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Bioengineering

जल्दी चिकी भ्रूण Morphogenesis में शारीरिक बलों की भूमिकाओं की जांच

Published: June 5, 2018 doi: 10.3791/57150
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1
1Thayer School of Engineering, Dartmouth College, 2Department of Bioengineering, University of Pennsylvania
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम जल्दी चिकी भ्रूण मस्तिष्क मरोड़ के दौरान morphogenesis के यांत्रिकी का अध्ययन करने के लिए नए पूर्व ovo प्रयोगों और शारीरिक मॉडलिंग दृष्टिकोण का एक सेट शुरू करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं.

Abstract

भ्रूण का विकास परंपरागत रूप से आणविक आनुवंशिकी के परिप्रेक्ष्य से अध्ययन किया जाता है, लेकिन morphogenesis में यांत्रिकी का मूलभूत महत्व तेजी से पहचाना जा रहा है. विशेष रूप से, भ्रूण चिकी दिल और मस्तिष्क ट्यूब, जो कठोर रूपात्मक परिवर्तन से गुजरना के रूप में वे विकसित, morphogenesis में शारीरिक बलों की भूमिका का अध्ययन करने के लिए प्रधान उंमीदवारों के बीच हैं । प्रगतिशील ventral झुकने और ट्यूबलर भ्रूण चिकी मस्तिष्क की rightward मरोड़ लड़की भ्रूण के विकास में अंग स्तर के बाएं सही विषमता के प्रारंभिक चरण में होता है । vitelline झिल्ली (VM) भ्रूण के पृष्ठीय पक्ष को विवश करती है और विकासशील मस्तिष्क का मरोड़ पैदा करने के लिए आवश्यक बल प्रदान करने में फंसाया गया है । यहाँ हम मस्तिष्क मरोड़ के यांत्रिकी की पहचान करने के लिए नए पूर्व ovo प्रयोगों और शारीरिक मॉडलिंग का एक संयोजन पेश करते हैं । हैमबर्गर पर-हैमिल्टन 11 चरण, भ्रूण काटा और संस्कृति पूर्व ovo (मीडिया में) हैं । VM बाद में एक खींचा केशिका ट्यूब का उपयोग कर निकाला जाता है । तरल पदार्थ के स्तर को नियंत्रित करने और एक तरल पदार्थ हवा अंतरफलक के लिए भ्रूण के अधीन होने से, मीडिया के द्रव सतह तनाव वी एम के यांत्रिक भूमिका को प्रतिस्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । मस्तिष्क मरोड़ के chirality में परिणामी परिवर्तन को खोजने के लिए हृदय की स्थिति को बदलने के लिए Microsurgery प्रयोगों का प्रदर्शन भी किया गया । इस प्रोटोकॉल से परिणाम morphogenesis ड्राइविंग में यांत्रिकी के मौलिक भूमिकाओं वर्णन ।

Introduction

आधुनिक विकासात्मक जीवविज्ञान अनुसंधान मुख्यतः आणविक आनुवंशिकी के परिप्रेक्ष्य से विकास को समझने पर केंद्रित है1,2,3,4,5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. यह ज्ञात है कि भौतिक घटनाएं morphogenesis में केंद्रीय भूमिका निभाती हैं, या फिर जैविक रूप14,15,16,17; हालांकि, विकास के विशिष्ट यांत्रिक तंत्र मोटे तौर पर अध्ययन करते रहते हैं । Ventral flexure और rightward मरोड़ के आदिम मस्तिष्क ट्यूब के बाद हैमबर्गर-हैमिल्टन स्टेज 11 (एचएच 11)18 दो मुख्य प्रक्रियाओं है कि भ्रूण आकृति परिवर्तन19,20के लिए योगदान कर रहे हैं । विशेष रूप से, भ्रूण मस्तिष्क में मरोड़ विकास अंतर्निहित शारीरिक तंत्र को पूरी तरह से समझ में रहता है ।

