在这里我们描述了一个协议, 以确定侵袭性曲霉病小鼠肺部真菌负担的定量戈木日修饰甲胺银染色的组织学切片。这种方法的应用结果与较少的动物相比, 通过定量 PCR 的肺真菌 DNA 评估的真菌负担比较。
肺真菌负担的量化是确定肺真菌感染小鼠模型中免疫保护和真菌毒力相对水平的关键。虽然用多种方法评估真菌的负担, 但真菌 DNA 的定量聚合酶链反应 (qPCR) 已成为一种技术, 与以往的基于文化的方法相比具有多种优势。目前, 对侵袭性曲霉病 (IA) 小鼠的肺病理学、白细胞招募、真菌负担和基因表达进行综合评估, 必须使用大量的实验和控制动物。这里详细研究了用减少的动物数量来确定真菌负担的肺组织学染色的量化。肺切片染色, 以确定真菌结构与戈木日的改良甲胺银 (GMS) 染色。图像取自 GMS 染色的部分, 从4个离散的领域, 每一个福尔马林固定石蜡嵌入肺。每个图像中的 GMS 染色区域都使用图像分析程序进行量化, 从这个量化方法中, 每个样本都确定了染色面积的平均百分比。采用这一策略, 嗜酸细胞缺乏的小鼠在卡泊芬治疗中表现出真菌负担和疾病的减少, 而与卡泊芬的野生型小鼠没有改善。同样, 卡泊芬, qPCR 和 GMS 的定量测定, 也改善了缺乏γδ T 细胞的小鼠的真菌负担。因此, 将 GMS 量化作为一种测定相对肺部真菌负担的方法, 最终可能减少对侵袭性曲霉病进行综合研究所需的实验动物数量。
IA 是一种机会性感染, 可能会发展在有先天或后天免疫缺陷的敏感个体由于免疫抑制治疗或慢性感染1,2。原发性感染通常发生在肺部, 虽然在某些情况下, 传播曲霉曲霉到肝脏, 肾脏, 心脏和大脑可能发生, 导致广泛组织侵入菌丝伴有严重疾病和高死亡率1,2。此外, 现有 pharmacotherapies 的功效有限, 可能会因环境中抗真菌菌株的出现而进一步减弱3。因此, 重要的是要了解真菌毒力和宿主病理机制, 促进侵袭性真菌疾病的发展或恶化。
小鼠模型仍然是重要的机械 IA 研究, 因为他们允许研究人员评估真菌毒力基因和宿主免疫效应的作用, 以建立和增长的A. 曲霉在体内4,5。因此, 为了有效地量化或比较实验动物组中的真菌负担, 设计了多种策略6,7。这些策略包括基于文化的、生物化学的、免疫分析法或 qPCR 的方法, 每个都有明显的优缺点。此外, 这些方法中的每一个都涉及一个动物子集的奉献, 除了那些为评估免疫效应功能、基因表达分析和比较病理学7而牺牲的那些。因此, 综合 IA 研究往往需要大量的研究动物在一个巨大的成本。因此, 通过利用动物组织进行多种分析, 减少实验时间、动物成本和伦理考虑的有效策略是非常有价值的7。
在本报告中, 介绍了在组织学切片中对 GMS 染色的量化方法, 以比较实验组小鼠与 IA 的相对真菌负担。从真菌培养到感染、组织收获和加工、图像采集和数据分析的每一步都进行了详细描述。粒细胞减少模型中 qPCR 和卡泊芬处理的野生型或嗜酸性粒细胞缺陷小鼠与ia8 进行比较, 得到了 GMS 定量的真菌负担。结果表明, 与 GMS 定量和 qPCR 真菌 DNA 相似。这表明, GMS 量化可能是有用的研究人员进行组织学分析, 作为一种补充或替代方法比较的相对真菌负担的小鼠与 IA, 并可能最终降低成本和使用的研究动物在复杂的, 机械的研究。
本文的目的是通过利用 GMS 染色的肺组织学切片进行图像分析和定量分析, 介绍一种测定 IA 小鼠肺真菌负担的方法。在本研究中, 用β葡聚糖合成靶向抗真菌药物卡泊芬14的治疗并没有改善粒细胞减少野生型小鼠的生存或真菌负担 (IA8)。然而, 在缺乏嗜酸性粒细胞或γδ T 淋巴细胞的情况下, 生存和真菌负担有所改善。我们的研究结果还表明, 与广泛使用的真菌 DNA qPCR 方法6相比, GMS 真菌负担可获得可比结果。
利用 GMS 真菌负担量化有几个好处。首先, 该过程可能利用现有的组织学样本, 从而有可能减少所需的实验数量, 以确定重大差异。第二, 在这项研究中, 比起真菌 DNA 的 qPCR, 对 GMS 的真菌负担量化需要较少的动物 (图 6,图 7)。第三, 在核糖体 DNA 拷贝数15中, 不同分离株的真菌负担的比较可能受 qPCR 的差异的影响。相比之下, GMS 量化不受复制数的影响, 因为真菌负担是由相对水平的肺部真菌生长决定的。因此, 使用 GMS 定量的真菌负担减少了对脊椎动物的使用, 不需要预先确定 rDNA 复制号。最后, 除了改变真菌的形态, 卡泊芬疗法增加真菌碎片, 从而可以人为地增加真菌负担时, 通过孤立的菌落形成单位从肺组织匀浆12, 16 ,17。因此, GMS 定量的真菌负担避免了与其他常用方法固有的一些限制。
然而, GMS 量化和/或这项研究的局限性值得注意。首先, 作者假设在每个实验组的肺部都有可比分布的菌丝生长, 因此使用4个代表性10x 客观领域的量化来作为对整个肺部真菌负担的代表性测量。(图 6B)。在某些情况下, 菌丝灶的相对分布、大小和密度会有很大差异, 从而使真菌的负担与这种方法和 qPCR 方法的等效性不同。然而, 我们的额外结果与整体肺部分量化使用4X 客观的领域显示相似, 虽然统计上不显著, 组之间的差异 (图 6C)。这一策略增加了这个量化指标的标准误差, 可能是由于4X 目标的菌丝分辨率降低和次优场的背景增加。因此, 有代表性的量化更少的领域在更高的放大率是首选。第二, 每个样本只使用一个中央截面。在真菌分离或小鼠菌株的基础上, 一些研究可能导致菌丝生长的不均匀分布。在这些情况下, 每个石蜡区块中的其他部分应量化, 以获得更有代表性的负担。第三, 在诱发粘液大量生产的实验中 (即, 量化过敏性支气管肺曲霉病 (ABPA)18或囊性纤维化 (CF)18) 的气道真菌生长, GMS 反应与富含多糖的粘液19可产生非特异的 GMS + 结果, 从而使一些样品倾斜, 有利于较高的真菌负担。由于仅在本研究中使用了 IA 的粒细胞减少模型, 因此使用其他免疫能力强或抑制模型可能会导致比较少的结果。尽管有这些告诫, 但 GMS 量化提供了一种可比性的方法来确定真菌负担, 其继续在其他研究中的使用可以进一步验证这种方法的实用性, 因为它是一致的、可靠的和具有成本效益的。
The authors have nothing to disclose.
