरगोश की विशिष्ट इमेजिंग परिणाम को दर्शाता है धमनियां vasculature दोहरे-मोडल इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर प्राप्त की । चित्र 2 (क) एक fundus तस्वीर दिखा रहा है कि धमनियां जहाजों खरगोश fundus के अधिकांश भागों में फैले हुए है जबकि रेटिना वाहिकाओं दिमाग़ी रे भीतर सीमित हैं । चित्र 2 (ख) एक ठेठ पाम fundus तस्वीर के भीतर धमनियां vasculature दिखा छवि है । उच्च पार्श्व संकल्प में धमनियां रक्त वाहिकाओं delineated थीं । चित्र 2 (ग) एक अक्टूबर बी स्कैन fundus शरीर रचना विज्ञान को देखने के लिए हासिल की छवि है और धमनियां वाहिकाओं की उपस्थिति की पुष्टि करता है । रेटिना, रंजित, और श्वेतपटल रेटिना वर्णक उपकला (RPE) परत नीचे धमनियां वाहिकाओं के साथ एक उच्च अक्षीय संकल्प के साथ visualized किया जा सकता है ।

चित्रा 3 दर्शाता है खरगोश रेटिना vasculature के विशिष्ट इमेजिंग परिणाम दोहरे-मोडल इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर प्राप्त किया । आंकड़े 3 (ए) और 3 (ख) 2 डी मिप और 3 डी volumetric, क्रमशः पाम द्वारा प्राप्त रेटिना वाहिकाओं के प्रतिपादन कर रहे हैं । चित्र 3 (c) 3d छवि के ओर्थोगोनल स्लाइस दिखाता है. परिणाम बताते है कि पाम भी व्यक्तिगत रेटिना वाहिकाओं, जो RPE परत के ऊपर झूठ कल्पना सकता है, और पुष्टि करता है कि रेटिना वाहिकाओं और धमनियां जहाजों अलग गहराई पर हैं । चित्र 3 (घ) एक इसी अक्टूबर बी-स्कैन छवि, व्यक्तिगत रेटिना वाहिकाओं और तंत्रिका फाइबर परत (एनएफएल) के पार वर्गों दिखा दिखाता है ।

Figure 1
चित्र 1। एकीकृत photoacoustic माइक्रोस्कोपी और ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी दोहरे-मोडल इमेजिंग प्रणाली की योजनाबद्ध । ओपो: ऑप्टिकल पैरामीट्रिक थरथरानवाला; बी एस: बीम अलगानेवाला; पीडी: photodiode; एम: दर्पण; DM: dichroic मिरर; SL: स्कैन लेंस; राजभाषा: नेत्र लेंस; SMF: एकल-मोड फाइबर; DCG: फैलाव मुआवजा गिलास; सीसीडी: चार्ज-युग्मित डिवाइस । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2। पाम और अक्टूबर दोहरी-खरगोश में धमनियां रक्त वाहिकाओं के-मोडल इमेजिंग । (क) Fundus तस्वीर दिखा रहा है कि धमनियां वाहिकाओं (सीवी) पूरे Fundus में फैले जबकि रेटिना वाहिकाओं (RVs) दिमाग़ी रे भीतर सीमित कर रहे हैं के बाद से खरगोश जानवरों merangiotic हैं । (ख) पाम सी-कि पाम उच्च पार्श्व संकल्प पर सीवी चित्रित कर सकते है दिखा सीवी की छवि स्कैन । (ग) अक्टूबर बी स्कैन छवि खरगोश fundus और धमनियां वाहिकाओं के अक्षीय स्थिति की संरचनात्मक संरचना दिखा । GCL: नाड़ीग्रंथि सेल परत; आईएनएल: भीतरी परमाणु परत; IPL: इनर plexiform लेयर; केव: बाहरी परमाणु परत; OPL: बाहरी plexiform परत; OLM: बाहरी सीमित झिल्ली; ईज़ी: ellipsoid जोन; MZ: myoid जोन; ओएस: बाहरी क्षेत्र; बीएम, Bruch की झिल्ली; IZ: प्रतिअंक क्षेत्र३८। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3। पाम और अक्टूबर दोहरी-खरगोश में रेटिना रक्त वाहिकाओं के मोडल इमेजिंग । (क) पाम सी-RVs और सीवी की छवि स्कैन । (ख) पाम छवि के 3d volumetric प्रतिपादन । (ग) 2 डी ओर्थोगोनल पाम छवि के स्लाइसें दिखा रहा है कि RVs और सीवी अलग गहराई पर हैं । (घ) अक्टूबर बी-स्कैन RVs, एनएफएल, और श्वेतपटल३८illustrating छवि । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

