Summary
Ce manuscrit décrit la nouvelle configuration et consignes d’utilisation de la microscopie photoacoustique et système de double-modalité tomographie par cohérence optique pour l’imagerie non invasive et sans étiquette Chorio-rétinienne de grands animaux, tels que les lapins.
Abstract
Photoacoustique imagerie oculaire est une émergence ophtalmique technologie qui peut visualiser une façon non envahissante de tissus oculaires en convertissant l’énergie lumineuse en ondes sonores et est actuellement à l’étude intensive de l’image. Cependant, les plus signalés à ce jour se concentre sur l’imagerie du segment postérieur des yeux des petits animaux, comme les rats et les souris, qui pose des défis pour la traduction humaine clinique en raison des tailles petit globe oculaire. Ce manuscrit décrit une microscopie photoacoustique roman (PAM) et le système de double-modalité de tomographie par cohérence optique pour l’imagerie du segment postérieur des yeux des grands animaux, tels que des lapins. La configuration du système, alignement du système, préparation animaux et dual-modalité protocoles expérimentaux pour in vivo, non invasive et sans étiquette Chorio-rétinienne d’imagerie chez les lapins sont détaillées. L’efficacité de la méthode est démontrée par les résultats expérimentaux représentatifs, dont la vascularisation rétinienne et choroïdienne obtenue par le PAM et les PTOM. Ce manuscrit fournit un guide pratique pour reproduire les résultats de l’imagerie chez le lapin et l’avancement photoacoustique imagerie oculaire chez les animaux plus gros.
Introduction
Ces dernières décennies ont vu le développement explosif du champ de photoacoustique biomedical imagerie1,2,3,4,5,6,7 ,,8. Basé sur la conversion de l’énergie de la lumière en son, l’imagerie photoacoustique émergents peuvent visualiser des échantillons biologiques à échelles des organelles, cellules, tissus, organes de petits animaux tout le corps et peut révéler sa anatomiques, fonctionnelles, moléculaires, génétiques, et information métabolique1,2,9,10,11,12. L’imagerie photoacoustique a trouvé des applications dans une gamme de domaines biomédicaux, comme cell biology13,14, biologie vasculaire15,16, neurologie17,18 , oncologie19,20,21,22,23de la dermatologie, pharmacologie24et hématologie25,26. Son application en ophtalmologie, c'est-à-dire photoacoustique oculaire imaging, a attiré des intérêts substantiels à la fois scientifiques et cliniciens et est actuellement à l’étude active.
Contrairement aux couramment utilisé oculaire d’imagerie technologies27, tels que l’angiographie à la fluorescéine (FA) et angiographie de vert d’indocyanine (ICGA) (basé sur le contraste de fluorescence), tomographie à cohérence optique (OCT) (basé sur le contraste de la dispersion des optiques) et ses dérivé angiographie OCT (basé sur le contraste de la motion des globules rouges), photoacoustique oculaire d’imagerie d’absorption optique utilise le mécanisme de contraste. Cela diffère des technologies d’imagerie oculaires classiques et offre un outil unique pour l’étude des propriétés d’absorption optique de le œil, qui sont généralement associées à l’État physiopathologique des tissus oculaires28. À ce jour, significative, excellent travail a été fait dans photoacoustique oculaire d’imagerie29,30,31,32,33,34,35, 36,37, mais ces études se concentrent sur le segment postérieur des yeux des petits animaux, comme les rats et les souris. Le pionnier dans l’étude bien démontre la faisabilité de l’imagerie photoacoustique en ophtalmologie, mais il y a encore un long chemin à parcourir vers la traduction clinique de la technologie depuis tailles de globe oculaire des rats et des souris sont beaucoup plus petits (moins d’un tiers) à celle de l’homme. En raison de la propagation des ondes ultrasoniques sur une beaucoup plus longues distances, signal intensité et qualité d’image peut grandement souffrir lorsque la technique est utilisée pour l’imagerie du segment postérieur de plus grands yeux.
Pour atteindre cet objectif, nous avons récemment rapporté les non invasive, imagerie exempte d’étiquette Chorio-rétinienne chez les lapins vivants à l’aide intégrée microscopie photoacoustique (PAM) et le domaine spectral OCT (SD-OCT)38. Le système a d’excellentes performances et peut visualiser la rétine et la choroïde des yeux des animaux plus gros absorption endogène et contrastes de diffusion des tissus oculaires. Chez les lapins, les résultats préliminaires montrent que la PAM pourrait distinguer non invasive de vaisseaux sanguins rétiniens et choroïdienne individuels à l’aide d’une dose d’exposition laser (80 ~ nJ) significativement inférieures à la limite de sécurité American National Standards Institute (ANSI) (160 nJ) à 570 nm39; et l’outil OPO pourrait résoudre clairement la sclérotique, la choroïde et différentes couches rétiniennes. C’est la toute première démonstration de l’imagerie du segment postérieur de plus grands animaux à l’aide du PAM et pourrait être une étape importante vers la traduction clinique de cette technologie étant donné que la taille du globe oculaire de lapins (18,1 mm)40 est près de 80 % de la longueur axiale de humains (23,9 mm).
