Summary
ゴモリの変更された methanamine 銀染色組織切片の定量化による侵襲性アスペルギルス症マウスにおける肺真菌負担を決定するプロトコルについて述べる。このメソッドの使用は肺真菌 DNA の定量的 PCR による真菌負担の評価と比較して少ない動物と同等の結果になった
Abstract
肺真菌負担の定量化は相対的なレベルの免疫保護と肺真菌症のマウス ・ モデルにおける真菌の病原性の決定のため重要です。真菌負担を評価するために複数の方法を使用するが、真菌 DNA の量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) は以前の文化に基づく方法にいくつかの利点と技術として登場しました。現在、肺の病理、白血球動員、真菌の負担、侵襲性アスペルギルス症 (IA) のマウスにおける遺伝子発現の包括的な評価には、多数の実験と対照動物の使用が必要となります。ここで肺真菌負担使用動物数の削減を決定する染色組織の定量化は、詳細に検討されました。肺染色染色ゴモリの変更された methanamine シルバー (GMS) 真菌の構造を識別します。各ホルマリン固定パラフィン包埋肺の 4 つの個別のフィールドから GMS ステンド セクションから撮影を行った。各画像内の領域を染色 GMS 画像解析プログラムを使用して定量を行ったし、この定量化から染色領域の平均割合はサンプルごとに決定されました。この戦略を使用して、展示好酸球欠損マウスに低下し真菌負担およびキャスポファンギン療法病キャスポファンギンと IA と野生型マウスを改善しなかった。同様に、γδ T 細胞欠損マウスにおける真菌の負担も改善されたキャスポファンギン、qPCR と GMS 定量化によって測定されます。GMS の定量化はそのための侵襲性アスペルギルス症の包括的な研究に必要な実験動物の量を減らすことができます最終的に相対的な肺真菌負担の定量法として導入されました。
Introduction
IA は免疫抑制療法や慢性感染症1,2のための先天性または後天性の免疫不全症の影響を受けやすい個人に発症する日和見感染です。肝臓、腎臓、心臓、コウジカビの fumigatusのいくつかのインスタンスの普及では、肺に発生する主な感染は、しばしば、脳が発生する、重度の疾患と高を伴う菌糸の広範な組織への浸潤の結果死亡率1,2の料金です。また、既存の pharmacotherapies の有効性は限られて、環境3抗真菌薬耐性菌の出現によってさらに弱体化される場合があります。したがって、開発を促進するため真菌の病原性およびホストの病理学のメカニズムや侵襲性真菌性疾患の増悪を理解する重要です。
マウスモデルのまま彼らは真菌の病原性遺伝子の役割を評価し、ホスト免疫エフェクター設立とA. fumigatus 体内4、5の成長のために研究者を許可する IA の解明のために重要です。したがって、複数の戦略が効果的に定量化や実験動物6、7のグループで真菌の負担を比較するために考案されています。これらの戦略を含む文化ベース、生化学、免疫、または qPCR のメソッドは、それぞれ異なる長所と短所を持つ。さらに、これらの各メソッドは、免疫エフェクター機能、遺伝子発現解析および比較病理7の評価を犠牲にしたもののほか動物のサブセットの献身を含みます。したがって、IA の包括的な研究は頻繁にかなりのコスト研究動物の重要な番号を要求します。したがって、複数の解析のための動物組織を用いた実験的時間、動物のコスト、および倫理的な考察を減らす効果的な戦略は、非常に貴重な7です。
このレポートでは、GMS の IA とマウスの実験群間相対真菌負担の比較のため組織切片の染色の定量化を記述する方法を導入する.データ解析、画像取り込みと処理、組織収穫感染する真菌の培養からの各ステップで詳しく説明します。GMS の定量化による真菌の負担は、qPCR ia、好中球減少症モデルおよび IA8キャスポファンギン処理野生型または好酸球欠損マウスと比較しました。GMS の定量化と qPCR 真菌 DNA の類似を示した。GMS の定量化が ia、マウスの相対的な真菌負担の比較の補足か代替方法として組織学的分析に従事している研究者に有用である可能性があります、最終的にコストと研究における動物の使用を減らすことができますが示唆されました。複雑な機構の研究。
