Summary
Här tränar vi möss på en associativ inlärning uppgift att testa lukt diskriminering. Detta protokoll kan också för studier på lärande-inducerad strukturella förändringar i hjärnan.
Abstract
Luktsinnets funktion är det dominerande sensorisk modalitet i möss och påverkar många viktiga beteenden, inklusive födosök, predator upptäckt, parning och föräldraskap. Ännu viktigare, kan möss tränas till att associera roman lukter med specifika beteendemässiga svar att ge insikt i lukt krets funktion. Detta protokoll Detaljer förfarandet för utbildning möss på en Go/No-Avbryt operant lärande aktivitet. I denna strategi, möss är utbildade på hundratals automatiserade prövningar dagligen under 2 – 4 veckor och kan sedan testas på roman Go/No-Avbryt lukt par för att bedöma olfactory diskriminering, eller användas för studier på hur lukt lärande förändrar strukturen eller funktionen hos den lukt krets. Dessutom har mus luktbulben (OB) pågående integrationen av vuxen-född nervceller. Intressant, ökar lukt lärande både överlevnad och synapsförbindelser av dessa vuxen-född nervceller. Detta protokoll kan därför kombineras med andra biokemiska, elektrofysiologiska och imaging tekniker för att studera lärande och aktivitet-beroende faktorer som medla neuronal överlevnad och plasticitet.
Introduction
Musen OB, där lukt information först träder det centrala nervsystemet (CNS), ger en utmärkt modell för att studera erfarenhet-beroende strukturella förändringar. OB circuity integrerar ständigt vuxen-född nervceller i en aktivitet-beroende sätt. Vuxen-född neuron prekursorer dela av från stamfäder som kantar den subventrikulära zonen intill den laterala ventriklar1. Vid migrerar in OB, dessa neuronala prekursorer antingen överleva, skilja, och integrera som hämmande granule celler eller genomgå apoptos2. Urval för cell öde påverkas av lukt aktivitet, inklusive olfactory lärande3,4,5,6. Efter integration sker lärande-inducerad synaptic förändringar i granule celler under en två veckors kritiska perioden7,8. Analyser för lukt lärande är således användbar för att undersöka hur erfarenhet-beroende plasticitet influenser strukturell och funktionell omorganisation av en mogen hjärnan krets.
Detta protokoll erbjuder en strategi för lukt utbildning med hjälp av ett operant betingning paradigm. I den här uppgiften är vatten-berövade möss utbildade för att associera en lukt (”gå” lukt) med en vatten-belöning och en annan lukt (”No-Go” lukt) med en rättegång timeout bestraffning. Möss framsteg genom en graderad serie av utbildning faser under loppet av 2-4 veckor. När utbildningen är klar, möss svara på Go eller No-Go lukten med diskret, motsvarande beteenden (söker en vatten belöning på Go prövningar och inte söker vatten belöningen om No-Go prövningar) (figur 1A). Efter utbildningen är klar, möss kan utmanas ytterligare med kemiskt liknande lukt par att testa diskriminering eller bli övergått till studier utreder hur luktsinnet lärande förändrar strukturen eller funktionen hos OB. Även om lukt diskriminering uppgifter har beskrivits tidigare, lita mest på subjektiva mätningar såsom antal nosar mellan två odoranter9,10. Behovet av mänskliga poängsättning av sådana uppgifter är dessutom också tidskrävande. Olfactory lärande på Go/No-Avbryt uppgift beskrivs i detta protokoll erbjuder en opartisk, direkt mätning av lukt diskriminering och lukt lärande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla möss användes enligt ett protokoll som godkänts av Baylor College av medicin institutionella djur vård och användning kommittén enligt NIH standarder. Möss som används i detta protokoll var alla vuxna möss (> 6 veckor) på C57BL6/j bakgrund och inkluderade såväl kvinnliga som manliga möss. Efter utbildning/iscensättning uppgifter returneras möss till deras hem bur.
1. konstruktion och allmänna regler för att använda Operant inlärning Box (figur 1B, C)
- Montera en mus kammare med kammare golv. Hålla rutan utbildning i en låg trafik, svagt upplyst område att undvika distraktioner.