Dans ce travail, nous fournir une description détaillée du système dual-modalité d’imagerie et des protocoles expérimentaux utilisés pour l’imagerie non invasive et sans étiquette Chorio-rétinienne chez les lapins vivants et démontrer les performances du système par le biais de rétine représentatif et résultats de l’imagerie choroïdienne.
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Protocol
Les lapins sont qu'un United States Department of Agriculture (USDA) a couvert les espèces. Son utilisation dans la recherche biomédicale doit suivre des règles strictes. Toutes les expériences de lapin ont été effectuées conformément à la déclaration de l’ARVO (The Association for Research in Vision and Ophthalmology) pour l’utilisation des animaux en ophtalmique et Vision Research, après l’approbation du protocole animal de laboratoire de l’Université Comité sur l’utilisation et aux soins des animaux (UCUCA) de l’Université du Michigan (protocole PRO00006486, Yannis Paulus PI).
1. configuration du système
- Microscopie photoacoustique (PAM)
- Utilisation d’un oscillateur paramétrique optique (OPO) laser pompé par un laser solide pompé par diode comme source lumineuse des spécifications techniques appropriées PAM. Select, tels que taux de répétition d’impulsion 1kHz, pouls Durée 3-6 ns et longueurs d’onde accordable 405-2600 nm.
- Réflexion du faisceau émane du laser à 570 nm par deux miroirs (M1 et M2), puis faire passer à travers un atténuateur de demi-onde plaque monté sur un filtre motorisé de platine de rotation et enfin mise au point et il collimater par un collimateur de faisceau (Figure 1). Optimiser la conception du collimateur de faisceau. Un exemple de configuration le collimateur faisceau comprend une lentille de focalisation L1 (longueur focale 250 mm), un trou d’épingle (diamètre 50 µm) et un collimateur L2 (longueur focale 30 mm).
- Diviser le faisceau collimaté par un séparateur de faisceau (BS1) avec un coefficient de fractionnement de 90/10 (réflexion/transmission). Enregistrer la partie transmise par une photodiode pour la surveillance de l’énergie pulse-pulse laser. Successivement dévier la partie réfléchie par un miroir (M3) et d’un miroir dichroïque (DM) et raster-scan à l’aide d’un galvanomètre à deux dimensions. Le galvanomètre est un composant partagé avec le domaine spectral (SD)-système d’OCT (décrit ci-dessous).
- Remettre le faisceau numérisé à travers un télescope composé d’une lentille de scan (longueur focale 36 mm) et une lentille ophtalmique (OL, focale 10 mm) et enfin le focus sur le fond de l’oeil par l’optique oeil de lapin.
- Sélectionnez un transducteur ultrasonore en forme d’aiguille avec spécifications techniques appropriées, par exemple, la fréquence centrale 27 MHz, bidirectionnel −6 dB bande passante 60 %. Placez-le au contact de la conjonctive hors l’axe visuel central pour capter le signal photoacoustique excité.
- Amplifier le signal à l’aide d’un amplificateur à ultrasons (par exemple, 57 dB de gain), il filtre par un filtre passe bas (par exemple, la fréquence de coupure 32 MHz) et il numériser par un numériseur haute vitesse à une fréquence d’échantillonnage de 200 MÉCH. / s.
- Place un wattmètre qui précède le lapin des yeux et mesure l’énergie d’impulsion laser sur la cornée de lapin pour le garder sous la sécurité ANSI limiter 160 nJ à 570 nm38. Bloquer le faisceau pour éviter une surexposition de laser à l’aide d’un obturateur de laser contrôlé à partir de Matlab par une électronique de synchronisation.
- Synchroniser le laser, le galvanomètre et le numériseur à travers une carte d’acquisition (DAQ) de données. Programmer le logiciel pour système contrôle et acquisition de données dans Matlab.
- Tomographie en cohérence optique spectral-domaine (SD-OCT)
- Adapter le système SD-OCT basé sur un système disponible dans le commerce en ajoutant une lentille ophtalmique (OL) après la lentille de scan (SL) et un morceau de verre de compensation de dispersion (DCG) dans le bras de référence (Figure 1). La modification permet que le système de l’OCT peut l’image du segment postérieur de l’oeil du lapin.
- Utiliser un tube de logement zoom pour ajuster la longueur du bras de référence afin d’assurer son match avec la longueur du trajet optique du bras de l’échantillon. Un iris permet de contrôler l’intensité de la lumière rétro-réfléchi de référence afin d’assurer son match avec intensité lumineuse éparpillés à l’arrière de le œil du lapin pour atteindre le contraste de l’image maximale.
- Utiliser une caméra de dispositif à couplage de charge (CCD) encapsulée dans la tête de balayage pour la visualisation en temps réel du fundus de lapin avec un éclairage diode électroluminescente (del comme source d’éclairage externe).