Protocol
動物のすべてのプロシージャは、動物愛護とインディアナ州立大学の使用委員会、インディアナ大学医学部のホストのキャンパスによって承認された-テレ ホート。
1. 感染症のためA. fumigatus分生子の準備
- 作業中に換気の発煙のフード、900 μ L 細胞培養グレード水 (CCGW) にA. fumigatus 293 原液の 125 μ L を追加します。麦芽エキス寒天培地 (MEA) 板ピペットと接種ループと均等にソリューションを転送します。
- 24 の ° C、少なくとも 14 日間、28 日以上で暗闇の中で真菌のプレートを格納します。
- 上記9としてガラス製のビーズを使用して分生子を収穫します。
- 注ぐ 1.5 g 0.5 mm のプレートの上にガラス製のビーズとビーズが分生子を抽出するために被覆されるまで前後軽く傾斜それ。15 mL コニカル チューブ ビーズ/胞子混合物を収集します。5 mL ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) と渦を中断します。
- 診断 DPBS の上澄みの 50 倍希釈の分生子をカウントします。図 1に示す領域で分生胞子の数をカウントし、濃度を計算する方程式 1を使用します。
#Conidia × 希釈ファクター × 104= 胞子/mL (式 1)
注: 追加の 4 x 4 正方形の角の部分と思われる、式 1の #Conidia として使用されるこれらの地域の平均値を持つ。
図 1: 検定代表エリア分生胞子を数えるために使用 (ボックス、矢印)。
- ごと滅菌生理食塩水 (DPBS) 望ましい集中、1.0 x 108分生胞子/mL 分生胞子液の準備 50 μ L 5 x 106分生胞子/50 μ L. で感染を取得すると分生胞子懸濁液を希釈 ' n + 2' ピペッティングのアカウントに感染するマウスエラーです。
注: 標準菌収穫と準備/ろ過代わりに使用される10があります。吸引の最小限の小/水溶性菌糸抗原と分生胞子サンプルが得られるように、ガラスビード法が適しています。
2. 免疫抑制と感染マウスモデルの
- 7-10 週齢のマウスを使用します。
注: BALB/c、C57BL/6 (B6)、好酸球欠損 (ΔdblGATA, balb/c 背景) と γδ T 細胞欠損 (TCRδ-/-、B6 背景) マウスはこの研究のために使用されました。各実験、年齢し、性別をマッチさせた、(男性と女性) のマウスはグループごとに使用されました。 - 45 ° 外側右下の象限に滅菌生理食塩水で 0.1 mL (0.5 mg) 反-mouse-Ly-6 G 抗体の腹腔内 (IP) 注入を介して好中球を使い果たす (実験的スケジュールでは、図 2を参照)。
- 24 h 後、50 で中断 106A. fumigatus胞子 x 5.0 と吸引によって、マウスに感染 μ L 滅菌生理食塩水 (手順 2.4 2.10 参照) 前述したように11。本研究で用いた DPBS で 5 mg/kg キャスポファンギン ジアセテートなど抗真菌剤と動物のサブセットを注入、感染 (毎日、図 2を参照)。
- 獣医麻酔機を使用して 99.9% イソフルランとマウスを麻酔します。
- 大便と小便をキャッチする誘導室の床にペーパー タオルを配置します。
- 誘導チャンバーにマウスを置き、蓋を固定、2 分の 30 5% イソフルラン気化器に設定 s。
注: 麻酔下に合計時間は 5 分もかかりませんので、獣医軟膏は使用されません。 - 気化器を 30 に設定最大値の半分に減らす s。
- 確認呼吸、運動の不足、つま先ピンチ刺激への応答の欠如マウスは正しく観察することによって麻酔を鈍化しました。
- 誘導室と傾斜基板上の場所から、マウスを削除します。その背中を板にマウスを置きます。その上顎中切歯がゴムバンドで軽く拘束された下顎前歯部は優しく金属ワイヤーで拘束されたことを確認します。