- Borra varje vatten hamn med ett litet hål på toppen för att tillåta en 18 gauge nål att dosera vatten innanför porten.
- Fyll glasflaska med luktämnet upplöst i mineralolja (ersatt varje vecka) och dra åt locket ordentligt.
- Anslut 18 gauge nål till silikon slangar. Pierce glas injektionsflaska cap med 18 gauge nål och Anslut andra änden av silikon slangar till intaget av lukt hamnarna.
- Placera varje silikon slangar in en lukt ventil.
- Anslut dammsugaren till lukt portar.
- Bifoga två 10 mL-sprutor till en metall innehav spö och Anslut slangen till sprutorna. Anslut den andra sidan av slangen till en 18 G nål. Passa in nålen i det borrade hålet i hamnen näsan peta på mus förbränningskammaren. Anslut den andra änden av slangen till vattenventilen.
- Fyll de två 10 mL-sprutorna med gnagare dricksvatten.
- Ansluta en air-flödesmätare till luftintag och bibehålla luftflödet vid 3 – 5 L/min.
- Ansluta 2 vattenventiler, 2 lukt ventiler, 2 vatten portar, lukt hamnen och makt till systemets USB-gränssnitt. Anslut alla ventiler till 'Output' portar, alla lukt och vatten hamnar till 'Input' portar. Anslut alla utrustning för att driva utgångar från rutan USB-gränssnitt, och slutligen ansluta rutan USB-gränssnittet till makten.
- Justera vakuum sug för att undvika korskontaminering av lukter mellan prövningar.
- Använda lukt-specifika slangar för att ansluta luktämnet injektionsflaskor till kammaren.
2. mus förberedelser: 1 – 3 dagar
- Dela upp möss i 3 grupper: kontroll (ingen lukt utbildning krävs), pseudo utbildade (möss som får belöning eller bestraffning slumpmässigt), och utbildade grupper. Exponera pseudo utbildad möss till utbildning box och lukt leverans, men ger inte lukt utbildning eftersom resultatet av belöning och bestraffning är slumpmässigt associerad med den lukt som levereras.
Obs: Pseudo utbildade gruppen kommer att gå igenom utbildning paradigm enligt ”Pseudotraining” stadier. Utbildad möss kommer att slutföra alla utbildning stadier. Pseudotraining är valfri om syftet med experimentet är till assay för beteendemässiga skillnader i lukt diskriminering eller lärande. I protokollet föreskrivs här lägger denna gruppen om experimenter vill probe för neuronal skillnader före och efter träning. Gruppen pseudotrained skulle sedan kontrollera för passiv lukt exponering och icke-lukt tillhörande utbildning. - Påbörja vatten begränsning hos möss till 40 mL/kg/dag. Undvika kroppsvikt förlust större än 20% av djurens baslinjen vikt för att undvika ångest (figur 2A).
- Väga möss dagligen för att säkerställa att de är över 80% av utgångsvärdet vikt. Om en mus faller under denna tröskel, ta bort musen från studien och ge fri tillgång till vatten.
- Hålla alla miljöfaktorer konstant i hela protokollet inklusive temperatur, buller och herrelösa lukter (inklusive personliga kroppen och parfym/cologne/deodorant dofter).
Obs: Som med alla djurs beteende testning, små miljöförändringar kan kraftigt påverka resultaten.
3. instruktioner för alla stadier
- Kod utbildning programvara för varje steg nedan. Köra programvaran på beteendemässiga programvaran.
Obs: Kodning för alla stadier finns i kodning tilläggsfilerna. Data för 20 vandringsleder grupperas som en enda block och mus prestanda visas över block. Dessutom kan varje steg upprepas på en mus för ett antal dagar tills slutförande kriterier uppfylls. - Förvara inte möss i rutan beteende för mer än 60 min per dag.
- Ren mus avfall från buren innan varje mus överförs till buren. Spraya och torka kammaren med 70% etanol att minimera mus lukt distraktion.
