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Bioengineering

Os papéis de forças físicas no início Chick embrionárias morfogênese de sondagem

Published: June 5, 2018 doi: 10.3791/57150
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1
1Thayer School of Engineering, Dartmouth College, 2Department of Bioengineering, University of Pennsylvania
* These authors contributed equally

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo introduzindo um conjunto de novas experiências de ex-ovo e abordagens de modelagem física para estudar a mecânica da morfogênese durante a torção de cérebro embrionário precoce garota.

Abstract

Desenvolvimento embrionário é tradicionalmente estudado do ponto de vista da genética biomolecular, mas a importância fundamental da mecânica na morfogênese está se tornando cada vez mais reconhecida. Em particular, o tubo de coração e cérebro de garota embrionárias, que passam por drásticas mudanças morfológicas como elas se desenvolvem, estão entre os principais candidatos para estudar o papel das forças físicas na morfogênese. Progressiva de flexão ventral e torção para a direita do cérebro tubular embrionário garota acontecem no estágio mais adiantado de assimetria de esquerda-direita-nível de órgão no desenvolvimento embrionário de garota. A membrana vitelínico (VM) restringe o lado dorsal do embrião e tem sido implicada em fornecer a força necessária para induzir a torsão do cérebro em desenvolvimento. Aqui apresentamos uma combinação de novas experiências de ex-ovo e física de modelagem para identificar a mecânica da torsão do cérebro. Fase de Hamburger-Hamilton 11, os embriões são colhidos e culta ex ovo (nos meios de comunicação). O VM é subsequentemente removido usando um tubo capilar puxado. Controlando o nível do fluido e submetendo o embrião para uma interface líquido-ar, a tensão de superfície líquida dos meios de comunicação pode ser usada para substituir o papel mecânico da VM. Também realizaram-se experimentos de microcirurgia para alterar a posição do coração para encontrar a mudança resultante na quiralidade de torção do cérebro. Os resultados do presente protocolo ilustram as funções fundamentais da mecânica na condução morfogênese.

Introduction

Biologia do desenvolvimento moderno investigação centra-se em grande parte sobre o desenvolvimento da compreensão do ponto de vista da genética molecular,1,2,3,4,5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. é conhecido que fenômenos físicos desempenham um papel central na morfogênese, ou a geração de biológicas forma14,15,16,17; no entanto, os mecanismos mecânicos específicos de desenvolvimento permanecem em grande parte espontâneo. Flexão ventral e torção para a direita do tubo cérebro primitivo após Hamburger-Hamilton palco 11 (11 HH)18 são os dois principais processos que contribuem para a forma embrionária de mudança19,20. Em particular, o mecanismo físico subjacente ao desenvolvimento torcional no cérebro embrionário permanece insuficientemente compreendido.

A torsão embrionária no embrião do pintinho está entre os primeiros eventos morfogenéticas de assimetria de esquerda-direita (L-R) em desenvolvimento. Quando o processo de assimetria L-R é perturbado, defeitos de nascimento como situs inversus, isomerismoou heterotaxia ocorrerá21.
Aqui nós apresentamos um protocolo que combina ex-ovo experimentos22,23 com modelagem física para caracterizar as forças mecânicas durante o início do desenvolvimento embrionário do cérebro. O objetivo do método apresentado é identificar as responsável pelo cérebro torção e os fatores que afetam o grau de torção durante o início do desenvolvimento12de forças mecânicas. Baseado na observação experimental de que a membrana vitelínico (VM) restringe o lado dorsal do embrião, formulamos a hipótese que a VM fornece a força necessária para induzir a torsão do cérebro em desenvolvimento. Portanto, neste método, retiramos a parte da VM que cobre a área do cérebro para descobrir os efeitos na torção do cérebro. Além disso, o método de aplicar a tensão de superfície líquido foi usado para confirmar o papel mecânico da VM e fornecer uma estimativa da força necessária para a torção do cérebro, que não tinha sido feita anteriormente. As forças de medição durante a morfogénese embrionária é uma tarefa desafiadora. Notavelmente, em um estudo pioneiro, Campàs e colegas de trabalho24 desenvolveu um novo método para quantificar as tensões celulares usando microdroplets injetado. No entanto, esse método foi limitado a medir forças a nível celular, portanto, não aplicável para sondar as forças ao nível de tecido ou organismo. O protocolo apresentado neste trabalho foi desenvolvido para preencher parcialmente essa lacuna.

