Summary
ここでは、一連の新しいex ovo実験と初期ニワトリ胚の脳ねじり中に形態形成の仕組みを勉強するための物理的なモデリング アプローチを紹介プロトコルを提案します。
Abstract
萌芽期の開発、分子遺伝学の観点から検討する伝統的が形態形成における力学の基本的な重要性がますます認識になります。特に、鶏胚心と脳管、抜本的な形態学的変化を受けることを開発する際、形態形成における物理的な力の役割を研究する首相候補の中では。進歩的な腹曲げと管状初期胚の脳の右ねじりは、ニワトリ胚の器官レベルの左右非対称性の初期の段階で起こる。卵黄膜 (VM) は、胚の背側を固定され、脳の発達のねじりを誘導するために必要な力を提供することに関与しています。新しいex ovo実験と物理脳ねじりの力学を識別するためにモデリングの組み合わせをご紹介します。ハンバーガー ハミルトン 11 段階で胚が収穫され、培養ovo ex (メディアで)。VM では、引っ張られたキャピラリー チューブを使用して削除されます後。流体のレベルを制御して胚を液体空気インターフェイスに服従させることで、メディアの流体の表面張力は、VM の力学的役割を交換する使用できます。マイクロサージャリー実験は脳ねじりのカイラリティの結果の変化を見つける心の位置を変更するも行った。このプロトコルからの結果は、運転形態形成の力学の基本的な役割を示しています。
Introduction
現代の発生生物学研究は主として分子遺伝学1,2,3,4,5,6の観点から理解開発に焦点を当ててください。,7,8,9,10,11,12,13それは知られている物理現象が形態形成の中心的な役割を再生または生物の生成フォーム14,15,16,17;。しかし、開発の機械的なメカニズムは特定のまま主巧まない。原始的な脳管後ハンバーガー ハミルトン ステージ 11 (HH 11)18胚の形に貢献する 2 つの主要なプロセスの右の捩り及び腹側曲げ19,20を変更します。特に、胎生期の脳のねじれの開発の基になる物理的なメカニズムは不完全な理解のままになります。
ニワトリ胚の胚のねじりは開発で左右 (L R) 非対称性の最も早い形成イベントです。左右非対称のプロセスを摂動21内臓逆位、異性、または内臓などの先天異常が発生します。
初期の胎生期脳開発中に機械力を特徴付ける物理モデリングとex ovo実験22,23を組み合わせたプロトコルをご紹介します。提示方法の目標は、脳のねじりおよび初期開発12の中にねじりの程度に影響する要因を担当の機械力を識別するためにです。卵黄膜 (VM) が胚の背側を拘束実験観察に基づいて、VM が発展途上の脳のねじりを誘導するために必要な力を提供することを行った。したがって、この方法では、脳のねじりに及ぼす影響を調べる脳領域をカバーする VM の一部を削除しました。さらに、流体の表面張力を適用する方法は、VM の力学的役割を確認し、脳の捻転は、以前行われていないために必要な力の見積もりを提供する使用されました。萌芽期の形態形成時に力を測定は、やりがいのある仕事です。特に、先駆的な研究では、Campàs と同僚の24は、注入された微小油滴中を使用して携帯電話の応力を定量化する手法を開発しました。それにもかかわらず、このメソッドは、軍組織または個体レベルでのプローブには適用されませんので、細胞レベルで力を測定するに限られていた。本稿で提示されたプロトコルは、部分的にこのギャップを埋めるために開発されました。
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Protocol
1. 培養媒体の作製
- 4.5 G/L グルコース、炭酸水素ナトリウム、L-グルタミンと文化メディアの拠点として 0.5 L ボトル ダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) を使用します。
- 滅菌の層流フードの DMEM の 0.5 L に抗生物質の 10 mL を追加します。
- 滅菌ピペットを使用して、滅菌 50 mL の円錐管に DMEM 抗生物質溶液 50 mL を転送します。
- ニワトリ血清の 50 mL を無菌フード 0.5 L ボトルに残り DMEM 抗生物質ソリューションに追加します。
- 最終的な解決 (と呼ばれる来世にひよこ文化メディア [CCM]) 50 mL コニカル チューブ因数-20 ° C で保存します。
2. 卵孵化
- 繊細な使用を受精特定病原体フリーの白色レグホンの鶏の卵をきれいにする 70% エタノール ワイプします。ホルダーに縦方向に卵を配置します。
- 37.5 ° C の目標温度を設定して 48-55% の湿度を維持する卵のインキュベーターを入れます。湿度は、インキュベーターに水の適切な量を追加することによって制御されます。
- HH11 月 13 日、約 40-44 時間卵を孵化させなさい。