2. alignement du système
- Initialiser la position du galvanomètre et aligner le système OCT en ajustant les vis de la monture de collimateur de fibre et le cube de diviseur de faisceau.
Remarque : Les procédures détaillées sont disponibles dans le manuel du système OCT commercialement acquis et ne seront pas couverts ici. Cette étape est principalement d’assurer l’alignement correct du collimateur de la fibre, le bras de référence et l’objectif de balayage pour maximiser le rendement du système OCT. - Ajustez la position x, yet z de la sténopé autour de l’objet de la lentille de focalisation à filtrer dans l’espace le faisceau laser et transmettre au maximum l’énergie laser. Vérifiez la hauteur du faisceau laser avant et après le trou d’épingle à l’aide d’un outil de mesure de hauteur pour s’assurer qu’elles sont les mêmes.
- Ajuster les tilt, décentrer et la position z du collimateur L2 à collimater le faisceau filtré. Faire en sorte que le faisceau a environ de même taille et la hauteur observée dans le champ proche et le champ lointain.
- Coaxialement combiner le faisceau laser de PAM et le faisceau lumineux de l’OCT en syntonisant les inclinaisons du miroir et le SM. Après cette étape, PAM laser et lumière OCT devraient être entièrement coïncidentes et balayage des régions sur le œil du lapin sont les mêmes.
- Réglage de l’inclinaison et décentrer de la lentille de l’OL pour l’aligner correctement dans le chemin optique. Une fois cela fait, le système de double-modalité est prêt pour l’imagerie.
Remarque : Une pouvez utiliser la méthode auto-collimation pour y parvenir, c'est-à-dire vérifiant la lumière arrière-réfléchie par la surface des lentilles OL pour s’assurer qu’elle remonte le long de la même manière que la lumière incidente.
3. préparation lapin
- Prendre un lapin blanc de Nouvelle-Zélande de l’animalerie et enregistrer les informations individuelles, telles que numéro de l’organisme animal et de poids.
- Monter des plates-formes de lapin, y compris le soutien de l’organe et le support de tête sur la table optique sous le système d’imagerie. Mettre une couverture de chauffage à circulation d’eau sur le soutien de l’organe et régler la température de l’eau en circulation à 38 ° C, pour aider à maintenir la température du corps du lapin chaud pendant la durée de l’expérience et la récupération.
- Enregistrer les données vitales de procédure préalable, y compris l’État dans l’ensemble animal, couleur de la muqueuse, fréquence cardiaque, fréquence respiratoire et la température corporelle rectale. Anesthésier le lapin avec un mélange de kétamine (40 mg/kg) et de xylazine (5 mg/kg) par injection intramusculaire (IM) et enregistrer l’utilisation de la kétamine (substance réglementée de l’annexe III). Confirmer le niveau de l’anesthésie en vérifiant sa fréquence cardiaque, fréquence respiratoire et état général.
- Dilater les pupilles de lapin à l’aide d’une goutte de Tropicamide 1 ophtalmique et phényléphrine chlorhydrate 2,5 % ophtalmiques.
- Utiliser un spéculum pour tenir les paupières de la route et appliquez une goutte de lubrifiant oculaire afin d’humidifier la cornée. Instiller une goutte de tétracaïne topique 0,5 % dans le œil avant la procédure d’imagerie.
Remarque : Pour les plus longs des procédures ou avec un inconfort possible à l’animal, donner le lapin une injection sous-cutanée de meloxicam avant l’expérience pour assurer le confort animal.
4. l’imagerie SD-OCT
- Transférer le lapin à la plate-forme d’imagerie d’une caméra de fond de œil clinique et prendre 50 degrés des images du fond de œil, rouge gratuit et autofluorescence avant l’OPO session d’imagerie. Cela permet de vérifier la transparence optique de le œil et reconnaître la morphologie de navire du fundus et monuments, comme le nerf optique et le système vasculaire rétinien de rayons médullaires.
- Transférer le lapin dans la plate-forme du système OCT et ajuster sa posture pour positionner à peu près un des yeux sous le permis d’exploitation. Illuminer le œil à l’aide de la lumière LED.
Remarque : Pour faciliter la traduction clinique de la technique, aux yeux de lapin ne sont pas stabilisés à l’aide d’autres méthodes, et la tête de lapin est vient de mettre sur le support de tête sans aucune fixation. - Ouvrez le logiciel OCT et vérifiez d’abord l’image de la caméra CCD du fond de le œil. Finement, ajuster la hauteur et l’angle de l’appui tête si nécessaire pour assurer la région d’intérêt (ROIs), tels que choroïdienne navires et vaisseaux rétiniens, sont dans le champ de vision (FOV) de la caméra.
Remarque : Si le lapin est sous un niveau de bonne anesthésie, une séance d’imagerie séquentielle peut durer aussi longtemps que 10 min sans la nécessité d’un réajustement de la tête de lapin. - Dessiner une ligne droite pour représenter le OCT B-scan d’intérêt et lancer le balayage. Ajuster la longueur de bras de référence pour visualiser l’image de l’OCT et optimiser le facteur de compensation de dispersion dans le logiciel OCT pour obtenir les images les plus nettes.