4. utbildning steg 1: Associera vatten belöning med en Center näsan peta, 1 – 3 dagar
- I detta skede, associera möss med en vatten belöning vid prospektering i hamnen vatten.
-
Utbildning steg 1 programmeringsinstruktioner
- Programmera detta skede att bara använda vatten leverans port. Låt musen få vatten belöning för varje näsa säcken.
Obs: Programmet kommer produktionen tidslängden av rättegången och det totala antalet vatten belönar musen fick.
- Programmera detta skede att bara använda vatten leverans port. Låt musen få vatten belöning för varje näsa säcken.
- Ange den pseudotraining etapp 1 programmering samma som utbildning steg 1.
-
Konfiguration och musinställningar
- Konfigurera rutan beteende med en vatten hamn i centrum och med alla sida hamnar otillgängliga. Placera musen i kammaren. Stäng mus kammaren och påbörja programmet etapp 1.
- Överväga detta skede så fullständig när musen uppnår 100 prövningar inom 60 min. ta bort musen från kammaren efter 60 min eller 100 prövningar har slutförts (figur 2B).
Obs: På grund av individuella skillnader, vissa möss kommer naturligt att avstå från att utforska rutan. - Om det behövs uppmuntran, manuellt leverera vatten till vatten porten. Upprepa detta steg för upp till 3 dagar.
Obs: Möss som utbildas redan kan upprepas ytterligare att upprätthålla paritet och hålla dem på flytande begränsning. Det är också möjligt att främja en hel grupp till etapp 2 när genomsnittet i gruppen når 100 prövningar/60 min. Detta kommer att möjliggöra alla möss att fortsätta utbildning på samma dag.
5. utbildning steg 2: Associera en sidoingången vatten belöning med Center Port näsan peta, 1 – 5 dagar
- I detta skede låta mössen peta näsan i center port och sedan omedelbart få en vatten belöning på sidan portar.
-
Konfiguration och musinställningar
- Konfigurera detta och varje efterföljande steg med 2 vatten-portar på sidorna och lukt hamnen i mitten. Placera musen i kammaren. Stäng mus kammaren och påbörja programmet etapp 2.
-
Utbildning steg 2 programmeringsinstruktioner
- Ge musen en omedelbar vatten belöning på båda sidor efter en näsan peta in i centrera lukt leverans port. Ange utdataparametrar för detta skede som tidslängden av rättegången, antalet försök som initierat och antalet vatten belöningar emot inom 5 s av säcken näsa.
- Ange den pseudotraining etapp 2 programmering samma som utbildning steg 2.
- Överväga detta skede som slutförd när minst 40 försök utförs i 60 min, med minst 25% av vattnet belöningar emot inom 5 s center port näsa säcken. Ta bort musen när detta stadium har slutförts (figur 2C).
Obs: Utbildning beräknas andelen vatten belöningar fick i god tid för att bestämma slutförande av detta skede. Även möss varierar i hur snabbt de slutföra detta steg, de flesta möss kommer att nå slutförande kriterier inom 5 dagar. Dock om en mus inte har slutfört detta skede inom 5 dagar, inte fram musen till nästa steg. Den här musen kommer att tas bort från kohorten.
6. utbildning steg 3: Associera en vatten belöning med en specifik lukt och inom en viss tidsfönster, 1 – 3 dagar
- I detta skede låta mössen får en Go (s +) lukt vid näsan säcken i den center-porten. Därefter ger en vatten belöning vid näsan säcken till sida vatten portar inom 5 s.
-
Utbildning steg 3 programmeringsinstruktioner
- Leverera s + lukten i stadens lukt port.
- Leverera vatten belöningen om musen Petar sida hamnar inom 5 s av en lukt leverans.
Obs: Programmet börjar genom att bara kräva en 100 ms näsan peta i centrum hamnen att ge vatten belöning. När musen Petar center porten för rätt tid i 80% av prövningar, tidslängden av näsan säcken krävs för vatten belöning kommer att öka med 50 ms upp till 400 ms. - Ställ in utdataparametrar identisk med steg 2.