चिकी भ्रूण में भ्रूण मरोड़ बाएं-दाएं (L-R) के विकास में विषमता की जल्द morphogenetic घटनाओं के बीच है । जब एल आर विषमता की प्रक्रिया परेशान है, तो जन्म दोष जैसे सीटू बनाम, isomerism, या heterotaxia 21हो जाएगा ।
यहां हम एक प्रोटोकॉल है जो पूर्व ovo प्रयोगों22,23 शारीरिक मॉडलिंग के साथ जोड़ती है जल्दी भ्रूण मस्तिष्क विकास के दौरान यांत्रिक बलों की विशेषताएं प्रस्तुत करते हैं । प्रस्तुत विधि का लक्ष्य मस्तिष्क मरोड़ और प्रारंभिक विकास के दौरान मरोड़ की डिग्री को प्रभावित करने वाले कारकों के लिए जिम्मेदार यांत्रिक बलों की पहचान करने के लिए है12. प्रयोगात्मक प्रेक्षण कि vitelline झिल्ली (वीएम) भ्रूण के पृष्ठीय पक्ष विवशता के आधार पर, हम कल्पना की है कि वीएम बल विकासशील मस्तिष्क के मरोड़ पैदा करने के लिए आवश्यक प्रदान करता है । इसलिए, इस विधि में, हम VM कि मस्तिष्क मरोड़ पर प्रभाव को खोजने के लिए ब्रेन क्षेत्र को शामिल किया गया का हिस्सा हटा दिया । इसके अलावा, द्रव सतह तनाव लागू करने की विधि को वी एम के यांत्रिक भूमिका की पुष्टि और मस्तिष्क मरोड़, जो पहले नहीं किया गया था के लिए आवश्यक बल का एक अनुमान प्रदान किया गया था । भ्रूण morphogenesis के दौरान बलों को मापने एक चुनौतीपूर्ण काम है । विशेष रूप से, एक अग्रणी अध्ययन में, Campàs और सह कार्यकर्ता24 एक उपंयास विधि सेलुलर microdroplets इंजेक्शन का उपयोग तनाव यों तो विकसित । फिर भी, इस विधि को सेलुलर स्तर पर बलों को मापने के लिए, इसलिए लागू नहीं ऊतक पर जांच बलों या जीव स्तर सीमित था । इस पत्र में प्रस्तुत प्रोटोकॉल को आंशिक रूप से इस अंतर को भरने के लिए विकसित किया गया था ।

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Protocol

1. टिशू कल्चर मीडिया की तैयारी

  1. ४.५ g/l ग्लूकोज, सोडियम बिकारबोनिट, और एल glutamine के साथ संस्कृति मीडिया के लिए आधार के रूप में है Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के एक ०.५ एल बोतल का प्रयोग करें ।
  2. एक बाँझ लामिना प्रवाह हुड में, DMEM के ०.५ एल के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के 10 मिलीलीटर जोड़ें ।
  3. एक बाँझ पिपेट का उपयोग करना, एक बाँझ ५० एमएल शंकु ट्यूब के लिए DMEM एंटीबायोटिक दवाओं के समाधान के ५० मिलीलीटर स्थानांतरण.
  4. ५० मिलीलीटर में शेष DMEM एंटीबायोटिक दवाओं समाधान के लिए ०.५ एल बोतल में बाँझ हूड में जोड़ें ।
  5. ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब aliquots में-20 डिग्री सेल्सियस में अंतिम समाधान (बाद में चिकी संस्कृति मीडिया [सीसीएम] के रूप में संदर्भित) स्टोर ।

2. अंडा मशीन

  1. निषेचित विशिष्ट रोगज़नक़-मुक्त सफेद भाफ चिकन अंडे को साफ करने के लिए ७०% इथेनॉल के साथ नाजुक पोंछे का उपयोग करें । धारकों पर एक अनुदैर्ध्य उंमुखीकरण में अंडे की व्यवस्था ।
  2. ३७.५ डिग्री सेल्सियस का लक्ष्य तापमान सेट और ४८-५५% पर नमी बनाए रखने के लिए एक अंडा मशीन पर बारी । नमी पानी की एक उचित मात्रा में मशीन को जोड़ने के द्वारा नियंत्रित किया जाता है ।
  3. HH11 के लिए अंडे की मशीन-13, लगभग ४०-४४ एच ।
  4. अंडे को लगभग 15-30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ठंडा करने के लिए छिड़काव करने से पहले/७०% इथेनॉल के साथ सफाई ।

3. खींचो ग्लास केशिकाओं

  1. १.० मिमी के एक बाहरी व्यास और एक micropipette खींचने पर ०.५ mm के एक भीतरी व्यास के साथ एक 10 सेमी लंबे गिलास केशिका ट्यूबों माउंट ।
  2. गर्मी सेट और ७५० और ४००, क्रमशः के लिए मापदंडों खींचो । पतली सुइयों में केशिका ट्यूब खींचने के लिए पुल बटन दबाएँ ।