- 卵は 70% エタノールを噴霧・洗浄の前に約 15-30 分の室温で冷却させてください。
3. ガラス管を引く
- マイクロ ピペットの引き手の外側直径 1.0 mm と 0.5 mm の内径 10 cm 長いガラス毛細管をマウントします。
- 熱を設定、それぞれ 750、400、パラメーターを引き出します。細い針にキャピラリー チューブを引っ張ってプル ボタンを押します。
4. フィルター ペーパー キャリア方式
- ろ紙から直径約 3 cm の円をカットします。
- 矩形をカット約 1 cm 2 cm 穴パンチャーを使用して円から。または鋭いコーナーなど任意の突出を削除することを確認します。
5. 胚の収穫と調製
- 底から卵を割る、離れてシェルを軽く引いて、慎重に内容を 150 mm × 15 mm のペトリ皿に入金します。胎児側を確保するために、卵をおいてそれらを割れしながら培養彼ら同じ向きです。
- 使い捨てのパスツール ピペットを使用して薄いアルブミンを削除します。
- 鈍終了した鉗子を使用して卵黄から厚いアルブミンを区切ります。鈍終了した鉗子で卵黄の上部を軽く削って厚いアルブミンが削除されていることを確認します。
- 細い鉗子を使用して、センター、胚、胎児の長軸とリングの長軸に一致する上フィルター ペーパー リングを配置します。
- ハサミでフィルター ペーパー リングを取り巻く卵黄をカットします。
- 卵黄がカットされた最初サイトに向かって斜め方向にリングと、卵黄の胚を引き出します。
- 室温 1 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x の 2 つの連続 100 mm 料理で胚をすすいでください。
- 最初の 35 mm のシャーレに濾紙リングを配置します。配置胚の背側をフィルター紙の上にすでに 35 mm シャーレ。
- ステンレス製リング フィルター ペーパー サンドイッチの上に配置します。胎児を害することのないことを確認します。
- 各ペトリ皿に事前に準備された CCM の 3 mL を追加します。
- 胚と離れての VM を剥離、(右脳) 上前方の端から始まって、(図 1 a) 脊索に進むの上部に軽く引っ張られた細針をスキミングしてそれぞれの胚の VM を削除します。
- (湿度を維持) を水に飽和繊細なタスク ワイプが並んでいた 1 つの 150 の mm の皿に 8 の 35 mm のペトリ皿を配置します。
- 密閉式のビニール袋に 150 mm のペトリ皿の場所は、95% O2と 5% CO2から成る混合ガス袋を記入してください。
- 袋を密封し、37.5 ° C の定温器。
- HH15-HH16 (図 1 b) まで追加 27 h の胚を孵化させなさい。
6. 表面張力を誘発します。
- インキュベーターから胚を削除し、それらのイメージを光コヒーレンス断層法 (OCT) システムを使用します。神経管 (NT) (図 2) のねじりの角度を決定する使用 10 月。
- 光学顕微鏡に胚を転送し、倍率 10 倍で可視化します。200 1 マイクロリットル ピペットを使用して、増分ペトリ皿からメディアの 0.2 mL を削除します。
- メディア エアインタ フェースの胚に及ぼす影響を観察する間隔ごとに明視野画像を取る。
- 胚の間で表面張力を誘発するねじり (図 1) までは、メディアを削除します。
- OCT システムをもう一度使用して胚を制御する比較のための最終的なねじり角度を確立する胚をイメージします。 注: 明視野画像は解剖顕微鏡による買収されました。接続されている顕微鏡を用いた光波コヒーレンス断層撮影システムは、生きている胚の断面画像のスタックを取得する使用されました。画像が 3 × 10 mm × 3 mm3スキャン ドメインで取得し、イメージング ソフトウェアで処理します。最後に、物理的なモデル画像はデジタル単一レンズの反射カメラで撮影されました。
7 表面張力/VM 軍の物理モデリング
- HH14 - 17 商業モデリング ソフト (図 3 a) の胚のような簡素化した 3 D ジオメトリを作成します。
- 市販の 3 D コンピューター グラフィックス ソフトウェアの 3D ジオメトリの負の金型を設計します。
- 1.75 mm アクリロニ トリル ブタジエン スチレン フィラメント 3 d 搭載 3 D プリンターの使用は、stereolithographic (.stl) 形式で設計された金型を印刷します。
- 金型をキャストするには、シリコーン ゴム エラストマー部品 A と B の等しい部分をミックスし、速やかに対処、金型にミックスを注ぐ12 h (図 3 b) 室温で硬化する鋳型を設定します。
- ねじりを視覚化する背側に NT に沿って胚の物理モデルをマークします。
- 観察を使用して、複製の VM または表面張力 (図 3 D) を模倣する 3 D 物理モデルに適用された力。