- Ställa de pseudotraining etapp 3 programmeringsinstruktioner samma som utbildning steg 3. Men Anslut inte s + lukt till lukt leverans registeransvarige att säkerställa att s + lukt inte är associerade med en vatten-belöning.
-
Konfiguration och musinställningar
- Ange samma konfiguration i skede 2.
- Anslut s + lukten till lukt leverans handkontrollen. Placera musen i kammaren. Stäng mus kammaren och påbörja programmet etapp 3. Ta bort musen när detta stadium har slutförts.
- Tänk detta skede som slutförd när det finns större än 60 belöningar inom 60 min (figur 2D).
7. steg 4A: associera No-Go (S-) lukt och timeout straff, 1 – 2 dagar
- I detta skede, att presentera en No-Go lukt (S-) möss. Ge tid till straff till möss som felaktigt går till vatten hamnar efter att lukta no-go lukt.
-
Utbildning steg 4A programmeringsinstruktioner
- Leverera bara s + luktämnet i detta skede i början identiska till steg 3. Efter möss komplett 40 prövningar, börja slumpmässiga leverans av lukter att inkludera både s + och S-lukter. Program 2-s tid till straff om musen försöker söka vatten belöning efter presenteras No-Go lukt.
Obs: För att underlätta skilja Go vs. No-Go, IR sidoljus kan manipuleras så att de är på under Go odoranter och off under förbjudna doftämnen. Lamporna fungerar som en sekundär cue till stöd möss i grundutbildning. När möss är utbildade med lamporna, bör de under gå utbildning utan lampor att bekräfta de har lärt sig uppgiften med lukter. - Som tid varaktighet av rättegång, antal prövningar initierade, antal prövningar slutförts, % rätt, och totalt antal belöningar fick utdataparametrar.
- Leverera bara s + luktämnet i detta skede i början identiska till steg 3. Efter möss komplett 40 prövningar, börja slumpmässiga leverans av lukter att inkludera både s + och S-lukter. Program 2-s tid till straff om musen försöker söka vatten belöning efter presenteras No-Go lukt.
- Ställa de pseudotraining Stadium 4A programmeringsinstruktioner samma som utbildning skede 4S utom s + och S-lukter presenteras slumpmässigt från början. Ge vatten belöning eller timeout straff på måfå, oavsett uppgift prestanda.
-
Konfiguration och musinställningar
- Ställa konfigurationen samma som föregående etapp 3.
- Anslut både s + och S-lukt till lukt leverans handkontroll. Placera musen i kammaren. Stäng mus kammaren och påbörja programmet steg 4A. Efter möss komplett 40 prövningar, växla programmet slumpmässigt leverera lukter. Ta bort musen när detta stadium har slutförts.
- Tänk detta skede som slutförd när det finns 40 prövningar med > 60% rätta svar.
8. steg 4B: associera No-Go (S-) lukt och tid till straff, 5-11 dagar
-
Utbildning steg 4B programmeringsinstruktioner
- Göra detta skede identisk med Stadium 4A, men tid till straffet för försök vatten belöning efter en S-lukt är 4 s.
- Ställa pseudotraining Stadium 4B programmering instruktioner identisk med Stadium 4A, men vatten belöningen och tid till straff levereras slumpvis per studie.
-
Konfiguration och musinställningar
- Ställa konfigurationen samma som föregående steg 4A.
- Anslut både s + och S-lukt till lukt leverans handkontroll. Placera musen i kammaren. Stäng mus kammaren och påbörja programmet steg 4B. Överväga detta skede komplett när det är > 100 prövningar inom 60 min med noggrannhet > 85% (figur 2E)
- Övervaka den högsta och lägsta procentandelen som är rätt för varje session att spåra varje musens framsteg i detta skede. Cirka 85-90% av möss nå slutförande kriterier för detta skede. Utesluta möss som inte uppnår avslutningen av detta skede för Go/No-Avbryt testfasen.