Remarque : Lorsque vous ajustez la longueur de bras de référence, deux images OCT miroirs apparaîtra l’un après l’autre. La bonne image se distinguaient basée sur une connaissance préalable de l’anatomie de le œil. - Définir les paramètres d’acquisition de données, tels que le nombre de pixels et moyennes et enregistrer des images.
- Observer la fréquence respiratoire et la fréquence cardiaque du lapin pour estimer le niveau de l’anesthésie et l’animal confort. Pour les sessions plus longues, une dose d’un tiers de kétamine supplémentaire ou inhalation isoflurane sont envisageables avec l’intubation endotrachéale, un V-gel ou un masque facial pour maintenir le plan de l’anesthésie si nécessaire.
- Rincer la cornée de lapin avec douche oculaire toutes les 2 min pendant l’expérience pour prévenir la déshydratation de surface cornéenne et cornéen superficiel kératopathie épithéliale ponctuée. Vitals animaux surveiller et enregistrer toutes les 15 min.
5. PAM imagerie
- Porter des lunettes de protection laser approprié et allumer l’appareil de l’OPO.
- Lancez le logiciel de contrôle de PAM, régler la longueur d’onde du laser à l’un des pics d’absorption des chromophores ciblés (p. ex., 570 nm pour l’hémoglobine), initialiser la position du galvanomètre et énergie laser moniteur avant de la cornée de lapin afin d’assurer qu’elle est inférieure à la limite de sécurité ANSI.
- Monter le capteur ultrasonique sur une scène en trois dimensions (3D) traduction et positionner la pointe de la sonde au contact de la conjonctive de lapin pointant vers le fond de l’oeil. Utiliser une goutte de lubrifiant oculaire au meilleur couple de la conjonctive de pointe et le lapin du transducteur.
- Allumez l’éclairage LED et de visualiser le fundus lapin via le logiciel Matlab.
- Jeu le ROI balayage (vaisseaux rétiniens ou navires choroïdienne), y compris le centre et la taille physique. Ouvrir l’obturateur de laser et commencez à B-scan de la poutre. Par à peu près aligner le transducteur, on devrait pouvoir voir détection photoacoustique signal sur l’oscilloscope. Si ce n’est pas le cas, ajustez légèrement la position de le œil pour numériser une région différente de la cornée ou de passer à l’autre oeil et de répéter le processus ci-dessus.
- Observer la détection photoacoustique de signaux sur l’oscilloscope et de régler finement la position de la sonde afin de maximiser l’intensité du signal le long de l’ensemble B-scan.
Remarque : En raison de la largeur du faisceau limité, transducteur ultrasonique a généralement une petite FOV41. Cette étape détermine la modulation de l’arrière-plan des images finales de PAM. Désalignement conduira à des images de PAM avec arrière-plan hétérogène et dégrader la qualité d’image considérablement. - Définissez les paramètres d’acquisition de données. Cela inclut le nombre de pixels (e.g., 256 × 256 pixels), fréquence d’échantillonnage (e.g., 200 MÉCH. / s) et la durée du retard. Démarrer l’acquisition de données. Le logiciel Matlab ouvre automatiquement l’obturateur pour passer le faisceau laser, une fois lancée, fermer l’obturateur pour bloquer la poutre lorsque vous avez terminé pour éviter une surexposition de laser.
Remarque : Limité par le taux de répétition des impulsions (1 kHz) du laser, il faut environ 1 min pour terminer l’acquisition des données d’une image avec 256 × 256 pixels. - Traiter les données brutes et de visualiser l’image de PAM en deux dimensions (2D) grâce à l’intensité maximale de projection (MIP)13 ou en 3D par le biais de rendu volumique38.
- Démonter le capteur ultrasonique, rincer l’embout à l’aide de l’eau désionisée et remettre à l’étui de rangement.
- Transférer le lapin à la caméra du fundus et réexaminer le fond de l’oeil. Cette étape permet de vérifier s’il y a des changements morphologiques de le œil après la séance d’imagerie.
- Rincer la cornée de lapin avec douche oculaire toutes les deux minutes pendant l’expérience pour prévenir la kératopathie et déshydratation de surface cornéenne. Vitals animaux surveiller et enregistrer toutes les 15 min.
Remarque : Le PAM, OCT et le fond d’imagerie séances prennent environ 1 h.
6. imagerie post
- Après réexamen du fond de œil à l’aide de la caméra de fond d’oeil, déconnecter le V-gel si connecté. Bien rincer l’oeil à l’aide de douche oculaire, appliquer flurbiprofen ophtalmique et néomycine et polymyxine B sulfate pommade ophtalmique de dexaméthasone et fermer le œil.
- Transférer le lapin avec la couverture de circulation d’eau dans une chambre de récupération. Protéger la zone de la lumière et attendez que le lapin se réveille naturellement. Durant cette période, surveiller les signes vitaux animal toutes les 15 min et conserver l’enregistrement et retourner un exemplaire à l’animalerie pour la tenue des dossiers.