4. फ़िल्टर कागज वाहक विधि

  1. फिल्टर कागज से व्यास में लगभग 3 सेमी के हलकों में कटौती ।
  2. एक होल पंच का उपयोग कर सर्कल से 2 सेमी द्वारा मोटे तौर पर एक आयत 1 सेमी में कटौती । किसी भी फैलाया या तेज कोनों को दूर करने के लिए सुनिश्चित करें ।

5. भ्रूण कटाई और तैयारी

  1. नीचे से अंडे क्रैक, धीरे और ध्यान से एक १५० मिमी x 15 मिमी पेट्री डिश में सामग्री जमा करने के लिए अलग खोल खींचो । भ्रूण पक्ष सुनिश्चित करने के लिए ऊपर है, एक ही अभिविंयास वे जबकि उंहें खुर में गर्मी थे अंडे रखें ।
  2. एक डिस्पोजेबल पाश्चर पिपेट का उपयोग कर पतली एल्ब्युमिन निकालें ।
  3. कुंद समाप्त संदंश का उपयोग कर जर्दी से मोटी एल्ब्युमिन अलग । यह सुनिश्चित करें कि मोटी एल्ब्युमिन को हल्के से संदंश समाप्त होने के साथ जर्दी के शीर्ष परिमार्जन द्वारा हटा दिया गया है ।
  4. उपयोग ठीक संदंश इत्तला दे दी केंद्र के लिए और भ्रूण के ऊपर एक फिल्टर कागज अंगूठी जगह, भ्रूण की लंबी धुरी के साथ अंगूठी की लंबी धुरी मिलान ।
  5. कैंची के साथ फिल्टर कागज की अंगूठी आसपास की जर्दी में कटौती ।
  6. जहां जर्दी पहले काट दिया गया था साइट की ओर एक टेढ़ा दिशा में जर्दी से अंगूठी और भ्रूण खींचो ।
  7. कमरे के तापमान 1x फास्फेट (पंजाब) के साथ दो अनुक्रमिक १०० मिमी व्यंजन में भ्रूण कुल्ला ।
  8. पहले एक ३५ मिमी पेट्री डिश में एक फिल्टर कागज की अंगूठी रखें । तो फिर पहले से ही ३५ मिमी पेट्री डिश में फिल्टर कागज पर भ्रूण पृष्ठीय पक्ष जगह है ।
  9. फिल्टर पेपर सैंडविच के शीर्ष पर एक स्टेनलेस स्टील की अंगूठी रखें । भ्रूण को नुकसान न पहुंचाना सुनिश्चित करें ।
  10. प्रत्येक पेट्री डिश के लिए पहले से तैयार सीसीएम के 3 मिलीलीटर जोड़ें ।
  11. हल्के से भ्रूण के शीर्ष पार खींच केशिका सुई स्किम द्वारा प्रत्येक भ्रूण के वी एम निकालें और vm दूर छीलने, पूर्वकाल अंत से शुरू (forebrain के ऊपर सही) और notochord करने के लिए आगे बढ़ने (आंकड़ा 1a).
  12. १ १५० mm डिश है कि पानी के साथ लाइन में खड़ा किया गया था में ८ ३५ mm पेट्री व्यंजन प्लेस नाजुक कार्य पोंछे (नमी बनाए रखने के लिए) ।
  13. एक सील प्लास्टिक बैग में १५०-mm पेट्री डिश प्लेस तो एक गैस मिश्रण के साथ बैग भरने के ९५% हे2 और 5% CO2शामिल है ।
  14. बैग सील और यह एक ३७.५ डिग्री सेल्सियस मशीन में जगह है ।
  15. HH15-HH16 (चित्र 1b) तक एक अतिरिक्त 27 घंटे के लिए भ्रूण की मशीन ।