- (Valfritt) I slutet av detta skede, tillämpa en återföring utbildning, där de Go/No-Avbryt odoranter är påslagna lukt injektionsflaska plattformen. Säkerställa att mössen inte associerar med en annan stimulus, såsom ljudet av de ventiler som är associerad med sida hamnar.
9. Go/No-Avbryt assay aktivitet: 1 dag, 20 Min per mus per dag
- Betrakta detta som det sista steget att bestämma noggrannhet identifiera lukt föreningar och lära sig att diskriminera lukt par.
Obs: Roman odoranter utnyttjas för S / S-testa hur länge djuren ta att lära sig nya föreningar. Strukturellt likartade luktämnet par används för att öka aktiviteten svårigheter. Exempel 1-Butanol vs. 1-Pentanol, isoamylacetat acetat vs. isoamylacetat Butyrate, och + karvon vs. - karvon. -
Programmering instruktioner
- Låt den utbildning programvaran upptäcka längden på näsan peta. Programmera en 300 ms näsan peta i center lukt hamnen att utföra uppgiften.
- Ange utdataparametrar identiska steg 4b, förutom Använd inte något ljus guidade ledtrådar.
-
Konfiguration och musinställningar
- Ställa konfigurationen samma som föregående steg 4B.
- Anslut både s + och S-lukt till lukt leverans handkontroll. Placera musen i kammaren. Stäng mus kammaren och börja det scenen Go/No-Avbryt programmet. Exponera de möss som har lärt sig lukt lärande uppgiften till romanen par av kemiskt liknande lukter.
Obs: Vildtyp möss med adekvat lukt diskriminering nå > 85% noggrannhet med romanen odoranter efter cirka 10-20 block eller 200-400 prövningar (figur 3A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
När möss har lärt dig lukt lärande uppgiften, kan de nu associera roman lukt par med belöning och straff. Dessa utbildad möss normalt börja med ca 50% noggrannhet för Go/No-Avbryt aktiviteten. Andelen rätta kan ritas av rättegång block som en inlärningskurva för romanen lukt par (figur 3A). Inom 10 block-prövningar, som tar de flesta möss som är mindre än 30 min att utföra, kan möss korrekt diskriminera lukter med mer än 85% noggrannhet (röda linjen). Detta visar att våra protokoll framgångsrikt utbildat vildtyp möss att associera en lukt med en vatten-belöning och en annan med en timeout bestraffning. För att bedöma diskriminering funktionerna mellan två kohorter, kan dessa data analyseras ytterligare för att jämföra antalet försök som behövs för att nå 85% språkfärdighet (figur 3B) eller av den genomsnittliga procenten rätt efter att ha nått språkfärdighet.
När möss lär dig uppgiften, kan lukt par ändras för att öka eller minska aktiviteten svårigheten. Exempelvis ökar minskar lukt-par koncentrationen aktiviteten svårigheten (figur 3C). Denna analys kan avslöja tröskeln för upptäckt för olika möss kohorter. Dessutom lukt par kan ändras för att bli mer strukturellt likartade (dvs enantiomererna eller enda carbon skillnader). Lukt blandningar kan också användas för att öka aktiviteten svårigheter (dvs, 40/60 blandningen vs 30/70 blandning).
Möss kan även komma ihåg tidigare lärda lukt par. Efter väntar 7 dagar sen lära sig uppgiften, lärde en recall test visar att vildtyp möss kan snabbt komma ihåg tidigare lukt föreningar (figur 3D).