- Une fois que le lapin se réveille et est actif, alerte et marche normalement, le transporter à l’animalerie. Si une expérience aiguë est prévue, euthanasier l’animal à l’aide de la solution de l’euthanasie (par exemple., Beuthanasia, 0,22 mL/kg, une injection intraveineuse dans la veine marginale oreille) et de disposer de la carcasse.
- Désactiver le logiciel et le laser. Nettoyer le banc optique.
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Representative Results
Le système dual-modalité d’imagerie et le protocole expérimental ont été testés avec succès en laboratoire des auteurs à l’aide de quatre lapins néo-zélandais blancs. Ce qui suit présente quelques résultats représentatifs.
La figure 1 illustre le schéma du système d’imagerie double-modalité de PAM et SD-OCT. Il est composé des modules suivants : photoacoustique light source, atténuateur variable laser, faisceau collimateur, wattmètre, tête de scanner, module d’acquisition et de détection photoacoustique, unité OCT et l’électronique de synchronisation. Configurations système détaillées sont détaillées à la Section 1.1.
Figure 2 illustre les résultats de l’imagerie typiques de la vascularisation choroïdienne lapin recueillies à l’aide du système d’imagerie double-modalité. Figure 2 (a) est une photographie du fond d’oeil montrant que choroïdienne navires répartis sur plupart des parties de le œil du lapin alors que les vaisseaux rétiniens est confinés dans le rayon médullaire. Figure 2 (b) est une image typique de PAM montrant la vascularisation choroïdienne au sein de la photographie du fond de œil. Les vaisseaux sanguins choroïdienne ont été délimitées à haute résolution latérale. Figure 2 (c) est une image de OCT B-scan acquise afin d’étudier l’anatomie de le œil et confirme la présence des navires choroïdienne. La sclérotique, la choroïde et la rétine peuvent être visualisés avec une résolution axiale élevée avec les vaisseaux choroïdienne sous la couche de (pre) de l’épithélium pigmentaire rétinien.
La figure 3 montre les résultats de l’imagerie typiques du système vasculaire rétinien de lapin acquis en utilisant le système dual-modalité d’imagerie. Figures 3 a et 3 b sont 2D MIP et rendu volumétrique 3D des vaisseaux rétiniens obtenues par PAM, respectivement. Figure 3 (c) montre des tranches orthogonales de l’image 3D. Les résultats montrent que la PAM pourrait également visualiser les vaisseaux rétiniens individuels, qui se situent au-dessus de la couche RPE, et confirme que les vaisseaux rétiniens et navires choroïdienne sont à différentes profondeurs. Figure 3 (d) illustre une image correspondante OCT B-scan, montrant des coupes transversales des vaisseaux rétiniens et la couche de fibres nerveuses (NFL).
La figure 1. Schématique de la microscopie photoacoustique intégrée et le système d’imagerie du dual-modalité tomographie par cohérence optique. OPO : Oscillateur paramétrique optique ; BS : séparateur de faisceau ; PD : photodiode ; M : miroir ; DM : miroir dichroïque ; SL : scan lentille ; OL : lentille ophtalmique ; SMF : fibre monomode ; DCG : verre de compensation de dispersion ; CCD : dispositif de couplage charge. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 2. PAM et OCT imagerie double-modalité de choroïdienne vaisseaux sanguins chez les lapins. (a) photographie du fond de œil montrant que navires choroïdienne (CVs) répartis sur le fond d’oeil entier tandis que les vaisseaux rétiniens (RVs) est confinés dans les rayons médullaires, étant donné que les lapins sont des animaux merangiotic. (b) PAM C-scan image de CVs, montrant que le PAM peut délimiter CVs à haute résolution latérale. (c) OCT B-scan image montrant la structure anatomique du lapin fond d’oeil et de la position axiale des vaisseaux choroïdienne. GCL : Couche de cellules de Ganglion ; INL : couche nucléaire interne ; IPL : couche plexiforme interne ; ONL : couche nucléaire externe ; BPO : couche plexiforme externe ; OLM : membrane limitante externe ; EZ : zone ellipsoïde ; MZ : zone de myoïdes ; OS : segment externe ; BM, la membrane de Bruch ; IZ : zone interdigitation38. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 3. PAM et OCT imagerie double-modalité des vaisseaux sanguins rétiniens lapins. (a) PAM C-scan image de RVs et CVs. b 3D rendu volumétrique de l’image de PAM. (c) 2D tranches orthogonales de l’image de PAM, montrant que les véhicules récréatifs et CVs sont à différentes profondeurs. (d) OCT B-scan image illustrant les RVs, la NFL et la sclère38. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Un film de larme intact et régulier est essentiel pour des images de haute qualité du fond de œil. Un cinéma de déchirure irrégulière et détériorés peut dégrader significativement image qualité42. Pour préserver l’intégrité du film lacrymal et empêcher la cornée kératopathie ponctuée superficielle, il est essentiel pour lubrifier la cornée à l’aide de douche oculaire très fréquemment, environ toutes les deux minutes. S’il n’y a aucune préoccupation au sujet de l’opacité de le œil, utiliser une lampe à fente et fluorescéine bandes permettant de contrôler l’état de la cornée.