- 慎重に小さな鉗子と舌のベースの分生胞子/PBS を懸濁液の 50 μ L をピペット完全拡張子で舌を保持します。
- 完全な拡張子; で舌を保持します。急速な呼吸および誤嚥の明確なクリック ノイズを聞く。20 は、s または懸濁液は完全に吸気まで。
- 傾斜基板からマウスを取り外し、観察用ケージをそっと置き。
- 以下の吸引、マウスが意識を取り戻す 1 分モニター内マウス完全に意識し、ケージの周りに歩くことができるまで。動物は 21 ° C で収容され、肺が収穫されるまで、1 日 2 回監視する必要があります。
- 好中球 (手順 2.2) 24 h 後感染症 (図 2) の枯渇を繰り返します。
図 2: 実験的スケジュール。この図は、以前の文書8から変更されました。
3. 収穫とマウスの肺の組織学的解析のための保全
- 深く 390 mg/ml ペントバルビ タール ナトリウム ソリューション IP の 0.1 ml の致命的な線量を持つ動物を麻酔します。
- 安楽死をピンセットで自発呼吸の欠如と手足刺激に対する反応の有無を観察することによって確認します。安楽死、一度 70% エタノール消毒すると死体をスプレーします。
- 吸収パッドで覆われている発泡ボードに死体を配置します。
注: 死体は、発泡ボードにすべての 4 つの手足を固定ピンでその裏に配置する必要があります。 - 慎重にはさみを使用して上位胸の空洞を開きます。肺と心臓を公開するために胸郭を切り取る。灌流のために下大静脈をカットします。血管を切断し、臓器穿刺を避けるため。
- ゆっくりと 25 G 針を 45 ° の角度で心臓の右心室に冷たい DPBS 5 mL で灌流します。10% ホルマリン 5 mL で灌流を繰り返します。
- 慎重に気管を公開し、周囲の脂肪パッドをデタッチします。注意を払い、気管を刺さない。余分な結合組織が完全に進む前に気管を視覚化するために削除されますを確認します。一度気管を公開すると、昇格する気管の下で鉗子を配置します。
- 25 G の針を使用して上部気管に小さな穴を突きます。
注: 全体のカニューレが気管内に収まるように、穴を配置必要があります。気管の破裂を避けるために注意を使用します。 - 穴から肺に向かって、カニューレを挿入します。カニューレを気管に緩く巻きつけ手術スレッドで固定します。
注: 気管が破裂すると場合に、過去の可能な限り気道で気管カニューレが挿入されるかもしれません。 - 注射器を使用して、1 mL のカニューレを通して 10% ホルマリン バッファーを有する肺を膨らませます。肺のインフレ率が表示されることを確認します。そうでない場合は、カテーテルを調整しを繰り返します。肺が膨張すると、一度すぐに注意してカニューレを取り外し、安全に気管を封鎖するねじ締め。
注: 場合は気管が破裂して、肺が膨張することはできません、肺はまだ収穫されるかもしれないが、これは適切な固定を防ぐことができます。 - 慎重慎重にスレッドで軽く持ち上げながら鉗子で気管の結合組織を切断することによって気管と肺に胸から取り外します。バッファーを 10% ホルマリン 15 mL と 50 mL の円錐管に肺や気管を配置します。チューブ外スレッドの一方の端を置き、キャップをシールします。定着剤のサンプルが完全に水没するチューブを反転します。
- 常温 24 時間少なくともまたはさらに処理までサンプルを格納します。
注意:ホルマリンは危険です。ゴーグルとフェイス マスクを含む適切な個人用保護具を着用します。サンプルを処理するときに化学のフードの下で動作します。
4. 収穫と DNA 真菌負担のマウス肺の保全
- 別のマウスに前述の手順 3.1 3.5。
- ゆっくりと 25 G 針、10 ml 45 ° の角度で心臓の右心室に冷たい DPBS の灌流します。
- ハサミで肺を切除し、ラベル付き 1.5 mL チューブに配置します。
- さらに処理まで-80 ° C で肺を格納します。
- 前述の (埋め込み、区分)、製造元のプロトコル (材料の表を参照) によると、標準的な手法を使用します。
5. 顕微鏡とイメージング
- 定量化するイメージング プログラムを開く (材料の表を参照してください)。