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Protocol

1. preparação de meios de cultura de tecido

  1. Use uma garrafa de 0,5 L de meio modificado águia de Dulbecco (DMEM) com 4,5 g/L glicose, bicarbonato de sódio e L-glutamina como base para os meios de cultura.
  2. Em uma capa de estéril de fluxo laminar, adicione 10 mL de antibióticos para a 0,5 L de DMEM.
  3. Usando uma pipeta esterilizada, transferi 50 mL da solução de antibióticos de DMEM para um tubo cônico estéril 50 mL.
  4. Adicione 50 mL de soro de garota para a solução de antibióticos DMEM restante na garrafa 0,5 L de capuz estéril.
  5. Armazenar a solução final (referida daqui por diante como garota de meios de cultura [CCM]) em alíquotas de 50 mL tubo cônico a-20 ° C.

2. ovo incubação

  1. Uso delicado toalhetes com álcool 70% para limpar específicos isentos de organismos patogénicos Leghorn branca frango ovos fertilizados. Organize os ovos em uma orientação longitudinal nos suportes.
  2. Transformar em uma incubadora do ovo para definir uma temperatura-alvo de 37,5 ° C e manter a umidade em 48-55%. A umidade é controlada pela adição de uma quantidade adequada de água para a incubadora.
  3. Incube os ovos de HH11-13, cerca de 40-44 h.
  4. Deixe que os ovos esfriarem em temperatura ambiente por cerca de 15-30 min antes da pulverização e limpeza com etanol a 70%.

3. Puxe a capilares de vidro

  1. Monte um 10 tubos capilares de vidro cm de comprimento com um diâmetro exterior de 1,0 mm e um diâmetro interno de 0,5 mm em um extrator da micropipeta.
  2. Definir o calor e puxe parâmetros para 750 e 400, respectivamente. Pressione o botão de tração para puxar o tubo capilar em finas agulhas.

4. filtro de papel método de transportadora

  1. Corte círculos de aproximadamente 3 cm de diâmetro de papel de filtro.
  2. Corte um retângulo aproximadamente 1 cm por 2 cm do círculo usando um furador. Certifique-se de remover quaisquer salientes ou cantos em ponto.

5. o embrião da colheita e preparação

  1. Quebrar ovos do fundo, separe o shell suavemente e cuidadosamente depositar o conteúdo em uma placa de Petri 150 x 15 mm. Para garantir que o lado do embrião é acima, mantenha os ovos na mesma orientação que eles foram incubados enquanto estalar os.
  2. Remova a albumina fina utilizando uma pipeta de Pasteur descartável.
  3. Separe a gema usando fórceps terminou sem corte a albumina espessa. Certifique-se de que a albumina espessa foi removida raspando levemente a parte superior da gema com a pinça terminou sem corte.
  4. Use pinça de ponta fina para centralizar e coloque um anel de papel de filtro sobre o embrião, combinando o longo eixo do anel com o longo eixo do embrião.
  5. Corte a gema ao redor do anel de filtro de papel com uma tesoura.
  6. Puxe o anel e o embrião fora a gema em uma direção oblíqua em direcção ao local onde a gema primeiro foi cortada.
  7. Lave os embriões em dois pratos de 100mm sequenciais com temperatura 1 x salina tamponada fosfato (PBS).
  8. Coloque um anel de papel de filtro em um prato de petri 35mm primeiro. Então coloque o lado dorsal do embrião para o papel de filtro já em 35mm placa de Petri.
  9. Coloque um anel de aço inoxidável em cima do sanduíche de papel de filtro. Tenha atenção para não danificar o embrião.
  10. Adicione 3 mL de CCM previamente preparado para cada placa de Petri.
  11. Remova a VM de cada embrião por desnatação levemente a agulha capilar puxada através da parte superior do embrião e descascando a VM afastado, a partir do final do anterior (mesmo por cima do posencéfalo) e prosseguir para a notocorda (figura 1A).
  12. Coloque oito pratos de Petri 35mm em um prato de 150 mm que foi forrado com toalhitas de tarefa delicada saturada de água (para manter a umidade).
  13. Lugar de Petri 150 mm em um saco plástico vedável Então enche o saco com uma mistura de gases composta de 95% O2 e 5% de CO2.
  14. Feche o saco e coloque-o em uma incubadora de 37,5 ° C.
  15. Incube os embriões para um adicional 27 h até HH15-HH16 (figura 1B).