Plusieurs difficultés peuvent exister pour l’imagerie du segment postérieur des yeux des grands animaux, notamment l’atténuation du signal photoacoustique avec la distance, en particulier pour les composants haute fréquence, la déshydratation cornéenne et aberrations optiques. Amplitude du signal photoacoustique connaît généralement une atténuation significative avant d’être détecté par le capteur ultrasonique en forme d’aiguille. Plus la taille du globe oculaire, plus l’atténuation. La taille du globe oculaire de lapins (~18.1mm) est environ trois fois plus grande que celle des rats et six fois supérieure à celle des souris, ce qui rend l’imagerie oculaire lapin particulièrement difficile. Pour atteindre raisonnable d’imagerie de qualité, un faisceau laser avec un petit diamètre (2 mm après le collimateur faisceau dans cette étude) et collimaté wavefront (idéalement plane wavefront) est préférable car il est peu touché par des aberrations optiques intrinsèques de la cornée et peut être bien ciblées sur la rétine. Ce point revêt une importance cruciale en termes de réduction de la dose d’exposition laser et améliorer la résolution de l’image. En outre, un transducteur à ultrasons avec une fréquence de 27 MHz plutôt qu’à une fréquence plus élevée de centre en raison de résultats expérimentaux, ce qui indique que c’est l’échographie maximale du signal sur cette distance.
Alors que les OCT et OCTA sont bien établies technologies utilisées à la clinique d’imagerie anatomique et fonctionnelle de l’oeil, leur capacité d’imagerie moléculaire est limitée en raison des mécanismes de contraste43. PAM est un système d’imagerie d’émergents oeil basé sur le contraste d’absorption optique des tissus oculaires. Il est sensible aux chromophores endogènes et exogènes, comme l’hémoglobine, mélanine et agents de contraste administré à l’extérieur. Visualiser la structure vasculaire a démontré dans ce travail est l’une des nombreuses applications du PAM. Autres applications importantes incluent l’imagerie moléculaire et fonctionnelle, telles que la détection de vitesse de flux sanguin, quantification de concentration de l’hémoglobine, cartographie de saturation d’oxygène et visualisation de biomarqueurs, qui sont importants étudier la physiopathologie des une myriade des maladies vasculaires rétiniennes, notamment la rétinopathie diabétique, la dégénérescence maculaire, occlusion veineuse rétinienne, occlusion de l’artère rétinienne, drépanocytose rétinopathie et histoplasmose oculaire présumé, pour n’en nommer que quelques-uns. En outre, le PAM a une plus grande profondeur de pénétration que OCT, ce qui le rend approprié pour l’étude de certaines maladies choroïdienne, tels polypoidal vasculopathie choroïdienne, choriorétinopathie séreuse centrale, les maladies pachychoroid et néovascularisation choroïdienne. De ces perspectives, PAM pourrait être en mesure de fournir des informations complémentaires utiles à OCT et OCTA pour donner une évaluation plus complète des maladies oculaires à l’avenir.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le généreux soutien de la 4K12EY022299 de l’Institut National d’oeil (PMJ), lutte pour Sight-International rétinienne Research Foundation FFS GIA16002 (PMJ), sans restriction soutien du ministère de la recherche pour prévenir la cécité et les Département d’ophtalmologie de l’Université du Michigan et Sciences de la vision. Ce travail a utilisé le Centre Core for Vision Research financé par P30 EY007003 du National Eye Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dual-modality imaging system | |||
| OPO laser | Ekspla (Vilnius, Lithuania) | NT-242 | |
| Beam attenuator | Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) | AHWP10M-600 | |
| Motorized rotation stage | Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) | PRM1/MZ8 | |
| Motorized rotation stage controller | Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) | TDC001 | |
| Focusing lens | Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) | AC254-250-B | |
| Pinhole | Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) | P50S | |
| Collimating lens | Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) | AC127-030-B | |
| Photodiode | Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) | PDA36A | |
| Laser shutter | Vincent Associates Inc. (Toronto, Canada) | LS6S2T0 | |
| Laser shutter driver | Vincent Associates Inc. (Toronto, Canada) | VCM-D1 | |
| Dichroic mirror | Semrock, Inc. (Rochester, NY, USA) | Di03-R785-t3-25×36 | |
| Scan lens | Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) | OCT-LK3-BB | |