6. उत्प्रेरण सतह तनाव

  1. मशीन से भ्रूण निकालें और एक ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी (OCT) प्रणाली का उपयोग करने के लिए उंहें छवि । का प्रयोग करें अक्टूबर तंत्रिका ट्यूब (NT) (चित्रा 2) के मरोड़ कोण निर्धारित करने के लिए ।
  2. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के लिए भ्रूण स्थानांतरण और 10x आवर्धन पर कल्पना । पेट्री डिश से मीडिया के ०.२ मिलीलीटर को वृद्धिशील रूप से निकालने के लिए २०० microliter पिपेट का उपयोग करें ।
  3. भ्रूण पर मीडिया हवा इंटरफेस के प्रभाव का पालन करने के लिए प्रत्येक अंतराल पर brightfield छवियों को ले लो ।
  4. भ्रूण उत्प्रेरण मरोड़ (चित्रा 1C) भर में सतह तनाव तक मीडिया को दूर.
  5. छवि OCT प्रणाली का उपयोग कर एक बार फिर भ्रूण नियंत्रण की तुलना के लिए एक अंतिम मरोड़ कोण स्थापित करने के लिए भ्रूण ।  नोट: उज्ज्वल क्षेत्र छवियों एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्राप्त कर रहे थे । एक संलग्न माइक्रोस्कोप के साथ एक ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी प्रणाली क्रॉस-अनुभागीय छवि रहते भ्रूण के ढेर प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । छवियां एक 3 x 10 मिमी x 3 मिमी3 स्कैनिंग डोमेन में प्राप्त किया गया है, तो एक इमेजिंग सॉफ्टवेयर में कार्रवाई की । अंत में, भौतिक मॉडल छवियां एक डिजिटल एकल लेंस पलटा कैमरा के साथ ले जाया गया ।

7. सतह तनाव के शारीरिक मॉडलिंग/

  1. व्यावसायिक मॉडलिंग सॉफ्टवेयर में HH14-17 के बीच एक भ्रूण जैसा दिखता है कि एक सरलीकृत 3 डी ज्यामिति विकसित (चित्र 3ए).
  2. डिजाइन वाणिज्यिक 3 डी कंप्यूटर ग्राफिक्स सॉफ्टवेयर में 3 डी ज्यामिति के नकारात्मक मोल्ड ।
  3. एक 3d प्रिंटर १.७५ mm acrylonitrile ब्यूटाडाइन styrene रेशा के साथ भरा 3d प्रिंट डिजाइन मोल्ड, stereolithographic (. stl) प्रारूप में उपयोग करें ।
  4. मोल्ड कास्ट करने के लिए, बराबर भागों में सिलिकॉन रबर elastomer अवयव ए और बी मिश्रण और मोल्ड में मिश्रण तुरंत डालना; 12 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इलाज के लिए कास्टिंग मोल्ड सेट (चित्र 3 बी) ।
  5. मरोड़ कल्पना करने के लिए पृष्ठीय पक्ष पर NT साथ भ्रूण के भौतिक मॉडल मार्क ।
  6. एक coverslip का प्रयोग करें 3 डी शारीरिक मॉडल जो नकल करता है कि वी एम या सतह तनाव (चित्रा 3 डी) के लिए लागू बल दोहराने के लिए ।
  7. भौतिक मॉडल की ओर करने के लिए बराबर लंबाई के कठोर तारों की एक श्रृंखला डालें । coverslip मस्तिष्क मॉडल पर एक बाहरी बल डालती है के बाद, तारों के स्थान पर निर्भर करता है कि एक कोण पर झुका हो जाते हैं. प्रत्येक तार (चित्रा 3E) की मूल लंबाई से अधिक अनुमानित लंबाई के arctan द्वारा रोटेशन कोण का निर्धारण.

8. दिल पाश की दिशा में फेरबदल

  1. ३.१ और ३.२ में चरणों का पालन करें एक खींच केशिका ट्यूब प्राप्त करने के लिए ।
  2. भ्रूण तैयार करने के लिए ५.१० के माध्यम से ५.१ में चरणों का पालन करें ।
  3. फिल्टर पेपर फ्लिप करने के लिए संदंश की एक जोड़ी का इस्तेमाल करें ताकि भ्रूण ventral-साइड हो जाए ।
  4. splanchnopleure (SPL) झिल्ली में एक भट्ठा में कटौती करने के लिए खींचा केशिका ट्यूब का प्रयोग करें ।
  5. दाहिने हाथ की ओर से बाएं हाथ की ओर से दिल को धकेलने के लिए एक यांत्रिक बल लागू करने के लिए केशिका ट्यूब का प्रयोग करें ।
  6. ५.१२ के माध्यम से ५.१५ में चरणों का पालन करने के लिए मरोड़ में परिवर्तन का निरीक्षण ।