6. indução de tensão superficial

  1. Remover os embriões da incubadora e usar um sistema de tomografia computadorizada (OCT) de coerência óptica para a imagem deles. Usar a OCT para determinar o ângulo de torção do tubo neural (NT) (Figura 2).
  2. Transferir os embriões para um microscópio de luz e visualizar a ampliação de 10x. Use uma pipeta de 200 microlitro incrementalmente 0,2 mL de mídia retirar o prato de petri.
  3. Com imagens de brightfield em cada intervalo para observar os efeitos da interface mídia-ar sobre o embrião.
  4. Remova a mídia até que a tensão de superfície do outro lado do embrião induz a torsão (Figura 1).
  5. Imagem do embrião, usando o sistema OCT mais uma vez para estabelecer um ângulo de torção final para comparação controlar os embriões.  Nota: As imagens de Bright-campo foram adquiridas usando um microscópio de dissecação. Um sistema de tomografia de coerência óptica com um microscópio anexado foi usado para adquirir pilhas imagem transversal dos embriões ao vivo. Imagens foram obtidas em um domínio de digitalização3 3 x 10 x 3 mm e, em seguida, processadas em um software de imagem. Por último, as modelo físico de imagens foram tiradas com uma single-lens reflex câmera digital.

7. física modelagem das forças de tensão superficial/VM

  1. Desenvolva uma geometria 3D simplificada que se assemelha a um embrião entre 17-HH14 em software de modelagem comercial (Figura 3A).
  2. Desenha o molde negativo da geometria 3D em softwares gráficos de computador 3D comercial.
  3. Uso uma impressora 3D carregada com 1,75 mm acrilonitrila butadieno estireno do filamento para 3D imprimir o molde desenhado, no formato stereolithographic. (STL).
  4. Para converter o molde, misturar componentes de elastômero de borracha de silicone A e B em partes iguais e despeje a mistura no molde prontamente; conjunto do molde de fundição para curar à temperatura ambiente por 12 h (Figura 3B).
  5. Marca o modelo físico do embrião ao longo do NT no lado dorsal Visualizar torsão.
  6. Use uma lamela para replicar a força aplicada para o modelo físico 3D que imita do VM ou tensão superficial (Figura 3D).
  7. Inserir uma série de fios rígidos de comprimento igual ao lado do modelo físico. Depois que a lamela exerce uma força externa sobre o modelo do cérebro, os fios tornam-se inclinado em um ângulo que depende da localização. Determine o ângulo de rotação por arctan do comprimento projetado sobre o comprimento original de cada fio (Figura 3E).

8. alterando a direção do Loop coração

  1. Siga as etapas em 3.1 e 3.2 para obter um tubo capilar puxado.
  2. Siga as etapas no 5.1 através de 5.10 para preparar o embrião.
  3. Use um par de pinças para virar o papel de filtro para que o embrião se torna ventral-lado para cima.
  4. Use o tubo capilar puxado para abrir uma fenda na membrana splanchnopleure (SPL).
  5. Use o tubo capilar para exercer uma força mecânica para empurrar o coração do lado direito para o lado esquerdo.
  6. Siga as etapas em 5.12 através de 5.15 para observar a mudança na torção.