- 一連の物理モデルの側面に同じ長さの堅いワイヤーを挿入します。Coverslip 脳モデルを外部の力を発揮後、ワイヤーになる場所に依存する角度で傾いています。各ワイヤ (図 3E) の元の長さに投影された長さの arctan によって回転角度を決定します。
8. 心ループの方向を変更します。
- 3.1 と 3.2 引っ張られたキャピラリー チューブを取得する手順に従います。
- 胚の準備に 5.10 を 5.1 で手順に従います。
- 胚の腹側アップになるので、フィルター紙を反転するのにピンセットのペアを使用します。
- Splanchnopleure (SPL) 膜に開いているスリットを切りに引っ張られたのキャピラリー チューブを使用します。
- キャピラリー チューブを使用して、右側から左側に中心部をプッシュする機械的な力を発揮します。
- ねじりの変化を観察する 5.15 を 5.12 に手順に従います。
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Representative Results
本研究では HH11 で胚の VM は胸部の純曲げを前方から削除されました。OCT システムによる胚をイメージしました。この段階で脳管のねじりはありません (図 1 a) を開始しました。HH15 16 に産み落とされていた後削除の VM を持つ胚は低脳管のねじり、約 35 度 (図 1 b) 90 度前後のねじりを表わす胚をコントロールと比較して展示。Vm を削除して胚の背側表面張力を誘発するメディアのレベルが下げられ、脳はコントロール胚 (図 1) に匹敵するレベルにツイスト。胸部方向角と頭蓋の姿勢角度 (図 2 a) をマーク HH 13 胚の代表 10 月イメージを図 2に示します。角度は、NT (図 2 b, C) の断面の垂直位置から計測されます。当社の実験から示唆された正常な脳管のねじりが胚の背側で外部読み込みによって駆動されることと、この本質的な負荷は、VM20,25。また、脳になります右心ループは右側に行く心で胚のループまた押される左側に (すなわち、HH ステージ 12 の前に)、早い段階で脳に対し、正常な胚発生ターン左次インキュベーション (文献 [12] で図 3 c) の別の 20 h は、心臓の位置がねじれ脳の非対称性の結果を示唆しています。
実験で収集したデータでは、HH14 17 (図 3 a) から VM なしニワトリ胚の簡素化したジオメトリを再構築することができました。この計算モデルで脳と右ループ心は、湾曲した棒としてモデル化しました。Splanchnopleure (SPL) 膜を表すブロックは中心の棒との接触だった。このモデルから否定的な金型を設計することにより 3 D 印刷この金型とシリコーン ・ エラストマーの鋳型を作製した (図 3 b-D) 簡易計算幾何学から物理モデル。物理モデルの背側下方に押された coverslip VM または実験の結果 (図 3 D) 表面張力によって提供される機械の負荷をレプリケートされます。モデル展示匹敵する幾何学と脳ねじり実際の胚を培養ex ovo HH14 17 (図 3E) します。
図 1: 削除の VM と胚と右脳管のねじりに及ぼす外力の形態。(A) HH11 で収穫胚の vm が削除されます。(B)同じ胚培養 27 h ポスト VM 除去減少を示すねじり。(C)同じ胚脳ねじり、流体の表面張力の申請を受けた。(D)制御胚匹敵する段階で正常な脳ねじれ。尺度バー、(A ~ C) 1 mm、(D) mm 1。 画像が 10 倍の倍率で撮影されました。権限を持つ文献 [12] から適応。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: HH13 胚の OCT 画像。(A)図はその胸部角度でマーク (、) とその頭蓋の姿勢角度測定 (b)。(B)、(C)位置 (a) と (b) で NT の断面。角度が垂直位置から計測されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 脳のねじれを示す胚の物理的なモデル。(A)ニワトリ胚の HH14 17 (B)シリコーンのエラストマー物理モデルで VM なしニワトリ胚の簡素化したジオメトリ。(C)心でモデルの右側にある背側ビュー。(D)右脳ねじりを見せ始めて観察による外力の下でモデルの背面。(E)ニワトリ胚培養ex ovo角丸 HH14 で比較のためにツイストし始めています。尺度バー、(B D) 1 cm、(E) 1 mm. 文献 [12] から適用した権限を持つ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