| Ophthalmic lens | Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) | AC080-010-B-ML | |
| Ultrasonic transducer | Optosonic Inc. (Arcadia, CA, USA) | Custom | |
| Amplifier | L3 Narda-MITEQ (Hauppauge, NY, USA) | AU-1647 | |
| Band-pass filter | Mini-Circuits (Brooklyn, NY, USA) | BLP-30+ | |
| Digitizer | DynamicSignals LLC (Lockport, IL, USA) | PX1500-4 | |
| Synchronization electronics | National Instruments Corporation (Austin, TX, USA) | USB-6353 | |
| OCT module | Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) | Ganymede-II-HR | |
| Dispersion compensation glass | Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) | LSM03DC | |
| Illumination LED light | Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) | MCWHF2 | |
| Power meter | Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) | S121C | |
| Power meter interface | Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) | PM100USB | |
| Height measurement tool | Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) | BHM1 | |
| Fundus camera | Topcon Corporation (Tokyo, Japan) | TRC 50EX | |
| Matlab | MathWorks (Natick, MA, USA) | 2017a | |
| Oscilloscope | Teledyne LeCroy (Chestnut Ridge, NY, USA) | WaveJet 354T | |
| Animal experiment | |||
| Water-circulating blanket | Stryker Corporation (Kalamazoo, MI, USA) | TP-700 | |
| Ketamine hydrochloride injection | Par pharmaceutical, Inc. (Woodcliff Lake, NJ, USA) | NDC code 42023-115-10 | |
| Xylazine hydrochloride | VetOne (Boise, ID, USA) | NDC code 13985-704-10 | |
| Tropicamide ophthalmic | Akorn Pharmaceuticals Inc. (Lake Forest, IL, USA) | NDC code 17478-102-12 | |
| Phenylephrine hydrochloride ophthalmic | Paragon BioTeck, Inc. (Portland, OR, USA) | NDC code 42702-102-15 | |
| Eye lubricant | Hub Pharmaceuticals LLC (Rancho Cucamonga, CA, USA) | NDC code 17238-610-15 | |
| Eyewash | Altaire Pharmaceuticals, Inc. (Aquebogue, NY, USA) | NDC code 59390-175-18 | |
| Tetracaine hydrochloride ophthalmic solution | Bausch & Lomb, Inc. (Rochester, NY, USA) | NDC code 24208-920-64 | |
| Flurbiprofen sodium ophthalmic solution | Bausch & Lomb, Inc. (Rochester, NY, USA) | NDC code 24208-314-25 | |
| Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Dexamethasone Ophthalmic Ointment | Bausch & Lomb, Inc. (Rochester, NY, USA) | NDC code 24208-795-35 | |
| Meloxicam injection | Henry Schein Inc. (Queens, NY, USA) | NDC code 11695-6925-1 |
References
- Wang, L. V., Hu, S. Photoacoustic tomography: in vivo imaging from organelles to organs. Science. 335 (6075), 1458-1462 (2012).
- Beard, P. Biomedical photoacoustic imaging. Interface Focus. , rsfs20110028 (2011).
- Taruttis, A., Ntziachristos, V. Advances in real-time multispectral optoacoustic imaging and its applications. Nat Photonics. 9 (4), 219-227 (2015).
- Tian, C., Xie, Z., Fabiilli, M. L., Wang, X. Imaging and sensing based on dual-pulse nonlinear photoacoustic contrast: a preliminary study on fatty liver. Opt Lett. 40 (10), 2253-2256 (2015).
- Tian, C., et al. Dual-pulse nonlinear photoacoustic technique: a practical investigation. Biomed Opt Express. 6 (8), 2923-2933 (2015).
- Tian, C., et al. Non-Contact Photoacoustic Imaging Using a Commercial Heterodyne Interferometer. IEEE Sens J. 16 (23), 8381-8388 (2016).
- Kim, K. H., et al. Air-coupled ultrasound detection using capillary-based optical ring resonators. Sci Rep. 7, 1 (2017).
- Feng, T., et al. Bone assessment via thermal photo-acoustic measurements. Opt Lett. 40 (8), 1721-1724 (2015).
- Chen, S. -L., Xie, Z., Carson, P. L., Wang, X., Guo, L. J. In vivo flow speed measurement of capillaries by photoacoustic correlation spectroscopy. Opt Lett. 36 (20), 4017-4019 (2011).
- Dean-Ben, X., Fehm, T. F., Razansky, D. Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time. J Vis Exp. (93), e51864 (2014).
- Galanzha, E. I., et al. In vivo magnetic enrichment and multiplex photoacoustic detection of circulating tumour cells. Nat Nanotechnol. 4 (12), 855-860 (2009).
- Xiang, L., Wang, B., Ji, L., Jiang, H. 4-D photoacoustic tomography. Sci Rep. 3, (2013).
- Tian, C., et al. Plasmonic nanoparticles with quantitatively controlled bioconjugation for photoacoustic imaging of live cancer cells. Adv Sci. 3 (12), (2016).
- Zhou, F., Wu, S., Yuan, Y., Chen, W. R., Xing, D. Mitochondria-Targeting Photoacoustic Therapy Using Single-Walled Carbon Nanotubes. Small. 8 (10), 1543-1550 (2012).
- Maslov, K., Zhang, H. F., Hu, S., Wang, L. V. Optical-resolution photoacoustic microscopy for in vivo imaging of single capillaries. Opt Lett. 33 (9), 929-931 (2008).