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Representative Results

Neste estudo, a VM do embrião em HH11 foi removida da extremidade anterior para a flexão torácica. Os embriões foram fotografados por um sistema de OCT. Nesta fase, a torção do tubo do cérebro não foi iniciado (figura 1A). Após ser incubadas a HH15-16, embriões com sua VM removido exibiram cerebral reduzido tubo torsão, cerca de 35 graus (figura 1B) comparado comparadas o controle de embriões, que exibem a torsão de cerca de 90 graus. Quando o nível de mídia foi reduzido para induzir tensão superficial na extremidade dorsal de embriões com suas VMs removidos, o cérebro torcido para níveis comparáveis aos de embriões de controle (Figura 1). A Figura 2 mostra uma imagem representativa de OCT de um embrião de 13 HH com seu ângulo de orientação torácica e ângulo de orientação cranial marcadas (Figura 2A). Os ângulos são medidos numa posição vertical de secção transversal da NT (Figura 2B, C). Os resultados de nossas experiências sugeriram que a torsão de tubo de um cérebro normal é impulsionado por carregamento externo na extremidade dorsal do embrião e que essa carga essencial fornecida pelo VM20,25. Além disso, em um embrião normal, o cérebro se vira para a direita como o loop de coração vai para o lado direito, Considerando que em um embrião com coração loop pressionado no lado esquerdo na fase inicial (ou seja, antes da fase HH 12), o cérebro também vira para a esquerda seguindo outra 20 h de incubação (Figura 3C na Ref. [12]), sugerindo que a posição do coração resultou na assimetria na torção do cérebro.

Dados obtidos em experimentos nos permitiram reconstruir uma geometria simplificada do embrião do pintinho sem a VM de HH14-17 (Figura 3A). Neste modelo computacional, o cérebro e o coração em loop certa foram modelados como hastes curvadas. Um bloco que representa a membrana splanchnopleure (SPL) era o contato com a haste de coração. Criando um molde negativo deste modelo computacional, 3D imprimir este molde e fundição do molde com um elastômero de silicone, fabricou um modelo físico de geometria computacional simplificada (Figura 3B-D). Uma lamela pressionada para baixo na parte dorsal do modelo físico replicado a carga mecânica fornecida pela VM ou tensão superficial de nossos experimentos (Figura 3D). O modelo exposições comparáveis geometria e cérebro torção com um embrião real, cultivadas ex-ovo de HH14-17 (Figura 3E).

Figure 1
Figura 1: morfologia do embrião com VM removido e efeitos de forças externas na torção de tubo do cérebro para a direita. (A) embriões colhidos com VM removido no HH11. (B) o mesmo embrião incubadas durante 27 h post VM remoção apresentando reduzida da torsão. (C) o mesmo embrião foi submetido a torção do cérebro, a pedido de líquidos de tensão superficial. (D) embrião de controle com torsão de um cérebro normal numa fase comparável. Barras de escala, (A-C) (D) a 1 mm, 1 mm. imagens foram capturadas na ampliação de 10x. Adaptado da ref. [12] com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: imagem de OCT de um embrião de HH13. (A) a figura tem seu ângulo de orientação torácica marcado no (a) e seu ângulo de orientação craniana medido em (b). (B), (C) O perfil do NT em posições (a) e (b). Ângulos são medidos a partir de uma posição vertical. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: um modelo físico do embrião demonstrando a torsão do cérebro. (A) uma geometria simplificada de um embrião do pintinho sem VM no modelo físico de HH14-17 (B) Silicone elastômero de um embrião do pintinho. (C) vista Dorsal do modelo com o coração do lado direito. (D) vista Dorsal do modelo sob uma força externa, aplicada por uma lamela, começando a mostrar a torsão do cérebro para a direita. (E) o embrião do pintinho cultivadas ex-ovo começa a girar para a direita no HH14 para comparação. Barras da escala, (B-D) (E) 1 mm. adaptado da ref. [12] com a permissão de 1 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Enquanto fenômenos físicos desempenham um papel integral na morfogênese26,,27,28,29,30, os mecanismos específicos de mecânicos, juntamente com a coordenação de mecânica e mecanismos moleculares, continuam em grande parte inexplorados. É conhecido que a flexão ventral e torção para a direita do cérebro primitivo são dois processos centrais que contribuem para o início embrionário morfogênese18,31,32,33, 34, mas nenhum estudo prévio abordadas as origens mecânicas de torção do cérebro, um dos evento mais antigo órgão nível assimetria de esquerda-direita.