Figur 1 : Go/No-Avbryt utbildning paradigm utrustning konfiguration och. (A) möss svara korrekt genom att antingen få vatten under gå lukt presentation eller genom att avstå under No-Go lukt presentation. (B) beteendet box är konfigurerad så att endast en enda vatten port är tillgänglig under etapp 1 och alla efterföljande etapper innehåller både en central lukt leverans port och två vatten-portar. Blå cirkel: vatten port. Grön cirkel: lukt port. (C) lukt leverans är gated av en lukt ventil för varje lukt. Positivt tryck luftintag leder till en distributör. Röda pilarna visar positiva påtryckningar luftledningen kommer in i injektionsflaskan med berett lukt (röd cirkel). Blå pil anger luft/lukt blandning lämnar injektionsflaskan med lukt och passerar genom en lukt ventil (ljusblå cirkeln) och ange en vit luft att integrera box. Orange pil indikerar positivt tryck luft ska en central regulator ventil (orangefärgade cirkeln) till rutan integrerande för positiva lufttryck att driva lukt/luft blandningen från integrator box till lukt leverans porten (undre svarta pilen). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Träningsdata. (A) möss kroppsvikt procentsats inte sjunker under 80% medan den flytande begränsning. Röd linje = 80% tröskel. N = 8 möss. (B) steg 1 utbildning resultat visar antalet center port Petar i 60 min att få vatten belöning. N = 8 möss. Felstaplar är standardavvikelsen för medelvärdet. (C) steg 2 utbildning resultaten visar andelen vatten belöningar emot inom 5 s center näsa säcken. Röda linjen är tröskelvärdet på 25%. : Procenttal med grå markering som standardavvikelsen för medelvärdet. N = 8 möss. (D) etapp 3 kumulativ belönar Visa antal belöningar inkommit 8 möss på dag 1 och dag 2 av utbildningen. Röda linjen är 60 belöning trösklarna. Felstaplar är standardavvikelsen. (E) Stadium 4B noggrannhet resultaten visar andelen rätta svar för steg 4B. Röda linjen är 85% av tröskelvärdet. Heldragen svart linje är medelvärdet och grå markering är standardavvikelsen för medelvärdet. N = 4 möss. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Representativa resultat för Go/No-Avbryt uppgift. (A) Go/No-Avbryt uppgift för 2 roman odoranter (s + = isoamylacetat acetat/S-= amyl acetat) efter möss utbildades på eugenol (s +) och eukalyptol (S-). N = 5 möss, med standardavvikelsen för medelvärdet i grått. Gröna linjen är 50% noggrannhet, röd linje är tröskelvärdet 85% noggrannhet. (B) exempel på Go/No-Avbryt uppgift för en mus som skulle vara en lättlärd kontra en långsam elev mus för hexanol (s +) och smörsyra (S-). (C) Go/No-Avbryt uppgift för varierande partialtryck av hexanol (s +) och smörsyra (S-). (D) möjligheten för möss att minns paret lukt 7 dagar efter träning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gnagare luktsinnet ger en unik modell för att studera sensoriska beroende plasticitet. Här presenterar vi en lukt learning paradigm för att utbilda möss att associera luktämnet par med antingen en belöning eller bestraffning. Genom detta lärande aktivitet, kan nedströms krets förändringar studeras i efterföljande experiment (elektrofysiologi, i vivo neuronala imaging, etc.). Efter avslutad lär möss att utföra en enkel lukt cued uppgift om du vill associera en vatten belöning med en lukt, och en timeout straff med en annan lukt.
Eftersom detta är en beteendevetenskaplig analys, vi rekommenderar utnyttja en jämn fördelning av ålder och kön bland experimental och styra djurgrupper. Det är absolut nödvändigt att villkoren mellan möss hålls så konstant som möjligt. Exempelvis säkerställa att de möss handler och ljusförhållanden förblir konstant under hela utbildningen. Om många möss inte utför uppgiften som förväntat, se till att följande villkor är uppfyllda: (1) Håll den beteende setup så tyst som möjligt. (2) vatten beröva mössen tillräckligt. Vi finner att även efter en hel dag av vatten deprivation, många möss inte kommer tillräckligt att dricka tillräckligt från center port rutan steg 1 att nå slutförande kriterier. (3) i början av varje ny mus, kontrollera lukt och vatten ventiler och rör för att säkerställa korrekt placering. (4) odoranter varierar i deras volatilitet och därför några avdunsta snabbare än andra. Byt ut mer lättflyktiga doftämnen med högre ånga pressar dagligen istället för veckovis, speciellt om lägre koncentrationer används.
