Summary
وهنا، نقوم بتدريب الفئران على مهمة تعلم النقابي لاختبار تمييز رائحة. كما يسمح هذا البروتوكول للدراسات المتعلقة بالتغييرات الهيكلية الناجمة عن التعلم في الدماغ.
Abstract
أولفاكشن هو الطريقة الحسية الغالبة في الفئران، ويؤثر على العديد من المشكلات الهامة، بما في ذلك جمع العلف، كشف المفترس والتزاوج، والأبوة والأمومة. الأهم من ذلك، يمكن أن يكون تدريب الفئران لإقران روائح الرواية بالاستجابات السلوكية محددة لتوفير نظرة ثاقبة وظيفة الدائرة حاسة الشم. هذا البروتوكول تفاصيل الإجراءات المتعلقة بتدريب الفئران على مهمة تعلم استثابي انتقال/عدم الانتقال. في هذا النهج، الفئران مدربون على مئات تجارب الآلي يوميا لمدة 2-4 أسابيع ويمكن اختبار ثم على رواية الانتقال/عدم الانتقال رائحة أزواج لتقييم التمييز حاسة الشم، أو استخدامها لإجراء دراسات عن كيفية التعلم رائحة يغير هيكل أو وظيفة لحاسة الشم الدائرة. بالإضافة إلى ذلك، يضم لمبة شمي الماوس (OB) التكامل الجارية ولد بالغ الخلايا العصبية. من المثير للاهتمام، يزيد حاسة الشم التعلم كل من البقاء على قيد الحياة واتصالات متشابك من هذه الخلايا العصبية ولد الكبار. ولذلك، يمكن الجمع بين هذا البروتوكول مع تقنيات أخرى البيوكيميائية والكهربية، والتصوير لدراسة عوامل التعلم وتعتمد على نشاط التوسط من أجل بقاء الخلايا العصبية واللدونه.
Introduction
الماوس المكشوف، حيث يدخل المعلومات رائحة أولاً الجهاز العصبي المركزي (CNS)، يقدم نموذجا ممتازا لدراسة التغيرات الهيكلية المعتمدة على الخبرة. الدوائر OB يتكامل باستمرار ولد بالغ من الخلايا العصبية بطريقة تعتمد على النشاط. تقسيم السلائف العصبية ولد بالغ قبالة من أجداد هذا الخط في منطقة سوبفينتريكولار المجاورة إلى البطينات الجانبية1. عند ترحيل إلى المكشوف، هذه السلائف العصبية البقاء على قيد الحياة، والتفريق، ودمج الخلايا الحبيبية المثبطة أو الخضوع للمبرمج2. التحديد لمصير الخلية تتأثر بالنشاط حاسة الشم، بما في ذلك التعلم حاسة الشم3،4،،من56. بعد الاندماج، تحدث التغييرات متشابك المستحثة بالتعلم في الخلايا الحبيبية خلال أسبوعين حرجة فترة7،8. وهكذا، معبراً للتعلم حاسة الشم مفيدة لدراسة كيف تعتمد على خبرة اللدونة التأثيرات الهيكلية والوظيفية إعادة تنظيم الدائرة الدماغ ناضجة.
ويوفر هذا البروتوكول نهج واحد لتدريب حاسة الشم باستخدام نموذج تكييف هواء فعال. في هذه المهمة، يتم تدريب الفئران المحرومين من المياه ليتم اقترانه عقاب مهلة محاكمة رائحة واحدة (رائحة "الذهاب") مع مكافأة مياه ورائحة أخرى (رائحة "المحظورة"). الفئران في التقدم من خلال سلسلة متدرجة من مراحل التدريب على مدى 2-4 أسابيع. عند الانتهاء من التدريب، الفئران تستجيب لرائحة الذهاب أو عدم الذهاب مع السلوكيات المنفصلة، والمقابلة (تسعى إلى مكافأة مياه في محاكمات الذهاب ولا تسعى إلى مكافأة المياه في محاكمات المحظورة) (الشكل 1أ). بعد تدريب كاملة، يمكن كذلك الطعن الفئران مع أزواج رائحة مشابهة كيميائيا لاختبار التمييز أو تصبح انتقلت إلى دراسات التعلم كيف حاسة الشم التحقيق يغير هيكل أو وظيفة جراحات على الرغم من أن رائحة تمييز المهام قد وصفت سابقا، آخر تعتمد على قياسات موضوعية مثل عدد من الشمة بين اثنين أودورانتس9،10. وعلاوة على ذلك، الحاجة إلى سجل البشرية من هذه المهام أيضا وقت كثيفة. ويوفر التعلم حاسة الشم الانتقال/عدم الانتقال المهمة المبينة في هذا البروتوكول قياس المباشر غير منحازة، ورائحة التمييز والتعلم حاسة الشم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
واستخدمت جميع الفئران تحت بروتوكول أقرته بايلور كلية الطب المؤسسية الحيوان الرعاية واستخدام اللجنة وفقا لمعايير المعاهد الوطنية للصحة. كانت الفئران المستخدمة في هذا البروتوكول جميع الفئران الكبار (> 6 أسابيع عمر) في C57BL6/ي الخلفية وشملت الفئران الذكور والإناث على حد سواء. بعد التدريب/التدريج المهام، يتم إرجاع الفئران إلى القفص المنزل.