As principais etapas do protocolo incluem a remoção da VM para identificar a força motriz mecânica para torção de cérebro e a aplicação da tensão de superfície líquido para confirmar os resultados. A solução de problemas desta técnica realizou-se a identificar o estágio inicial em que o VM deve ser removido para induzir mudanças significativas na torção.

A força para baixo passiva da VM foi mostrada para ser um limite mecânico fundamental para o tubo de cérebro embrionário crescente. Quando a VM do embrião foi removida, o cérebro já não torce para um grau normal, mas poderia ser feito para torcer para o nível de controle através da aplicação subsequente da tensão superficial, diminuindo o nível do líquido. A tensão superficial conhecida de água à temperatura ambiente é 72.01 ± 0,1 mN/m e o comprimento de contato é da ordem de milímetros, a força pode então ser calculada. Assim, estimamos que a VM exercida uma força de aproximadamente 10 mN no embrião HH 14-1712.

Usando este protocolo, fomos capazes de determinar que VM desempenha o papel chave mecânico em torção do cérebro embrionário. Os resultados obtidos com este novo protocolo sugere que a VM é uma estrutura crítica para a progressão da torção de um cérebro normal durante a morfogênese embrionária, pois fornece as restrições geométricas e carga mecânica necessária para a torção do cérebro,35. Os resultados indicaram também que a posição do coração determina a direção da torção do cérebro. Assimetria de L-R do embrião durante o desenvolvimento leva a uma forma anelada-direito do coração, que por sua vez leva a torção para a direita do cérebro36,37,38,39. Vale ressaltar que o método mecânico de deslocando a posição do coração difere do método químico desenvolvido por outros pesquisadores13 e é melhor para delinear o papel da mecânica na morfogênese. No total, nossos resultados ilustram o papel fundamental da mecânica na condução morfogênese cérebro torção no embrião do pintinho.

No futuro, o protocolo pode ser aplicado para identificar fatores como genéticas e mecânicas juntos regular torsão embrionária e desvendar como esses diferentes fatores trabalham em conjunto para garantir o adequado morfogênese.

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Disclosures

Os autores declaram não há conflitos de interesse.

Acknowledgments

Z.C. reconhece o apoio do fundo de inicialização de Dartmouth e o Branco Weiss - sociedade para bolsa de estudos de ciência, administrada pela ETH Zurique. Os autores agradecer Qiaohang Guo, DRS Larry A. Taber, Benjamen A. Filas e Yunfei Shi para debates úteis, bem como os revisores anônimos para comentários. Este material é baseado em trabalho suportado pela nacional Science Foundation pós-graduação bolsa de pesquisa sob Grant no. DGE-1313911. Qualquer opinião, conclusões e conclusões ou recomendações expressadas neste material são as dos autores (s) e não refletem necessariamente as opiniões da National Science Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fertilized Specific pathogen-free White Leghorn chicken eggs Charles River
Optical Coherent Tomography Microscope Thorlabs GAN220C1
Silicone elastomer Smooth-On, Inc. EcoFlex 00-50
Dissecting microscope Leica MZ8
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) Lonza 12-604F
Antibiotics Sigma P4083
Chick serum Sigma C5405
Micropipette puller Sutter Instrument Model P-30
Filter paper Whatman 5202-110
Phosphate buffered saline (PBS) Corning 21-040-CV
Comsol MultiPhysics Comsol
3D computer graphics software Rhino 5
Microscope attached with OCT Nikon  FN1
Digital single-lens reflex camera EOS  Rebel T3i

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References

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Li, Y., Grover, H., Dai, E., Yang,… More

Li, Y., Grover, H., Dai, E., Yang, K., Chen, Z. Probing the Roles of Physical Forces in Early Chick Embryonic Morphogenesis. J. Vis. Exp. (136), e57150, doi:10.3791/57150 (2018).

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