- Hu, S., Maslov, K., Wang, L. V. Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy. J Vis Exp. (51), e2729 (2011).
- Yao, J., et al. High-speed label-free functional photoacoustic microscopy of mouse brain in action. Nat Methods. 12 (5), 407-410 (2015).
- Yang, X., Skrabalak, S. E., Li, Z. -Y., Xia, Y., Wang, L. V. Photoacoustic tomography of a rat cerebral cortex in vivo with au nanocages as an optical contrast agent. Nano Lett. 7 (12), 3798-3802 (2007).
- Agarwal, A., et al. Targeted gold nanorod contrast agent for prostate cancer detection by photoacoustic imaging. J Appl Phys. 102 (6), 064701 (2007).
- Zackrisson, S., van de Ven, S., Gambhir, S. Light in and sound out: emerging translational strategies for photoacoustic imaging. Cancer Res. 74 (4), 979-1004 (2014).
- Ermilov, S. A., et al. Laser optoacoustic imaging system for detection of breast cancer. J Biomed Opt. 14 (2), 024007 (2009).
- Mallidi, S., Luke, G. P., Emelianov, S. Photoacoustic imaging in cancer detection, diagnosis, and treatment guidance. Trends Biotechnol. 29 (5), 213-221 (2011).
- Zhang, H. F., Maslov, K., Stoica, G., Wang, L. V. Functional photoacoustic microscopy for high-resolution and noninvasive in vivo imaging. Nat Biotechnol. 24 (7), 848 (2006).
- Keswani, R. K., et al. Repositioning Clofazimine as a Macrophage-Targeting Photoacoustic Contrast Agent. Sci Rep. 6, 23528 (2016).
- Strohm, E. M., Berndl, E. S., Kolios, M. C. Probing red blood cell morphology using high-frequency photoacoustics. Biophys J. 105 (1), 59-67 (2013).
- Nguyen, V. P., Kim, J., Ha, K. -l, Oh, J., Kang, H. W. Feasibility study on photoacoustic guidance for high-intensity focused ultrasound-induced hemostasis. J Biomed Opt. 19 (10), 105010 (2014).
- Keane, P. A., Sadda, S. R. Retinal imaging in the twenty-first century: state of the art and future directions. Ophthalmology. 121 (12), 2489-2500 (2014).
- Keane, P., Sadda, S. Imaging chorioretinal vascular disease. Eye. 24 (3), 422-427 (2010).
- Jiao, S., et al. Photoacoustic ophthalmoscopy for in vivo retinal imaging. Opt Express. 18 (4), 3967-3972 (2010).
- Liu, T., et al. Near-infrared light photoacoustic ophthalmoscopy. Biomed Opt Express. 3 (4), 792-799 (2012).
- Song, W., et al. A combined method to quantify the retinal metabolic rate of oxygen using photoacoustic ophthalmoscopy and optical coherence tomography. Sci Rep. 4, 6525 (2014).
- Liu, W., Zhang, H. F. Photoacoustic imaging of the eye: a mini review. Photoacoustics. 4 (3), 112-123 (2016).
- de La Zerda, A., et al. Photoacoustic ocular imaging. Opt Lett. 35 (3), 270-272 (2010).
- Hu, S., Rao, B., Maslov, K., Wang, L. V. Label-free photoacoustic ophthalmic angiography. Opt Lett. 35 (1), 1-3 (2010).
- Silverman, R. H., et al. High-resolution photoacoustic imaging of ocular tissues. Ultrasound Med Biol. 36 (5), 733-742 (2010).
- Wu, N., Ye, S., Ren, Q., Li, C. High-resolution dual-modality photoacoustic ocular imaging. Opt Lett. 39 (8), 2451-2454 (2014).
- Hennen, S. N., et al. Photoacoustic tomography imaging and estimation of oxygen saturation of hemoglobin in ocular tissue of rabbits. Exp Eye Res. 138, 153-158 (2015).
- Tian, C., Zhang, W., Mordovanakis, A., Wang, X., Paulus, Y. M. Noninvasive chorioretinal imaging in living rabbits using integrated photoacoustic microscopy and optical coherence tomography. Opt Express. 25 (14), 15947-15955 (2017).
- Laser Institute of America. American National Standard for Safe Use of Lasers ANSI Z136.1 - 2007. American National Standards Institute, Inc. , (2007).
- Hughes, A. A schematic eye for the rabbit. Vision Res. 12 (1), 123 (1972).
- Ma, T., et al. Systematic study of high-frequency ultrasonic transducer design for laser-scanning photoacoustic ophthalmoscopy. J Biomed Opt. 19 (1), 016015 (2014).
- Song, W., Wei, Q., Jiao, S., Zhang, H. F. Integrated photoacoustic ophthalmoscopy and spectral-domain optical coherence tomography. J Vis Exp. (71), (2013).
- Mattison, S., Kim, W., Park, J., Applegate, B. Molecular Imaging in Optical Coherence Tomography. Curr Mol Imaging. 3 (2), 88-105 (2014).