1-البناء والقواعد العامة لاستخدام تكييف هواء فعال التعلم مربع (الشكل 1ب، ج)
- قم بتجميع دائرة ماوس مع الكلمة الدائرة. اترك مربع التدريب في انخفاض حركة مرور، منطقة الخافتة لتفادي الانحرافات.
- التصفح لكل منفذ المياه مع وجود ثقب صغير في الأعلى للسماح إبرة عيار 18 الاستغناء عن المياه داخل الميناء.
- ملء قنينة الزجاج مع الرائحة يذوب في الزيوت المعدنية (استبدال أسبوعيا)، وتشديد أمن عملية النداءات الموحدة.
- قم بتوصيل إبرة قياس 18 أنابيب سيليكون. بيرس غطاء قنينة الزجاج بإبرة عيار 18، وتوصيل الطرف الآخر من أنابيب سيليكون مدخول المنافذ رائحة.
- ضع كل أنابيب سيليكون في صمام رائحة.
- قم بتوصيل خط فراغ المنافذ رائحة.
- إرفاق اثنين 10 مل المحاقن بقضيب معدني عقد، وتوصيل أنابيب الحقن. الاتصال الجانب الآخر من الأنبوب إبرة 18 جرام. تناسب الإبرة في حفر حفرة المنفذ كزة الآنف على قاعة الماوس. قم بتوصيل الطرف الآخر من الأنبوب إلى صمام المياه.
- ملء المحاقن 10 مل اثنين مع القوارض من مياه الشرب.
- الاتصال مقياس تدفق هواء بكمية الهواء والحفاظ على تدفق الهواء في 3-5 لتر في الدقيقة.
- الاتصال صمامات المياه 2، 2 رائحة الصمامات، 2 المياه المنافذ، منفذ رائحة والسلطة بنظام واجهة الناقل التسلسلي العام. توصيل جميع الصمامات لمنافذ 'الإخراج'، وكافة المنافذ الرائحة والمياه إلى 'إدخال' المنافذ. قم بتوصيل جميع المعدات إلى السلطة النواتج من مربع واجهة الناقل التسلسلي العام، وأخيراً، الاتصال مربع واجهة USB بالطاقة.
- ضبط شفط فراغ لتجنب التلوث المنتقل من الروائح الكريهة بين المحاكمات.
- استخدام أنابيب خاصة برائحة للاتصال قارورة الرائحة إلى الدائرة.
2. الماوس إعداد: 1 – 3 أيام
- تقسيم الفئران إلى 3 مجموعات: التحكم (لا يلزم تدريب حاسة الشم)، المدربين الزائفة (الفئران الذين يتلقون المكافأة أو العقوبة بشكل عشوائي)، وتدريب المجموعات. تعرض الفئران الزائفة المدربين لتقديم التدريب مربع ورائحة، ولكن لا توفر تدريب حاسة الشم لأن نتائج مكافأة مقابل العقوبة يرتبط عشوائياً مع رائحة تسليمها.
ملاحظة: سوف تذهب مجموعة المدربين الزائفة من خلال نموذج التدريب ضمن مراحل "بسيودوترينينج". الفئران مدربين سيتم إكمال جميع مراحل التدريب. بسيودوترينينج اختياري إذا كان الغرض من هذه التجربة للاعتداء للاختلافات السلوكية في تمييز رائحة أو التعلم. البروتوكول المقدمة هنا يضيف هذا الفريق إذا كان يريد المجرب للتحقيق للاختلافات العصبية قبل وبعد التدريب. ثم أن التحكم مجموعة بسيودوترينيد للتعرض لرائحة السلبي والتدريب ذات الصلة غير حاسة الشم. - تبدأ المياه التقييد في الفئران إلى 40 مل/كغم/يوم. تجنب فقدان وزن الجسم أكبر من 20% وزن الحيوانات خط الأساس من أجل تجنب الشدة (الشكل 2أ).
- وزن الفئران يوميا للتأكد من أنها أعلى من 80% وزن خط الأساس. إذا كان ماوس يندرج تحت هذه العتبة، إزالة الماوس من الدراسة وتوفير حرية الوصول إلى المياه.
- إبقاء جميع العوامل البيئية ثابتة طوال البروتوكول بما في ذلك درجة الحرارة والضوضاء والروائح الكريهة الضآلة (بما في ذلك هيئة الشخصية والعطور/كولونيا/مزيل الروائح).
ملاحظة: كما هو الحال مع كل اختبار سلوك الحيوانات، التغيرات البيئية الصغيرة يمكن أن تؤثر إلى حد كبير النتائج.
3-تعليمات لجميع المراحل
- رمز البرنامج التدريب لكل مرحلة من المراحل أدناه. تشغيل البرنامج في البرامج السلوكية.
ملاحظة: الترميز لجميع المراحل هي الواردة في ملفات الترميز تكميلية. يتم تجميع البيانات لمسارات 20 كما هي معروضة أداء كتلة وماوس واحد عبر كتل. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تتكرر كل مرحلة على ماوس لعدد من الأيام حتى يتم الوفاء بمعايير الإنجاز. - لا تحتفظ بالفئران في المربع السلوك لأكثر من 60 دقيقة في اليوم.