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Representative Results

इस अध्ययन में, HH11 पर भ्रूण के VM वक्ष flexure को पूर्वकाल अंत से हटा दिया गया था । भ्रूण एक अक्टूबर प्रणाली द्वारा छवि थे । इस स्तर पर, मस्तिष्क ट्यूब की मरोड़ (चित्र 1a) शुरू नहीं किया है । के बाद HH15-16 के लिए, उनके वी. बी. के साथ भ्रूण कम मस्तिष्क ट्यूब मरोड़, लगभग ३५ डिग्री (आंकड़ा 1b) को नियंत्रित भ्रूण, जो लगभग ९० डिग्री का मरोड़ प्रदर्शन की तुलना में निकाल दिया जा रहा है । जब मीडिया के स्तर पर उनकी वी एम एस के साथ भ्रूण के पृष्ठीय छोर पर सतह तनाव प्रेरित कम था हटा दिया, दिमाग नियंत्रण में उन लोगों के लिए तुलनीय स्तर पर मुड़ (चित्रा 1C) । चित्रा 2 अपने वक्ष अभिविन्यास कोण और कपाल उन्मुख कोण के रूप में चिह्नित (चित्रा 2a) के साथ एक एचएच 13 भ्रूण की एक प्रतिनिधि OCT छवि से पता चलता है । कोण NT (चित्र b, C) के क्रॉस-अनुभाग की अनुलंब स्थिति से मापा जाता है । हमारे प्रयोगों से परिणाम का सुझाव दिया है कि सामान्य मस्तिष्क ट्यूब मरोड़ भ्रूण के पृष्ठीय अंत पर बाहरी लोडिंग से प्रेरित है और इस आवश्यक लोड VM द्वारा आपूर्ति की जाती है20,25. इसके अलावा, एक सामांय भ्रूण में मस्तिष्क rightward जाता है के रूप में दिल पाश दाहिने हाथ की ओर जाता है, जबकि एक भ्रूण में दिल पाश के साथ एक प्रारंभिक चरण में बाएं हाथ की ओर से धक्का दिया (यानी, एचएच स्टेज 12 से पहले), मस्तिष्क भी बायी निंनलिखित बदल जाता है एक और 20 की मशीन के एच (चित्रा 3 सी रेफरी में. [12]), सुझाव है कि दिल की स्थिति मस्तिष्क मरोड़ में विषमता के परिणामस्वरूप ।

डेटा प्रयोगों में इकट्ठे हुए हमें HH14 से वी एम के बिना चिकी भ्रूण की एक सरलीकृत ज्यामिति पुनर्निर्माण के लिए सक्षम-17 (चित्रा 3) । इस गणना मॉडल में, मस्तिष्क और सही looped दिल घुमावदार छड़ के रूप में मॉडलिंग कर रहे थे । एक splanchnopleure (SPL) झिल्ली का प्रतिनिधित्व ब्लॉक हार्ट रॉड के साथ संपर्क किया गया । इस अभिकलनी मॉडल से एक नकारात्मक मोल्ड डिजाइन करके, 3 डी इस सांचे में ढालना मुद्रण, और एक सिलिकॉन elastomer के साथ मोल्ड कास्टिंग, हम सरलीकृत अभिकलनी ज्यामिति से एक भौतिक मॉडल गढ़े (चित्र बी-डी) । एक coverslip शारीरिक मॉडल के पृष्ठीय अंत पर नीचे दबाया यांत्रिक लोड VM या सतह तनाव से हमारे प्रयोगों से प्रदान की प्रतिकृति (चित्र 3d) । मॉडल एक वास्तविक भ्रूण के साथ तुलनीय ज्यामिति और मस्तिष्क मरोड़ दर्शाती है, HH14-17 (चित्रा 3E) के लिए पूर्व ovo संस्कृति ।

Figure 1
चित्रा 1: VM हटाया और rightward मस्तिष्क ट्यूब मरोड़ पर बाहरी ताकतों के प्रभाव के साथ भ्रूण के आकृति विज्ञान । (क) वी एम के साथ काटा भ्रूण HH11 पर हटा दिया । (ख) एक ही भ्रूण 27 एच पोस्ट VM हटाने कम मरोड़ दिखा के लिए मशीन । (ग) एक ही भ्रूण मस्तिष्क मरोड़, द्रव सतह तनाव के आवेदन पर गुजरा । (घ) एक तुलनीय चरण में सामान्य मस्तिष्क मरोड़ के साथ नियंत्रण भ्रूण. स्केल पट्टियां, (A-C) 1 मिमी, (D) 1 मिमी. छवियां 10x आवर्धन पर कब्जा कर लिया गया । रेफरी से अनुकूलित । [12] अनुमति के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: एक HH13 भ्रूण के अक्टूबर छवि । (क) यह आंकड़ा अपने वक्ष अभिविन्यास कोण पर (a) और उसके कपाल अभिविंयास कोण (b) पर मापा जाता है । (ख), (ग) एक पार के पदों पर NT के खंड (क) और (ख) । कोण एक ऊर्ध्वाधर स्थिति से मापा जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: मस्तिष्क मरोड़ का प्रदर्शन भ्रूण का एक भौतिक मॉडल. (क) HH14 पर वी एम के बिना एक लड़की भ्रूण की एक सरलीकृत ज्यामिति 17 (ख) सिलिकॉन elastomer एक लड़की भ्रूण के शारीरिक मॉडल । (ग) दाईं ओर दिल के साथ मॉडल का पृष्ठीय दृश्य । (घ) एक बाह्य एक coverslip द्वारा लागू बल के तहत मॉडल के पृष्ठीय दृश्य, rightward मस्तिष्क मरोड़ दिखाने के लिए शुरू । (ङ) चिकी भ्रूण संस्कृति पूर्व ovo मोड़ rightwards में तुलना के लिए HH14 पर शुरुआत । स्केल सलाखों, (बी डी) 1 सेमी, (ई) 1 मिमी. रेफरी से अनुकूलित [12] अनुमति के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