- 光学顕微鏡を使用して、スライド (対物レンズ 10 倍) をステンド グラス GMS の少なくとも 4 の異なるフィールドを取得します。画像が同じような組織の密度と肺内感染した気道の代表であることを確認します。
注: 密度と菌糸の巣の分布表示コントロール群と実験群の間に著しく異なった場合追加フィールドを取得ことがあります、または全肺セクションの GMS のエリア イメージを作成する可能性があります (4 X 目標)。必要に応じて、シリアル肺切片ヘマトキシリンとエオシン、上肺 (同等組織形態によって識別される) の同じ領域の画像を取得します。 - 必要に応じて、画像にスケールバーを追加し、定量化する画像を保存します。、[編集] > 追加/編集校正マーク > メニュー: 線の太さ、色、スケール バーのサイズを選択 > スケール バーが配置される画像をクリックします。メニューを閉じるし、編集を選択 > マージ > マージ校正マーク > ファイルの [名前を付けて保存を選択 > ファイル名を指定して保存します。
6. 画像処理プログラムを使用して真菌の負担 (図 3) を計算するには
- 画像処理プログラムを開きます。ファイルを選択 > を定量化するためのサンプル フォルダー > イメージ (図 3 a)。画像を選択 > タイプ >「RGB スタック」(図 3 b) に変換します。
- 3 つの指定されたイメージ (図 3 b) の 2 番目の選択に右矢印キーを使用します。「コントロール + シフト + T」をヒットさせる「しきい値」メニューの設定調整器 (図 3)。参照として元 .tiff または .jpg 画像を検索して映像プログラム (図 3) を開きます。
- 左端に上のスライダーを引っ張るし、下のスライダーを調整 (赤) で選択領域が (通常に至る 130-160 (図 3) のスライダーの右側に示すよう顕微鏡画像の代表になるまで。
- 選択すると、一度プレス「設定」>"OK"(図 3 D)。「分析」を選択 >「測定の設定」>「面積、面積率、制限しきい値、表示ラベル"をチェックし、、既定値として下の設定 (ドロップ ダウン メニューと小数点以下の桁数) を残し >"OK"(図 3 D).
- ホワイト スペースまたは背景の汚損の重要な地域エリアまたは多角形ツールを使って適切な組織の選択除外されるかもしれない。
- 最後に、「分析」を選択 >「測定」(データ ウィンドウが表示されます、または windows タスク バー上のタブは、「結果」はラベル表示されます) (図 3E)。グラフのためのデータ解析プログラムにデータを転送および統計分析。
- 各肺サンプルの 4 つの領域率の平均値を入力します。5-8 サンプルは、グループ間に有意差を検出するには不十分です。2 つの実験群を比較すると、対になっていない学生のtを実行-意義を判断するテスト。
図 3: GMS 組織の各ステップの代表スクリーン ショット フィールド定量化します。(A) ファイルを選択 > を定量化するためのサンプル フォルダー > 選択イメージ。(B) 画像の選択 > タイプ >「RGB スタック」に変換します。右矢印キーを使用して、2 番目の 3 つの特定の画像を選択します。(C) ヒット「コントロール + シフト + T」「しきい値」メニューの設定調整を持ち出す。参照として元 .tiff または .jpg 画像を検索して写真ビューアー プログラムで開きます。ずっと左 (赤) で選択領域が (通常に至る 130 160 示されるスライダーの右側に顕微鏡画像の代表になるまで下のスライダーを調整する上部のスライダーを引っ張る。(D) 選択したプレス「設定」>"OK"。「分析」を選択 >「測定設定」>「面積、面積率、制限しきい値、表示ラベルに」をチェックし、既定値として下の設定 (ドロップ ダウン メニューと小数点以下の桁数) を残し >"OK"。(E) 最後に選択「分析」>「測定」(データ ウィンドウが表示されます、または windows タスク バー上のタブは、「結果」をラベル表示されます)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