- النفايات الماوس نظيفة من القفص قبل أن يتم نقل كل الماوس إلى القفص. رذاذ ومسح الدائرة مع الإيثانول 70% لتقليل الهاء رائحة الماوس.
4-تدريب المرحلة 1: ربط مكافأة المياه مع مركز آنف كزة، 1 – 3 أيام
- في هذه المرحلة، إقران الفئران بمكافأة مياه عند استكشاف مياه الميناء.
-
1 مرحلة التدريب تعليمات البرمجة
- برنامج هذه المرحلة لاستخدام منفذ توصيل المياه فقط. واسمحوا الماوس تلقي مكافأة مياه لكل كزة الآنف.
ملاحظة: سيتم إخراج البرنامج فترة زمنية للمحاكمة، والعدد الإجمالي للمياه المكافآت الماوس الواردة.
- برنامج هذه المرحلة لاستخدام منفذ توصيل المياه فقط. واسمحوا الماوس تلقي مكافأة مياه لكل كزة الآنف.
- تعيين 1 المرحلة بسيودوترينينج برمجة نفس التدريب المرحلة 1.
-
إعداد الماوس وتكوين مربع
- تكوين مربع السلوك مع منفذ مياه في المركز وكافة المنافذ الجانبية غير قابل للوصول. ضع ماوس في الدائرة. إغلاق قاعة الماوس وبدء برنامج المرحلة 1.
- النظر في هذه المرحلة كاملة عند الماوس يحقق محاكمات 100 في غضون 60 دقيقة إزالة الماوس من الدائرة بعد 60 دقيقة أو المحاكمات 100 تم الانتهاء (الشكل 2ب).
ملاحظة: بسبب الاختلافات الفردية، بعض الفئران بطبيعة الحال ستمتنع عن استكشاف المربع. - إذا كانت هناك حاجة إلى التشجيع، يدوياً توصيل المياه إلى ميناء المياه. كرر هذه المرحلة لمدة 3 أيام.
ملاحظة: الفئران التي هي بالفعل بتدريب يمكن أن تتكرر كذلك للحفاظ على التكافؤ وإبقائهم على تقييد السوائل. من الممكن أيضا لتعزيز مجموعة بأكملها إلى المرحلة الثانية عندما يصل متوسط المجموعة 100 المحاكمات/60 دقيقة. وهذا سيسمح لجميع الفئران مواصلة التدريب في نفس اليوم.
5-تدريب المرحلة 2: مكافأة مياه ميناء الجانب إقران المنفذ مركز الآنف كزة، 1-5 أيام
- في هذه المرحلة، اسمحوا الفئران كزة أنوفهم في الميناء مركز وثم فورا تلقي مكافأة مياه على المنافذ الجانبية.
-
إعداد الماوس وتكوين مربع
- تكوين هذا وكل مرحلة من المراحل اللاحقة مع 2 منافذ المياه على الجانبين وميناء رائحة في الوسط. ضع ماوس في الدائرة. إغلاق قاعة الماوس والبدء ببرنامج المرحلة 2.
-
2 مرحلة التدريب تعليمات البرمجة
- تزويد الماوس مكافأة مياه فورا على كلا الجانبين بعد كزة آنف في الوسط رائحة تسليم ميناء. تعيين معلمات الإخراج لهذه المرحلة كفترة زمنية للمحاكمة، وعدد المحاكمات التي بدأت، والعدد من المكافآت المياه تلقي في غضون 5 ليالي كزة الآنف.
- تعيين 2 المرحلة بسيودوترينينج برمجة نفس التدريب المرحلة 2.
- النظر في هذه المرحلة بالكامل عندما يتم تنفيذ الحد ني محاكمات 40 في 60 دقيقة، مع 25 في المائة على الأقل من المكافآت المياه تلقي في غضون 5 ليالي كزة الآنف منفذ مركز. إزالة الماوس بمجرد اكتمال هذه المرحلة (الشكل 2-ج).
ملاحظة: برنامج التدريب على حساب النسبة المئوية للمكافآت المياه تلقي في الوقت مناسب من أجل تحديد الانتهاء من هذه المرحلة. على الرغم من أن الفئران تختلف في مدى سرعة الانتهاء من هذه المرحلة، ومعظم أجهزة الماوس سيتم التوصل إلى معايير الإنجاز في غضون 5 أيام. ومع ذلك، إذا لم يكتمل ماوس هذه المرحلة في غضون 5 أيام، لا مسبقاً الماوس إلى المرحلة التالية. سيتم إزالة هذا الفأر من الفوج.
6-تدريب المرحلة 3: ربط مكافأة مياه مع رائحة محددة وضمن إطار زمني محدد، من 1 – 3 أيام
- في هذه المرحلة، اسمحوا الفئران تتلقى رائحة الذهاب (S+) عند كزة آنف في مركز الميناء. في وقت لاحق، تسفر عن مكافأة مياه عند كزة آنف إلى موانئ المياه الجانب ضمن 5 s.