एक बरकरार और नियमित रूप से आंसू फिल्म उच्च गुणवत्ता fundus छवियों के लिए आवश्यक है । एक अनियमित और बिगड़ा हुआ आंसू फिल्मों काफी छवि गुणवत्ता४२नीचा कर सकते हैं । आंसू फिल्म की अखंडता को बनाए रखने और corneal सतही कबरा keratopathy को रोकने के लिए, यह कॉर्निया चिकनाई के लिए महत्वपूर्ण है बहाना का उपयोग कर बहुत बार, लगभग हर दो मिनट । अगर कोई आंख की अस्पष्टता के बारे में चिंता कर रहे हैं, एक भट्ठा लैंप और fluorescein स्ट्रिप्स का उपयोग करने के लिए कॉर्निया शर्तों की जांच ।

कई कठिनाइयों बड़े जानवरों की आंखों के पीछे खंड इमेजिंग के लिए उपस्थित हो सकता है, विशेष रूप से उच्च आवृत्ति घटकों के लिए दूरी के साथ photoacoustic संकेत क्षीणन, corneal निर्जलीकरण, और ऑप्टिकल विचलन सहित. Photoacoustic संकेत आयाम आमतौर पर सुई के आकार का अल्ट्रासोनिक transducer द्वारा पता लगाया जा रहा से पहले महत्वपूर्ण क्षीणन अनुभव करता है । बड़ी गोलक का आकार, अधिक से अधिक क्षीणन । खरगोश की गोलक आकार (~ 18.1 mm) के बारे में तीन बार है कि चूहों की तुलना में बड़ा है और छह बार चूहों की तुलना में बड़ा है, जो खरगोश आंख इमेजिंग विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण बनाता है । उचित इमेजिंग गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए, एक छोटे व्यास के साथ एक लेज़र बीम (इस अध्ययन में बीम संधानक के बाद 2 मिमी) और collimated wavefront (आदर्श planar wavefront) पसंद किया जाता है क्योंकि यह न्यूनतम आंतरिक ऑप्टिकल विचलन से प्रभावित हो जाएगा कॉर्निया और अच्छी तरह से रेटिना पर ध्यान केंद्रित किया जा सकता है । लेजर एक्सपोजर खुराक को कम करने और छवि संकल्प में सुधार लाने के मामले में यह बिंदु महत्वपूर्ण महत्व का है । इसके अलावा, एक केंद्र आवृत्ति के साथ एक अल्ट्रासोनिक transducer के बजाय एक उच्च केंद्र आवृत्ति प्रयोगात्मक परिणाम इंगित करता है कि यह इस दूरी पर अधिक से अधिक अल्ट्रासाउंड संकेत है की वजह से ।