जबकि शारीरिक घटनाएं morphogenesis26,27,28,29,30, विशिष्ट यांत्रिक तंत्र में एक अभिंन भूमिका निभाते हैं, साथ यांत्रिक और के समंवय के साथ आणविक तंत्र, बड़े पैमाने पर बेरोज़गार रहते हैं । यह ज्ञात है कि आदिम मस्तिष्क के ventral flexure और rightward मरोड़ दो केंद्रीय प्रक्रियाओं है कि जल्दी भ्रूण में योगदान कर रहे हैं morphogenesis18,31,३२,३३, ३४, लेकिन कोई पूर्व अध्ययन मस्तिष्क मरोड़ के यांत्रिक मूल को संबोधित किया, जल्द से एक अंग स्तर के बाएं सही विषमता घटना ।

प्रोटोकॉल के प्रमुख कदम को हटाने के वी एम के मस्तिष्क मरोड़ और तरल पदार्थ की सतह तनाव के आवेदन के लिए यांत्रिक ड्राइविंग बल की पहचान करने के लिए आगे निष्कर्षों की पुष्टि शामिल हैं । इस तकनीक के निवारण के लिए प्रारंभिक चरण जिस पर वी एम को मरोड़ में महत्वपूर्ण परिवर्तन उत्पंन हटाया जाना चाहिए की पहचान हुई ।

वी एम के नीचे निष्क्रिय बल बढ़ती भ्रूण मस्तिष्क ट्यूब के लिए एक मौलिक यांत्रिक सीमा होने के लिए दिखाया गया था । जब भ्रूण के वीएम हटा दिया गया था, मस्तिष्क अब एक सामान्य डिग्री करने के लिए twists लेकिन द्रव स्तर को कम करके सतह तनाव के बाद आवेदन के माध्यम से नियंत्रण के स्तर को मोड़ करने के लिए बनाया जा सकता है. परिवेश के तापमान पर पानी की ज्ञात सतह तनाव ७२.०१ ± ०.१ mN/एम है, और संपर्क लंबाई मिलीमीटर के आदेश की है, तो बल की गणना की जा सकती है । जिससे हम अनुमान वी एच 14-17 भ्रूण12पर लगभग 10 mN के एक बल डालती है ।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर, हम यह निर्धारित करने में सक्षम थे कि VM भ्रूण मस्तिष्क मरोड़ में महत्वपूर्ण यांत्रिक भूमिका निभाता है. इस नए प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्राप्त परिणामों से पता चलता है कि VM भ्रूण morphogenesis के दौरान सामान्य मस्तिष्क मरोड़ की प्रगति के लिए एक महत्वपूर्ण संरचना है, के रूप में यह ज्यामितीय बाधाओं और यांत्रिक घुमा के लिए आवश्यक लोड की आपूर्ति ब्रेन३५. परिणामों ने यह भी संकेत दिया कि हृदय की स्थिति मस्तिष्क मरोड़ की दिशा निर्धारित करती है. विकास के दौरान भ्रूण की एल-आर विषमता दिल की एक सही-पाश आकार की ओर जाता है, जो बारी ड्राइव में rightward घुमा मस्तिष्क के३६,३७,३८,३९. यह उल्लेख है कि दिल की स्थिति को बदलने के यांत्रिक विधि अंय शोधकर्ताओं द्वारा विकसित रासायनिक विधि से अलग है लायक है13 और morphogenesis में यांत्रिकी की भूमिका delineating के लिए बेहतर है । कुल मिलाकर, हमारे परिणाम लड़की भ्रूण में मरोड़ मस्तिष्क morphogenesis ड्राइविंग में यांत्रिकी के मौलिक भूमिका वर्णन ।