-
3 مرحلة التدريب تعليمات البرمجة
- تسليم رائحة S+ في الوسط رائحة الميناء.
- تسليم المكافأة المياه إذا كان الماوس الوخزات المنافذ الجانبية داخل 5 ق إيصالها رائحة.
ملاحظة: يبدأ البرنامج باشتراط إلا كزة آنف 100 مللي ثانية في مركز الميناء تسفر عن مكافأة مياه. وبمجرد الماوس الوخزات مركز الميناء للمبلغ الصحيح للوقت في 80 في المائة محاكمات، فترة زمنية من كزة الآنف المطلوبة لمكافأة مياه سيزداد بمقدار 50 مللي ثانية تصل إلى 400 مرض التصلب العصبي المتعدد. - تعيين معلمات الإخراج مطابقة للمرحلة 2.
- مجموعة تعليمات البرمجة المرحلة 3 بسيودوترينينج نفس كتدريب المرحلة 3. ومع ذلك، لا تتصل برائحة S+ رائحة التسليم المراقب المالي لضمان أن رائحة S+ لم يقترن بمكافأة مياه.
-
إعداد الماوس وتكوين مربع
- تعيين نفس التكوين في المرحلة 2.
- قم بتوصيل رائحة S+ رائحة التسليم المراقب المالي. ضع ماوس في الدائرة. إغلاق قاعة الماوس وبدء برنامج المرحلة 3. إزالة الماوس بمجرد اكتمال هذه المرحلة.
- النظر في هذه المرحلة بالكامل عندما يكون هناك أكثر من 60 من مكافآت خلال 60 دقيقة (الشكل 2د).
7-المرحلة 4A: اقتران رائحة المحظورة (S-) ومهلة العقوبة، أيام 1-2
- في هذه المرحلة، أعرض الفئران رائحة محظورة (S-). توفير عقوبة مهلة للفئران التي تذهب بشكل غير صحيح إلى موانئ المياه بعد شم رائحة المحظورة.
-
تدريب المرحلة 4A تعليمات البرمجة
- تسليم فقط الرائحة S+ في هذه المرحلة في البداية، مطابقة للمرحلة 3. بعد استكمال المحاكمات 40 الفئران، تبدأ تسليم عشوائية من الروائح الكريهة تشمل كلا من S+ والروائح الكريهة S. برنامج عقوبة مهلة 2-s إذا كان الماوس محاولات للحصول على مكافأة مياه بعد تعرض رائحة المحظورة.
ملاحظة: للمساعدة في التمييز بين الذهاب مقابل المحظورة، أضواء الجانب الأشعة تحت الحمراء يمكن التلاعب بها حيث أنها هي في أثناء الذهاب أودورانتس وإيقاف أثناء odorants المحظورة. الأضواء تتصرف كرمز ثانوية لمساعدة الفئران في التدريب الأولى. حالما يتم تدريب الفئران مع الأضواء، ينبغي تدريب الخضوع دون أضواء للتأكد من أنهم تعلموا المهمة مع الروائح. - تعيين معلمات الإخراج كالمدة الزمنية للمحاكمة، وعدد المحاكمات التي بدأت، عدد من المحاكمات المنجزة، % الصحيح، والعدد الإجمالي لتلقي مكافآت.
- تسليم فقط الرائحة S+ في هذه المرحلة في البداية، مطابقة للمرحلة 3. بعد استكمال المحاكمات 40 الفئران، تبدأ تسليم عشوائية من الروائح الكريهة تشمل كلا من S+ والروائح الكريهة S. برنامج عقوبة مهلة 2-s إذا كان الماوس محاولات للحصول على مكافأة مياه بعد تعرض رائحة المحظورة.
- S-روائح ترد عشوائياً من البداية وتعيين تعليمات البرمجة 4A المرحلة بسيودوترينينج نفسه "مرحلة التدريب" 4S إلا S+. تعطي المياه العقوبات مكافأة أو مهلة بشكل عشوائي، بغض النظر عن أداء المهمة.
-
إعداد الماوس وتكوين مربع
- تعيين تكوين مربع نفسه كالمرحلة السابقة 3.
- قم بتوصيل S+ وق-رائحة رائحة التسليم المراقب المالي. ضع ماوس في الدائرة. إغلاق قاعة الماوس وبدء البرنامج 4A المرحلة. بعد محاكمات 40 كاملة الفئران، تبديل البرنامج لتسليم عشوائياً الروائح الكريهة. إزالة الماوس بمجرد اكتمال هذه المرحلة.
- النظر في هذه المرحلة كاملة عندما تكون هناك محاكمات 40 مع > 60% الاستجابات الصحيحة.
8-المرحلة 4 باء: اقتران رائحة المحظورة (S-) ومهلة العقوبة، 5 – 11 يوما
-
تدريب المرحلة 4B تعليمات البرمجة
- تجعل هذه المرحلة مطابقة للمرحلة 4A، لكن العقوبة مهلة لمحاولة مكافأة مياه بعد رائحة S هو 4 s.
- تعيين المكافأة المياه بسيودوترينينج 4B مرحلة البرمجة تعليمات متطابقة إلى المرحلة 4 ألف، ومع ذلك، ويتم تسليم مهلة العقوبة عشوائياً كل محاكمة.