这项研究得到了印第安纳大学医学研究增强补助金和 NIH-NIAID 1R03AI122127-01 的部分支持。在这段期间, 位免疫学家美国协会的免疫学研究事业获得了部分支持。
Aspergillus fumigatus 293 Stock Solution | Fungal Genetics Stock Center | FGSC #A1100 | |
HyPure Cell Culture Grade Water | Thermo Fisher Scientific | SH30529.03 | |
Malt Extract | MP Biomedicals | 2155315 | White Powder |
BD BBL Acidicase Dehydrated Culture Media: Peptone | Fisher Scientific | L11843 | |
Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS) | Fisher Scientific | D16-3 | |
Fisher BioReagents Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
Auto Dry Cabinet | Shanghai Hasuc Instrument Manufacture Co.,LTD | HSFC160FD | |
1300 Series Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific | 1375 | |
0.5 mm Glass Beads | BioSpec Products | 11079105 | |
15 ml Conical Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
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Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662-500 ml | |
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Caspofungin diacetate | Sigma-Aldrich | SML0425 | |
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IV CATH ANGIOCATH 22GX1GIN 50B | Fisher Scientific | NC9742754 | |
Formalin Solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | |
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Fisherfinest Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22-900-700 | |
Disposable Base Molds | Fisher Scientific | 22-363-554 | |
Reichert Jung Histocut 820 Microtome | Labequip.com | 31930 | |
Water Bath | Precision Scientific | 66630-23 | |
CO2 Incubator | Fisher Scientific | 116875H | |
Silver Stain (Modified GMS) Kit | Sigma-Aldrich | HT100A-1KT | |
Fast Green FCF | Fisher Scientific | AC410530250 | |
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Fisherfinest Superslip Cover Glass | Fisher Scientific | 12-545-89 | |
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U-PS POWER SUPPLY UNIT | Olympus | OLYMPUS-U-PS | |
FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze Dry System | LABCONCO | 7740020 | |
Maxima C Plus Vacuum Pump | Fisher Scientific | 01-257-80 | Displacement- 6.1 cfm |
1-Butanol | Fisher Scientific | A383-4 | |
AMRESCO PHENOL-CHLORFORM-OSOAMYL 100ML DFS | Fisher Scientific | NC9573988 | |
Free-Standing Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | # 02-682-557 | |
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BioSpec ProductsSupplier Diversity Partner 2.3 MM ZIRCONIA BEADS | Fisher Scientific | NC0451999 | |
Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
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Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate | Fisher Scientific | S311 | |
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Chloroform/isoamyl alcohol 24:1 | Fisher Scientific | AC327155000 | |
Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer | Fisher Scientific | 11-120-570 | |
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Hybridization Probe, 5′-FAM-AGCCAGCGGCCCGCAAATG-TAMRA-3′ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
Sense Amplification Primer, 5′-GGCCCTTAAATAGCCCGGT-3′ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
Antisense Amplification Primer, 5′-TGAGCCGATAGTCCCCCTAA-3′ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
Applied Biosystems™ MicroAmp™ Optical 8-Tube Strip, 0.2mL | Fisher Scientific | 43-165-67 | |
Thermo Scientific Domed and Flat PCR Cap Strips | Fisher Scientific | AB-0386 | |
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BALB/c mice | The Jackson Laboratory | 000651 | |
C57BL/6 (B6) mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
Eosinophil-deficient (ΔdblGATA, BALB/c background) mice | The Jackson Laboratory | 005653 | |
γδ T cell-deficient (TCRδ-/-, B6 background) mice | The Jackson Laboratory | 002120 | |
ImageJ Software | National Institutes of Health | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
Spot Advanced Software | Spot Imaging | SPOT53A | http://www.spotimaging.com/software/spot-advanced/ |
GraphPad Prism 6 | GraphPad Software | N/A | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
Fisherbrand Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
Step 4.5 | http://www.bdbiosciences.com/sg/resources/protocols/paraffin_sections.jsp ; http://www.jove.com/science-education/5039 ; http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/General_Information/1/ht100.pdf |