Detta protokoll kan modifieras enligt syftet experimentella. Om lärande tiden i stadium 4B är viktigt, kan då det vara lämpligt att ta bort några lukter fram till detta skede. Detta säkerställer att någon lukt lärande börjar vid steg 4B. För att åstadkomma detta, har vi utfört detta protokoll genom att ta bort lukt från etapp 3 och hoppa över steg 4A helt. Möss har svårare att nå slutförande kriterier med den här metoden, men det ger också värdefull information för möss lär hur snabbt denna uppgift första gången.
En begränsning i detta protokoll är att möss har att slutföra olika stadier tills olfactory tester kan utföras. Därför, även om inte sett av vårt lab, en manipulation kan hindra kognition sådan att Stadium 4B konsekvent inte nås. Vi har försökt att förneka detta problem genom att säkerställa att varje skede tillräckligt tillräckligt långa för att de flesta möss att avancera till nästa steg i utbildningen. Dock om en mus inte når slutförande kriterier för ett skede även efter perioden full träning, bort vi musen från kohorten. Detta tillåter oss att fortsätta studien utan att vänta på någon individuell mus. En annan begränsning är att vi har ännu att förlänga detta protokoll till andra djurmodeller som är viktiga för fältet i luktsinnets funktion. Råttor, exempelvis har varit avgörande i avslöjande nervcellernas funktion inom den OB11,12. På grund av deras intelligens har råttor också snabbare lärande gånger än möss13,14. Trots dessa begränsningar valde vi möss för detta protokoll på grund av deras genetiska tractability för att utföra cell typ specifika manipulationer och inspelningar15.
De flesta befintliga protokoll Använd skillnader i lukt nosar eller tid som tillbringas bredvid lukter att approximera diskriminering eller lärande4,6,9,10,16. Detta protokoll kan direkt mäta diskriminering på grundval av rättegång av rättegång. Detta Dessutom kan mäta det exakta antalet prövningar varje mus behöver lära sig en sammanslutning. Denna helt automatiserad metod tar bort alla människors fördomar från dataanalysen. Berövade djur har också framgångsrikt använts för lukt lärande. Vatten som berövade möss valdes på grund av det ökade antalet prövningar som en mus kan utföra med vatten över mat16.
Som implanterbara aktivitet monitorer, som graderade-Index (GRIN) linser och flera enheter elektroder, fortsätta att förbättra, kan vi snart att kunna kombinera dessa tekniker med detta protokoll17,18. Genom att registrera formuläret relevanta hjärnområden under lukt lärande, är det möjligt att undersöka hur neuronala aktiviteter förändring under associativ inlärning. Detta kan hjälpa avslöja grundläggande neurovetenskap frågor, exempelvis hur nervceller kodar information annorlunda under lärande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter och inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Detta protokoll är anpassad från tidigare arbete inom vårt labb (Huang et al. 8). alla metoderna som beskrivs här har godkänts av djur vård och användning kommittén (ACUC) av Baylor College of Medicine. Det stöds av den McNair Medical Institute, NINDS grant R01NS078294 till B.R.A., NIH IDDRC grant U54HD083092, NIDDK grant F30DK112571 till JMP och NINDS grant F31NS092435 till CKM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass vial | Qorpak | GLC-01016 | |
| Silicon Tubing | Thermo Scientific | 86000030 | |
| 18 gauge needles | BD | 305196 | |
| 1-Butanol | Sigma Aldrich | 437603 | |
| Propionic Acid | Sigma Aldrich | 402907 | |
| Mouse Chamber | Med Associates | ENV-307W | |
| Chamber Floor | Med Associates | ENV-307W-GFW | |
| Water Port | Med Associates | ENV-313W | Need two |
| Odor stimulus | Med Associates | ENV-275 | Contain 2 valves to gate odor delivery |
| Odor Port | Med Associates | ENV-375W-NPP | |
| USB Interface | Med Associates | DIG-703A-USB | |
| Desktop Computer with Windows 2000, XP, Vista, or 7 | |||
| Flow meter | VWR | 97004-952 | |
| Behavioral software | Med Associates | SOF-735 | This software, which runs each training stage, has now been replaced with Med-PC V |
| Data Transfer software | Med Associates | SOF-731 | This software formats the data to Excel |
| Training Software | Med Associates | DIG-703A-USB | This software is used to program each training stage |
| Water Valve | Neptune Research | 225P012-11 | This valve is used to gate the water delivery. Need Two |
| Odor Valve | Neptune Research | 360P012-42 | This valve is used to gate the odor delivery. Need Two |
References
- Carleton, A., Petreanu, L. T., Lansford, R., Alvarez-Buylla, A., Lledo, P. M. Becoming a new neuron in the adult olfactory bulb. Nat Neurosci. 6 (5), 507-518 (2003).