-
إعداد الماوس وتكوين مربع
- تعيين تكوين مربع نفسه ك 4A المرحلة السابقة.
- قم بتوصيل S+ وق-رائحة رائحة التسليم المراقب المالي. ضع ماوس في الدائرة. إغلاق قاعة الماوس وبدء البرنامج 4B المرحلة. النظر في هذه المرحلة كاملة عندما تكون هناك > محاكمات 100 في غضون 60 دقيقة مع دقة > 85% (الشكل 2ه)
- رصد نسبة الحد الأقصى والحد الأدنى الصحيح لكل جلسة عمل تتبع الماوس كل التقدم المحرز في هذه المرحلة. حوالي 85-90% فئران التوصل إلى معايير الإنجاز لهذه المرحلة. استبعاد الفئران التي لا تحقق إنجاز هذه المرحلة لمرحلة اختبار الانتقال/عدم الانتقال.
- (اختياري) في نهاية هذه المرحلة، تطبيق تدريب عكس، حيث يتم تبديل odorants الانتقال/عدم الانتقال على منصة قنينة رائحة. ضمان أن الفئران هي عدم اقترانها حافزا آخر، مثل صوت الصمامات المرتبطة بالمنافذ الجانبية.
9-الانتقال/عدم الانتقال الاعتداء المهمة: 1 يوم، 20 دقيقة لكل الماوس لليوم الواحد
- تعتبر هذه المرحلة النهائية لتحديد دقة تحديد الجمعيات رائحة وتعلم أن تميز رائحة أزواج.
ملاحظة: تستخدم odorants رواية S + S-لاختبار الحيوانات كم يستغرق للتعرف على الجمعيات الجديدة. أزواج الرائحة هيكلياً مشابهة تستخدم لزيادة صعوبة المهمة. وتشمل الأمثلة 1-Butanol مقابل 1-بينتانول، اسيتات إيسواميل مقابل بوتيرات إيسواميل، و + Carvone مقابل-كارفوني. -
تعليمات البرمجة
- السماح لبرنامج التدريب الكشف عن طول كزة الآنف. برنامج كزة آنف 300 مرض التصلب العصبي المتعدد في الميناء رائحة مركز لتنفيذ المهمة.
- تعيين معلمات الإخراج مطابقة للمرحلة 4 باء، ما عدا لا تستخدم أي ضوء يسترشد العظة.
-
إعداد الماوس وتكوين مربع
- تعيين تكوين مربع نفسه ك 4B المرحلة السابقة.
- قم بتوصيل S+ وق-رائحة رائحة التسليم المراقب المالي. ضع ماوس في الدائرة. إغلاق قاعة الماوس وبدء البرنامج مرحلة الانتقال/عدم الانتقال. تعرض الفئران التي تعلمنا مهمة التعلم حاسة الشم لرواية أزواج من روائح مشابهة كيميائيا.
ملاحظة: الوصول إلى الفئران Wildtype مع تمييز رائحة كافية > دقة 85% مع أودورانتس الرواية بعد ما يقرب من 10-20 كتل أو المحاكمات 200-400 (الشكل 3أ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
متى تعلمنا الفئران مهمة التعلم حاسة الشم، أنهم الآن إقران أزواج رائحة الرواية بالثواب والعقاب. عادة ما تبدأ هذه الفئران المدربة مع حوالي 50% دقة في مهمة الانتقال/عدم الانتقال. يمكن رسم النسبة المئوية الصحيحة من كتلة المحاكمة كمنحنى التعلم لأزواج رائحة رواية (الشكل 3أ). ضمن 10 كتلة المحاكمات، التي تأخذ معظم الفئران أقل من 30 دقيقة لأداء، الفئران قادرة بشكل صحيح يميز بين الروائح مع أكبر من دقة 85% (الخط الأحمر). وهذا يبين أن لدينا بروتوكول بنجاح تدريب الفئران wildtype لإقران رائحة واحدة مع مكافأة مياه وأخرى مع عقوبة مهلة. لتقييم قدرات التمييز بين الأفواج اثنين، يمكن تحليل هذه البيانات كذلك مقارنة العدد من المحاكمات اللازمة للوصول إلى إتقان 85% (الشكل 3ب) أو بواسطة متوسط النسبة المئوية الصحيحة بعد بلوغ الكفاءة.
بمجرد معرفة الفئران المهمة، يمكن تعديل أزواج رائحة لزيادة أو إنقاص صعوبة المهمة. على سبيل المثال، خفض تركيز رائحة الزوج يزيد من صعوبة المهمة (الشكل 3ج). هذا التحليل يمكن أن تكشف عن عتبة الكشف عن مجموعات مختلفة من الفئران. وعلاوة على ذلك، يمكن تغيير رائحة أزواج لتصبح أكثر هيكلياً مشابهة (أي متبلور مضاد أو الاختلافات الكربون واحد). يمكن أيضا استخدام مخاليط رائحة زيادة صعوبة مهمة (أي، خليط 40/60 مقابل خليط 30/70).