भविष्य में, प्रोटोकॉल की पहचान कैसे आनुवंशिक और यांत्रिक कारकों को एक साथ नियमित रूप से भ्रूण मरोड़ और अनावरण कैसे इन विभिंन कारकों संगीत कार्यक्रम में काम करने के लिए उपयुक्त morphogenesis सुनिश्चित लागू किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव की घोषणा ।

Acknowledgments

Z.C. डार्टमाउथ प्रारंभमें कोष और Branco Weiss-विज्ञान फैलोशिप, ETH ज्यूरिख द्वारा प्रशासित के लिए सोसायटी से समर्थन स्वीकार करता है । लेखकों ने डीआरएस का शुक्रिया अदा किया । लैरी ए टाबर, Benjamen ए. Filas, Qiaohang गुओ, और उपयोगी चर्चा के लिए Yunfei शि, साथ ही टिप्पणियों के लिए अनाम समीक्षक । यह सामग्री अनुदान नहीं के तहत राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन स्नातक अनुसंधान फैलोशिप द्वारा समर्थित काम पर आधारित है । डीजीई-१३१३९११. किसी भी राय, निष्कर्षों, और निष्कर्ष या सिफारिशों इस सामग्री में व्यक्त लेखकों (ओं) के वे कर रहे है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन के विचारों को प्रतिबिंबित ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fertilized Specific pathogen-free White Leghorn chicken eggs Charles River
Optical Coherent Tomography Microscope Thorlabs GAN220C1
Silicone elastomer Smooth-On, Inc. EcoFlex 00-50
Dissecting microscope Leica MZ8
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) Lonza 12-604F
Antibiotics Sigma P4083
Chick serum Sigma C5405
Micropipette puller Sutter Instrument Model P-30
Filter paper Whatman 5202-110
Phosphate buffered saline (PBS) Corning 21-040-CV
Comsol MultiPhysics Comsol
3D computer graphics software Rhino 5
Microscope attached with OCT Nikon  FN1
Digital single-lens reflex camera EOS  Rebel T3i