物理現象形態26,27,28,29,30機械の調整と共に、特定の機械的メカニズムに不可欠な役割を果たす一方、分子機構は、主として未踏のままです。腹側の曲げと原始的な脳の右ねじり初期胚形態形成18,31,32,33に貢献する 2 つの中央プロセスが知られています。 34, しかし、どんな事前の研究解決脳ねじり最古の器官レベルの左右非対称性のイベントの一つの機械の起源。
脳ねじり機械原動力を識別するために VM の取り外しとさらに結果を確認する流体の表面張力のアプリケーション プロトコルの主要な手順が含まれます。この手法のトラブルシューティングは VM をねじりで重要な変化を誘発する削除する必要があります最初の段階を識別するために起こった。
VM の下方パッシブ型力覚は成長の胚の脳管の基本的な力学的境界を示した。胚の VM が削除されました、もはや脳は通常程度のねじれが流体のレベルを下げることによって表面張力の後続のアプリケーションを介してコントロール レベルにツイストさせる可能性があります。周囲温度での水の知られている表面張力は 72.01 ± 0.1 mN/m とミリは、接触の長さ、力が計算できます。それにより VM HH 14 17 胚12約 10 mN の力の発揮を推定しました。
このプロトコルを使用すると、VM が胎生期脳ねじりにおける重要な力学的役割を果たしていることを決定することができました。この新しいプロトコルを使用して得られた結果が幾何拘束および機械負荷のねじるために必要な提供 VM は胚形態形成時に正常な脳のねじりの進行の重要な構造であることを示唆、脳の35。また、心臓の位置が脳ねじりの方向を決定することが示唆されました。開発中に胚の左右非対称発生は右ループ状脳36,37,38,39の右ねじれを順に駆動する心につながります。心臓の位置の変位の機械的な方法が13その他の研究者によって開発された化学的手法とは異なる、形態形成の力学の役割の輪郭を描くためによりよいを言及する価値があります。完全に、我々 の結果は力学の鶏胚のねじれ脳の形態形成を推進する上での基本的な役割を示しています。
プロトコルが適用して一緒にどのように遺伝的・機械的要因を識別するために、今後、通常の胚ねじり適切な形態形成を確保するためコンサートでこれらのさまざまな要因がどのように機能を発表。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
Z.C. は、ダートマス スタートアップ資金とブランコ ヴァイスシュヴァルツ-社会科学フェローシップ、ETH チューリッヒによって管理されてからのサポートを認めています。著者は、本ラリー A. テーバー、Benjamen A. Filas、Qiaohang 郭と役に立つ議論のため Yunfei 市として匿名の校閲者のコメントをありがとうございます。この資料は、国立科学財団大学院研究奨学金助成号下に支えられて仕事に基づいていますDGE-1313911。意見、所見、結論または本資料に示した推奨事項著者 (s) のものし、国立科学財団の見解を必ずしも反映されません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized Specific pathogen-free White Leghorn chicken eggs | Charles River | ||
| Optical Coherent Tomography Microscope | Thorlabs | GAN220C1 | |
| Silicone elastomer | Smooth-On, Inc. | EcoFlex 00-50 | |
| Dissecting microscope | Leica | MZ8 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Lonza | 12-604F | |
| Antibiotics | Sigma | P4083 | |
| Chick serum | Sigma | C5405 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-30 | |
| Filter paper | Whatman | 5202-110 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Comsol MultiPhysics | Comsol | ||
| 3D computer graphics software | Rhino 5 | ||
| Microscope attached with OCT | Nikon | FN1 | |
| Digital single-lens reflex camera | EOS | Rebel T3i |
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