الفئران أيضا قادرة على تذكر أزواج رائحة المستفادة السابقة. بعد انتظار 7 أيام منذ التعلم المهمة، تعلمت استدعاء اختبار تبين أن الفئران wildtype يمكن أن نتذكر بسرعة قبل رائحة الجمعيات (الشكل 3د).
الشكل 1 : الانتقال/عدم الانتقال تدريب نموذجي ومعدات التكوين. الفئران (أ) الاستجابة بشكل صحيح أما الحصول على المياه أثناء العرض التقديمي "رائحة الذهاب" أو الامتناع أثناء العرض التقديمي "رائحة المحظورة". (ب) السلوك مربع يتم تكوين مثل منفذ مياه واحد فقط موجوداً خلال المرحلة 1 وجميع المراحل اللاحقة تحتوي على منفذ توصيل رائحة وسط واثنين من منافذ المياه. دائرة زرقاء: مياه الميناء. دائرة خضراء: رائحة الميناء. (ج) رائحة التسليم هو بوابة صمام رائحة واحدة لكل رائحة. كمية الهواء ضغط إيجابي يؤدي إلى موزع. الأسهم الحمراء تشير إلى خط ضغط الهواء الإيجابي الخوض في القنينة رائحة استعداد (دائرة حمراء). سهم أزرق يشير إلى مزيج الهواء/رائحة ترك القنينة رائحة ويمر عبر صمام رائحة (دائرة الضوء الأزرق) ودخول هواء أبيض دمج مربع. يشير السهم البرتقالي إلى الهواء الضغط الإيجابي يذهب إلى صمام منظم مركزي (دائرة البرتقالي) إلى مربع التكامل للسماح لضغط الهواء الإيجابي لدفع الجوية رائحة خليط من integrator المربع إلى منفذ توصيل رائحة (السهم الأسود السفلي). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : بيانات التدريب- وزن جسم الفئران (A) لا تسقط نسبة أقل من 80% بينما في تقييد السوائل. خط أحمر = عتبة 80%. N = 8 الفئران. (ب) تظهر نتائج التدريب المرحلة 1 العدد من مركز ميناء الوخزات في 60 دقيقة لتلقي مكافأة المياه. N = 8 الفئران. أشرطة الخطأ هي الخطأ المعياري للوسط. (ج) المرحلة 2 نتائج التدريب وتظهر النسبة المئوية للمكافآت المياه تلقي في غضون 5 s من مركز الآنف كزة. الخط الأحمر عتبة 25%. تعني النسبة المئوية مع تسليط الضوء على اللون الرمادي كالخطأ المعياري للوسط. N = 8 الفئران. (د) المرحلة 3 التراكمي المكافآت تبين عدد من المكافآت التي تلقت الفئران 8 في اليوم الأول واليوم الثاني من التدريب. الخط الأحمر هو 60 مكافأة العتبات. أشرطة الخطأ هي الانحراف المعياري. (ه) مرحلة 4B دقة نتائج عرض نسبة الإجابات الصحيحة لمرحلة 4B. الخط الأحمر هو 85% عتبة. يعني الخط الأسود الخالص وتسليط الضوء على اللون الرمادي هو الخطأ المعياري للوسط. N = 4 الفئران. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: نتائج ممثلة لمهمة الانتقال/عدم الانتقال. المهمة (أ) الانتقال/عدم الانتقال ل odorants رواية 2 (S+ = إيسواميل خلات/S--= خلات الأميل) بعد أن تم تدريب الفئران على الاوجينول (S+) ويوكاليبتول (S-). N = 5 الفئران، مع الخطأ المعياري للوسط باللون الرمادي. الخط الأخضر دقة 50%، وخط أحمر عتبة دقتها 85%. (ب) مثال لمهمة الانتقال/عدم الانتقال لماوس سيكون متعلم سريع مقابل ماوس متعلم بطيء هيكسانول (S+)، وحامض زبدي (S-). (ج) الانتقال/عدم الانتقال المهمة للضغوط الجزئية متفاوتة هيكسانول (S+) وحامض زبدي (S-). (د) قدرة الفئران على التذكير بهذا الزوج رائحة 7 أيام بعد التدريب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويوفر النظام حاسة الشم القوارض نموذجا فريداً لدراسة اللدونة تعتمد الحسية. نقدم هنا نموذج تعلم حاسة الشم لتدريب الفئران ليتم اقترانه أزواج الرائحة أما الثواب أو العقاب. من خلال هذه المهمة التعلم، يمكن دراسة التغييرات الدائرة المصب في التجارب اللاحقة (الكهربية، في فيفو تصوير الخلايا العصبية، إلخ.). عند الانتهاء، سوف تتعلم الفئران لأداء مهمة ملقن رائحة بسيطة لإقران مكافأة مياه مع رائحة واحدة، وعقوبة مهلة برائحة أخرى.