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Taber, L. A. Biomechanics of Growth, Remodeling, and Morphogenesis. Appl. Mech. Rev. 48, 487-545 (1995).
  2. Wyczalkowski, M. A., Chen, Z., Filas, B. A., Varner, V. D., Taber, L. A. Computational models for mechanics of morphogenesis. Birth Defects Research Part C - Embryo Today: Reviews. 96, 132-152 (2012).
  3. Savin, T., et al. On the growth and form of the gut. Nature. 476, 57-62 (2011).
  4. Gjorevski, N., Nelson, C. M. The mechanics of development: Models and methods for tissue morphogenesis. Birth Defects Research Part C - Embryo Today: Reviews. 90, 193-202 (2010).
  5. Shyer, A. E., et al. Villification: how the gut gets its villi. Science. 342, 212-218 (2013).
  6. Ambrosi, D., et al. Perspectives on biological growth and remodeling. Journal of the Mechanics and Physics of Solids. 59, 863-883 (2011).
  7. Chen, Z., Majidi, C., Srolovitz, D. J., Haataja, M. Tunable helical ribbons. Appl. Phys. Lett. 98, (2011).
  8. Gerbode, S. J., Puzey, J. R., McCormick, A. G., Mahadevan, L. How the cucumber tendril coils and overwinds. Science. 337, 1087-1091 (2012).
  9. Armon, S., Efrati, E., Kupferman, R., Sharon, E. Geometry and mechanics in the opening of chiral seed pods. Science. 333, 1726-1730 (2011).
  10. Filas, B. A., et al. A potential role for differential contractility in early brain development and evolution. Biomech. Model. Mechanobiol. 11, 1251-1262 (2012).
  11. Xu, G., et al. Axons pull on the brain, but tension does not drive cortical folding. J. Biomech. Eng. 132, 71013 (2010).
  12. Chen, Z., Guo, Q., Dai, E., Forsch, N., Taber, L. A. How the embryonic chick brain twists. J. R. Soc. Interface. 13, (2016).
  13. Manca, A., et al. Nerve growth factor regulates axial rotation during early stages of chick embryo development. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 2009-2014 (2012).
  14. Shi, Y., Yao, J., Xu, G., Taber, L. a Bending of the looping heart: differential growth revisited. J. Biomech. Eng. 136, 1-15 (2014).
  15. Shi, Y., et al. Bending and twisting the embryonic heart: A computational model for c-looping based on realistic geometry. Front. Physiol. 5, (2014).
  16. Taber, L. A. Morphomechanics: Transforming tubes into organs. Current Opinion in Genetics and Development. 27, 7-13 (2014).
  17. Hosseini, H. S., Beebe, D. C., Taber, L. A. Mechanical effects of the surface ectoderm on optic vesicle morphogenesis in the chick embryo. J. Biomech. 47, 3837-3846 (2014).
  18. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Dev. Dyn. 88, 49-92 (1951).
  19. Shi, Y., Varner, V. D., Taber, L. a Why is cytoskeletal contraction required for cardiac fusion before but not after looping begins? Phys. Biol. 12, 16012 (2015).
  20. Garcia, K. E., Okamoto, R. J., Bayly, P. V., Taber, L. A. Contraction and stress-dependent growth shape the forebrain of the early chicken embryo. J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 65, 383-397 (2017).
  21. Faisst, A. M., Alvarez-Bolado, G., Treichel, D., Gruss, P. Rotatin is a novel gene required for axial rotation and left-right specification in mouse embryos. Mech. Dev. 113, 15-28 (2002).
  22. Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. a, Butcher, J. T. An ex-ovo chicken embryo culture system suitable for imaging and microsurgery applications. J. Vis. Exp. (44), (2010).
  23. Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Dev. Dyn. 220, 284-289 (2001).
  24. Campàs, O., et al. Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues. Nat. Methods. 11, 183-189 (2014).
  25. Schierenberg, E., Junkersdorf, B. The role of eggshell and underlying vitelline membrane for normal pattern formation in the early C. elegans embryo. Roux's Arch. Dev. Biol. 202, 10-16 (1992).
  26. Chuai, M., Weijer, C. J. The Mechanisms Underlying Primitive Streak Formation in the Chick Embryo. Current Topics in Developmental Biology. 81, 135-156 (2008).
  27. Voronov, D. A., Alford, P. W., Xu, G., Taber, L. A. The role of mechanical forces in dextral rotation during cardiac looping in the chick embryo. Dev. Biol. 272, 339-350 (2004).
  28. Raya, A., Izpisua Belmonte, J. C. Unveiling the establishment of left-right asymmetry in the chick embryo. Mechanisms of Development. 121, 1043-1054 (2004).
  29. Voronov, D. A., Taber, L. A. Cardiac looping in experimental conditions: Effects of extraembryonic forces. Dev. Dyn. 224, 413-421 (2002).
  30. Chen, Z., Huang, G., Trase, I., Han, X., Mei, Y. Mechanical Self-Assembly of a Strain-Engineered Flexible Layer: Wrinkling, Rolling, and Twisting. Phys. Rev. Appl. 5, (2016).
  31. Manner, J., Seidl, W., Steding, G. Formation of the cervical flexure: an experimental study on chick embryos. Acta Anat. (Basel). 152, 1-10 (1995).
  32. Ware, M., Schubert, F. R. Development of the early axon scaffold in the rostral brain of the chick embryo. J. Anat. 219, 203-216 (2011).
  33. Ramasubramanian, A., et al. On the role of intrinsic and extrinsic forces in early cardiac S-looping. Dev. Dyn. 242, 801-816 (2013).
  34. Hoyle, C., Brown, N. a, Wolpert, L. Development of left/right handedness in the chick heart. Development. 115, 1071-1078 (1992).
  35. Nerurkar, N. L., Ramasubramanian, A., Taber, L. A. Morphogenetic adaptation of the looping embryonic heart to altered mechanical loads. Dev. Dyn. 235, 1822-1829 (2006).
  36. Levin, M. Left-right asymmetry and the chick embryo. Semin. Cell Dev. Biol. 9, 67-76 (1998).
  37. Roebroek, A. J., et al. Failure of ventral closure and axial rotation in embryos lacking the proprotein convertase Furin. Development. 125, 4863-4876 (1998).
  38. Peebles, D. M., et al. Magnetic resonance proton spectroscopy and diffusion weighted imaging of chick embryo brain in ovo. Dev. Brain Res. 141, 101-107 (2003).
  39. Zhu, L., et al. Cerberus regulates left-right asymmetry of the embryonic head and heart. Curr. Biol. 9, 931-938 (1999).

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Li, Y., Grover, H., Dai, E., Yang,… More

Li, Y., Grover, H., Dai, E., Yang, K., Chen, Z. Probing the Roles of Physical Forces in Early Chick Embryonic Morphogenesis. J. Vis. Exp. (136), e57150, doi:10.3791/57150 (2018).

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