जबकि अक्टूबर और OCTA अच्छी तरह से स्थापित कर रहे है प्रौद्योगिकियों के लिए क्लिनिक में प्रयुक्त संरचनात्मक और कार्यात्मक आंखों की इमेजिंग, उनके आणविक इमेजिंग क्षमता के विपरीत तंत्र के कारण सीमित है४३। पाम एक उभरती हुई आंख इमेजिंग नेत्र ऊतक के ऑप्टिकल अवशोषण इसके विपरीत पर आधारित साधन है । यह अंतर्जात और exogenous chromophores के प्रति संवेदनशील है, जैसे हीमोग्लोबिन, मेलेनिन, और बाह्य-administrated कन्ट्रास्ट एजेंटों. संवहनी संरचना visualizing इस काम में प्रदर्शन किया पाम के कई आवेदनों में से एक है । अंय महत्वपूर्ण अनुप्रयोगों में शामिल है कार्यात्मक और आणविक इमेजिंग, जैसे रक्त प्रवाह की गति का पता लगाने, हीमोग्लोबिन एकाग्रता ठहराव, ऑक्सीजन संतृप्ति मानचित्रण, और के pathophysiology का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है जो अगोचर दृश्य एक रेटिना संवहनी रोगों के असंख्य, मधुमेह रेटिनोपैथी सहित, धब्बेदार अध-पतन, रेटिना नस occlusions, रेटिना धमनी occlusions, सिकल सेल रेटिनोपैथी, और माना नेत्र histoplasmosis, कुछ नाम के लिए. इसके अलावा, पाम अक्टूबर से अधिक पैठ गहराई है, जो यह कुछ धमनियां रोगों के अध्ययन के लिए उपयुक्त बनाता है, polypoidal धमनियां vasculopathy, केंद्रीय तरल chorioretinopathy, pachychoroid रोगों, और धमनियां neovascularization के रूप में । इन परिप्रेक्ष्यों से, पाम अक्टूबर और OCTA के लिए उपयोगी पूरक जानकारी प्रदान करने के लिए भविष्य में नेत्र रोगों का एक और अधिक व्यापक मूल्यांकन देने में सक्षम हो सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम राष्ट्रीय नेत्र संस्थान 4K12EY022299 (YMP) के उदार समर्थन द्वारा समर्थित किया गया था, दृष्टि के लिए लड़ो-इंटरनेशनल रेटिना रिसर्च फाउंडेशन FFS GIA16002 (YMP), दृष्टिहीनता को रोकने के लिए अनुसंधान से अप्रतिबंधित विभागीय समर्थन, और विश्वविद्यालय नेत्र विज्ञान और दृश्य विज्ञान के मिशिगन विभाग के । यह काम विजन राष्ट्रीय नेत्र संस्थान से P30 EY007003 द्वारा वित्त पोषित अनुसंधान के लिए कोर सेंटर का उपयोग किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dual-modality imaging system
OPO laser Ekspla (Vilnius, Lithuania) NT-242
Beam attenuator Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) AHWP10M-600
Motorized rotation stage Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) PRM1/MZ8
Motorized rotation stage controller Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) TDC001
Focusing lens Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) AC254-250-B
Pinhole Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) P50S
Collimating lens Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) AC127-030-B
Photodiode Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) PDA36A 
Laser shutter Vincent Associates Inc. (Toronto, Canada) LS6S2T0
Laser shutter driver Vincent Associates Inc. (Toronto, Canada) VCM-D1
Dichroic mirror Semrock, Inc. (Rochester, NY, USA) Di03-R785-t3-25×36
Scan lens Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) OCT-LK3-BB
Ophthalmic lens Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) AC080-010-B-ML
Ultrasonic transducer Optosonic Inc. (Arcadia, CA, USA) Custom
Amplifier L3 Narda-MITEQ (Hauppauge, NY, USA) AU-1647
Band-pass filter Mini-Circuits (Brooklyn, NY, USA) BLP-30+
Digitizer DynamicSignals LLC (Lockport, IL, USA) PX1500-4 
Synchronization electronics National Instruments Corporation (Austin, TX, USA) USB-6353
OCT module Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) Ganymede-II-HR
Dispersion compensation glass Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) LSM03DC
Illumination LED light Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) MCWHF2 
Power meter Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) S121C 
Power meter interface Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) PM100USB 
Height measurement tool  Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) BHM1
Fundus camera Topcon Corporation (Tokyo, Japan)  TRC 50EX
Matlab MathWorks (Natick, MA, USA) 2017a
Oscilloscope Teledyne LeCroy (Chestnut Ridge, NY, USA) WaveJet 354T
Animal experiment
Water-circulating blanket Stryker Corporation (Kalamazoo, MI, USA) TP-700
Ketamine hydrochloride injection Par pharmaceutical, Inc. (Woodcliff Lake, NJ, USA) NDC code 42023-115-10
Xylazine hydrochloride VetOne (Boise, ID, USA) NDC code 13985-704-10
Tropicamide ophthalmic Akorn Pharmaceuticals Inc. (Lake Forest, IL, USA) NDC code 17478-102-12
Phenylephrine hydrochloride ophthalmic Paragon BioTeck, Inc. (Portland, OR, USA) NDC code 42702-102-15
Eye lubricant Hub Pharmaceuticals LLC (Rancho Cucamonga, CA, USA) NDC code 17238-610-15
Eyewash Altaire Pharmaceuticals, Inc. (Aquebogue, NY, USA) NDC code 59390-175-18
Tetracaine hydrochloride ophthalmic solution Bausch & Lomb, Inc. (Rochester, NY, USA) NDC code 24208-920-64
Flurbiprofen sodium ophthalmic solution Bausch & Lomb, Inc. (Rochester, NY, USA) NDC code 24208-314-25
Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Dexamethasone Ophthalmic Ointment Bausch & Lomb, Inc. (Rochester, NY, USA) NDC code 24208-795-35
Meloxicam injection Henry Schein Inc. (Queens, NY, USA) NDC code 11695-6925-1

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References

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Tian, C., Zhang, W., Nguyen, V. P., Wang, X., Paulus, Y. M. Novel Photoacoustic Microscopy and Optical Coherence Tomography Dual-modality Chorioretinal Imaging in Living Rabbit Eyes. J. Vis. Exp. (132), e57135, doi:10.3791/57135 (2018).

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