أن هذا تحليل السلوكي، نوصي بالاستفادة من المساواة في توزيع العمر والجنس بين التجريبية والتحكم في مجموعات الحيوانات. فإنه لا بد من الإبقاء على الشروط بين الفئران مستمرة قدر الإمكان. على سبيل المثال، ضمان أن تظل ثابتة طوال التدريب معالج الفئران وظروف الإضاءة. في حالة عدم تنفيذ العديد من الفئران المهمة كما هو متوقع، كفالة الوفاء بالشروط التالية: (1) إبقاء الإعداد السلوك هادئة قدر الإمكان. (2) الماء حرمان الفئران بما فيه الكفاية. ونجد أن حتى بعد يوم كامل من الحرمان المياه، العديد من الفئران سوف لا بما فيه الكفاية شرب ما يكفي من ميناء مركز المربع المرحلة 1 للوصول إلى معايير الإنجاز. (3) في بداية كل الماوس الجديد، تحقق من رائحة المياه الصمامات والأنابيب التأكد من الموضع الصحيح. (4) أودورانتس تختلف في تقلباتها وذلك بعض يتبخر أسرع من غيرها. استبدال odorants أكثر تقلباً بضغوط بخار أعلى يوميا بدلاً من أسبوعيا، خاصة إذا كان يتم استخدام تركيزات أقل.
يمكن تعديل هذا البروتوكول وفقا للأغراض التجريبية. إذا كان وقت التعلم في مرحلة 4B مهم، ثم قد يكون من المستصوب لإزالة أي روائح حتى هذه المرحلة. وهذا ما يضمن أن أي تعلم حاسة الشم تبدأ في مرحلة 4B. لتحقيق هذا الهدف، ونحن قد أدوا هذا البروتوكول بإزالة الرائحة من المرحلة 3، وتخطي مرحلة 4A تماما. الفئران سوف يكون أكثر صعوبة في التوصل إلى معايير الإنجاز باستخدام هذا الأسلوب، ولكن هذا أيضا يعطي معلومات قيمة لتتعلم كيف بسرعة الفئران هذه المهمة في المرة الأولى.
واحد الحد من هذا البروتوكول أن الفئران إكمال مراحل مختلفة حتى يمكن إجراء اختبارات حاسة الشم. ولذلك، على الرغم من أن لا ينظر إلى جانب لدينا مختبر، تلاعب قد تعوق الإدراك أن استمرار عدم التوصل إلى مرحلة 4B. لقد حاولنا أن تلغي هذه المشكلة بالتأكد من أن كل مرحلة من المراحل بما فيه الكفاية طويلة بما يكفي للسماح لمعظم أجهزة الماوس للدراسات العليا إلى الخطوة التالية من التدريب. ومع ذلك، إذا كان ماوس لا تصل إلى معايير الإنجاز لمرحلة حتى بعد فترة التدريب الكامل، نحن إزالة أن الماوس من الفوج. وهذا يسمح لنا مواصلة الدراسة دون انتظار أي ماوس الفردية. قيد آخر أن لدينا حتى الآن توسيع نطاق هذا البروتوكول إلى نماذج حيوانية أخرى هامة لميدان أولفاكشن. على سبيل المثال، الفئران، قد ساعدت في الكشف عن وظيفة الخلايا العصبية داخل المكشوف11،12. كما أن الفئران بسبب ذكائهم، تعلم مرات أسرع من الفئران13،14. وعلى الرغم من هذه القيود، اخترنا الفئران لهذا البروتوكول بسبب تلك المقاييس الوراثية لأداء الخلية المحددة نوع التلاعب وتسجيلات15.
استخدام البروتوكولات القائمة معظم الاختلافات في الشمة الرائحة أو الوقت المستغرق التالي للروائح لتقريب التمييز أو التعلم4،،من69،،من1016. ويمكن قياس هذا البروتوكول مباشرة التمييز على أساس المحاكمة قبل المحاكمة. وعلاوة على ذلك، وهذا يمكن قياس عدد المحاكمات كل الماوس بحاجة إلى التعرف على اقتران بالضبط. يزيل هذا النهج مؤتمتة بالكامل أي تحيزات البشرية من تحليل البيانات. الحيوانات الغذاء يحرم أيضا قد استخدمت بنجاح للتعلم حاسة الشم. تم اختيار الفئران المياه المحرومين نظراً لتزايد عدد المحاكمات يمكن أداء ماوس مع المياه عبر الغذاء16.
كمراقبين للنشاط القابلة للغرس، مثل العدسات Graded Index (ابتسامة) ووحدة المتعدد الأقطاب، الاستمرار في تحسين، ونحن قد قريبا قادرة على الجمع بين هذه التكنولوجيات مع هذا البروتوكول17،18. عن طريق تسجيل النموذج مناطق الدماغ ذات الصلة أثناء التعلم حاسة الشم، فمن الممكن للتحقيق كيف العصبية أنشطة التغيير أثناء التعلم النقابي. هذا قد يساعد في الكشف عن مسائل العلوم العصبية الأساسية، مثل كيفية الخلايا العصبية ترميز المعلومات بطريقة مختلفة من خلال التعلم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح وليس المصالح المتنافسة.