- Petreanu, L., Alvarez-Buylla, A. Maturation and death of adult-born olfactory bulb granule neurons: role of olfaction. J Neurosci. 22 (14), 6106-6113 (2002).
- Yamaguchi, M., Mori, K. Critical period for sensory experience-dependent survival of newly generated granule cells in the adult mouse olfactory bulb. PNAS. 102 (27), 9697-9702 (2005).
- Rochefort, C., Gheusi, G., Vincent, J. D., Lledo, P. M. Enriched odor exposure increases the number of newborn neurons in the adult olfactory bulb and improves odor memory. J Neurosci. 22 (7), 2679-2689 (2002).
- Arenkiel, B. R., et al. Activity-induced remodeling of olfactory bulb microcircuits revealed by monosynaptic tracing. PloS one. 6 (12), 29423 (2011).
- Alonso, M., Viollet, C., Gabellec, M. M., Meas-Yedid, V., Olivo-Marin, J. C., Lledo, P. M. Olfactory discrimination learning increases the survival of adult-born neurons in the olfactory bulb. J Neurosci. 26 (41), 10508-10513 (2006).
- Quast, K. B., et al. Developmental broadening of inhibitory sensory maps. Nat Neurosci. 20 (2), 189 (2017).
- Huang, L., et al. Task learning promotes plasticity of interneuron connectivity maps in the olfactory bulb. J Neurosci. 36 (34), 8856-8871 (2016).
- Arbuckle, E. P., Smith, G. D., Gomez, M. C., Lugo, J. N. Testing for odor discrimination and habituation in mice. J Vis Sci. (99), e52615 (2015).
- Zou, J., Wang, W., Pan, Y. W., Lu, S., Xia, Z. Methods to measure olfactory behavior in mice. Curr Protoc Toxicol. , 11-18 (2015).
- Uchida, N., Takahashi, Y. K., Tanifuji, M., Mori, K. Odor maps in the mammalian olfactory bulb: domain organization and odorant structural features. Nat Neurosci. 3 (10), 1035 (2000).
- Cang, J., Isaacson, J. S. In vivo whole-cell recording of odor-evoked synaptic transmission in the rat olfactory bulb. J Neurosci. 23 (10), 4108-4116 (2003).
- Parthasarathy, K., Bhalla, U. S. Laterality and symmetry in rat olfactory behavior and in physiology of olfactory input. J Neurosci. 33 (13), 5750-5760 (2013).
- Rajan, R., Clement, J. P., Bhalla, U. S. Rats smell in stereo. Science. 311 (5761), 666-670 (2006).
- Batista-Brito, R., Close, J., Machold, R., Fishell, G. The distinct temporal origins of olfactory bulb interneuron subtypes. J Neurosci. 28 (15), 3966-3975 (2008).
- Sakamoto, M., et al. Continuous postnatal neurogenesis contributes to formation of the olfactory bulb neural circuits and flexible olfactory associative learning. J Neurosci. 34 (17), 5788-5799 (2014).
- Resendez, S. L., Jennings, J. H., Ung, R. L., Namboodiri, V. M. K., Zhou, Z. C., Otis, J. M., Stuber, G. D. Visualization of cortical, subcortical, and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nat Protoc. 11 (3), 566 (2016).
- Park, S., et al. One-step optogenetics with multifunctional flexible polymer fibers. Nat Neurosci. 20 (4), 612 (2017).