Acknowledgments
هذا البروتوكول مقتبس من الأعمال السابقة داخل لدينا مختبر (هوانغ et al. 8)-وافقت جميع الأساليب الموصوفة هنا "العناية بالحيوان" واستخدام اللجنة (أكوك) من "كلية بايلور للطب". معتمد من قبل المعهد الطبي ماكنير، منحة نيندس R01NS078294 إلى B.R.A.، إيدرك المعاهد الوطنية للصحة منح U54HD083092، ومنحة نيدك F30DK112571 لأحزاب اللقاء المشترك، ومنحة نيندس F31NS092435 إلى CKM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass vial | Qorpak | GLC-01016 | |
| Silicon Tubing | Thermo Scientific | 86000030 | |
| 18 gauge needles | BD | 305196 | |
| 1-Butanol | Sigma Aldrich | 437603 | |
| Propionic Acid | Sigma Aldrich | 402907 | |
| Mouse Chamber | Med Associates | ENV-307W | |
| Chamber Floor | Med Associates | ENV-307W-GFW | |
| Water Port | Med Associates | ENV-313W | Need two |
| Odor stimulus | Med Associates | ENV-275 | Contain 2 valves to gate odor delivery |
| Odor Port | Med Associates | ENV-375W-NPP | |
| USB Interface | Med Associates | DIG-703A-USB | |
| Desktop Computer with Windows 2000, XP, Vista, or 7 | |||
| Flow meter | VWR | 97004-952 | |
| Behavioral software | Med Associates | SOF-735 | This software, which runs each training stage, has now been replaced with Med-PC V |
| Data Transfer software | Med Associates | SOF-731 | This software formats the data to Excel |
| Training Software | Med Associates | DIG-703A-USB | This software is used to program each training stage |
| Water Valve | Neptune Research | 225P012-11 | This valve is used to gate the water delivery. Need Two |
| Odor Valve | Neptune Research | 360P012-42 | This valve is used to gate the odor delivery. Need Two |
References
- Carleton, A., Petreanu, L. T., Lansford, R., Alvarez-Buylla, A., Lledo, P. M. Becoming a new neuron in the adult olfactory bulb. Nat Neurosci. 6 (5), 507-518 (2003).
- Petreanu, L., Alvarez-Buylla, A. Maturation and death of adult-born olfactory bulb granule neurons: role of olfaction. J Neurosci. 22 (14), 6106-6113 (2002).
- Yamaguchi, M., Mori, K. Critical period for sensory experience-dependent survival of newly generated granule cells in the adult mouse olfactory bulb. PNAS. 102 (27), 9697-9702 (2005).
- Rochefort, C., Gheusi, G., Vincent, J. D., Lledo, P. M. Enriched odor exposure increases the number of newborn neurons in the adult olfactory bulb and improves odor memory. J Neurosci. 22 (7), 2679-2689 (2002).
- Arenkiel, B. R., et al. Activity-induced remodeling of olfactory bulb microcircuits revealed by monosynaptic tracing. PloS one. 6 (12), 29423 (2011).
- Alonso, M., Viollet, C., Gabellec, M. M., Meas-Yedid, V., Olivo-Marin, J. C., Lledo, P. M. Olfactory discrimination learning increases the survival of adult-born neurons in the olfactory bulb. J Neurosci. 26 (41), 10508-10513 (2006).
- Quast, K. B., et al. Developmental broadening of inhibitory sensory maps. Nat Neurosci. 20 (2), 189 (2017).
- Huang, L., et al. Task learning promotes plasticity of interneuron connectivity maps in the olfactory bulb. J Neurosci. 36 (34), 8856-8871 (2016).
- Arbuckle, E. P., Smith, G. D., Gomez, M. C., Lugo, J. N. Testing for odor discrimination and habituation in mice. J Vis Sci. (99), e52615 (2015).
- Zou, J., Wang, W., Pan, Y. W., Lu, S., Xia, Z. Methods to measure olfactory behavior in mice. Curr Protoc Toxicol. , 11-18 (2015).
- Uchida, N., Takahashi, Y. K., Tanifuji, M., Mori, K. Odor maps in the mammalian olfactory bulb: domain organization and odorant structural features. Nat Neurosci. 3 (10), 1035 (2000).
- Cang, J., Isaacson, J. S. In vivo whole-cell recording of odor-evoked synaptic transmission in the rat olfactory bulb. J Neurosci. 23 (10), 4108-4116 (2003).
- Parthasarathy, K., Bhalla, U. S. Laterality and symmetry in rat olfactory behavior and in physiology of olfactory input. J Neurosci. 33 (13), 5750-5760 (2013).
- Rajan, R., Clement, J. P., Bhalla, U. S. Rats smell in stereo. Science. 311 (5761), 666-670 (2006).
- Batista-Brito, R., Close, J., Machold, R., Fishell, G. The distinct temporal origins of olfactory bulb interneuron subtypes. J Neurosci. 28 (15), 3966-3975 (2008).
- Sakamoto, M., et al. Continuous postnatal neurogenesis contributes to formation of the olfactory bulb neural circuits and flexible olfactory associative learning. J Neurosci. 34 (17), 5788-5799 (2014).
- Resendez, S. L., Jennings, J. H., Ung, R. L., Namboodiri, V. M. K., Zhou, Z. C., Otis, J. M., Stuber, G. D. Visualization of cortical, subcortical, and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nat Protoc. 11 (3), 566 (2016).
- Park, S., et al. One-step optogenetics with multifunctional flexible polymer fibers. Nat Neurosci. 20 (4), 612 (2017).