7. DNA 真菌負担
- -80 ° C から肺を削除し、少なくとも 4 時間のため凍乾 (一晩最適です) または凍結乾燥システムによって完全に乾燥するまで。
- 肺が乾燥すると、DNA 抽出バッファー (0.1 M NaCl, 10 mM EDTA pH 8.0、10 mM トリス塩酸 pH 8.0、および 0.5 %sds) を準備します。
- あらかじめ温めて 60 ° C の水浴の準備の DNA 抽出バッファーを配置します。また、フェノールを配置: クロロホルム: イソアミル アルコール (25:24:1) 50 mL コニカル チューブの分離を可能にします。
- 2 mL スクリュー キャップ チューブ 0.2 ml のガラス製のビーズに凍結乾燥肺を配置します。微粉末となるまで、15-30 秒の乾燥肺組織を挽くビード ・ ビーターを使用して。
- 各管と渦にも 0.8 mL ウォーム DNA 抽出バッファーを追加します。さらに 15 分間インキュベートする前に各チューブ 65 ° C ビーズお風呂し渦で 15 分間、インキュベートします。インキュベート後、渦とし遠心分離機 25,000 x g で 10 分間のチューブします。
- 各サンプルのラベルを 1.5 mL チューブの 3 セットとチューブの 1 つのセットに上澄みの最上位のレイヤーを転送します。水性トップ層をピペッティングしながら中間層を妨害を避けるために注意を使用します。
- フェノール: クロロホルム: イソアミル アルコールの等しいボリュームを追加し、よく混ぜます。チューブの 2 番目のセットに上位層をピペットで移す前に、15 分 25,000 × g で遠心分離します。
- クロロホルム: イソアミル クロロホルムの等量を加えてよく混ぜ 25,000 x g で 10 分間上層を慎重にピペットで遠心分離機のチューブの 3 番目のセットに。
- 追加 500 μ L のイソプロパノール 50 μ L NaoAc (pH が 5.2)、ミックスと 10 分間室温でインキュベートするサンプルを許可します。30 分間 25,000 × g で遠心分離し、上清をデカントします。
- 25,000 x g デカント エタノールに 750 μ L 氷冷 70% エタノールや 5 分間遠心分離で DNA の餌を洗浄し、40 分間ヒューム フードのチューブで空気にペレットを乾燥を許可します。
- TE バッファーの 300 μ L の乾燥ペレットを再懸濁します。
注: DNA は定量化されるまでの-20 ° C で保存されるかもしれない。 - 分光光度計を用いた DNA の定量化し、qPCR 分析用各 DNA のサンプルの 0.2 μ g/μ L の 100 μ L を準備します。
- 真菌 18S rDNA のプライマー、DNA サンプルの 1 μ g と前述したように 3 通標準 qPCR を実行し、変更されたプローブ クェンチャーのプローブを設定します (5'-/56-ファム/AGC CAG CGG/禅/CCC GCA AAT G/3IABkFQ/3 ')12,13。
- A. fumigatus genomic DNA から標準曲線を準備し、各 pg 菌 DNA の濃度を計算する平均のレポーターを使用してサンプルを染める Ct 値。
- 平均値の標準誤差との真菌 DNA の pg/μ をプロットします。学生のtを実行-テストの意義を判断する分析。
注: としてより少なく有毒な代わりにここで使用されるフェノール クロロホルム DNA 抽出、カラムベース DNA 抽出キットを使用することができます。
Representative Results
図 4 には野生型の生存率のグラフが含まれます。 または ia 好酸球欠損マウスはキャスポファンギンと扱われます。その結果, 野生型マウスと比較して生存率の増加を好酸球欠損マウスに展示 (50% の死亡率率は 100%、対それぞれ)。図 5ショー代表 GMS ia 処理または未処理のカスポファンギンと好中球減少の野生型および好酸球欠損マウスから染色します。カスポファンギン治療がない野生型マウス (右側のパネル) が好酸球欠損の相対的な真菌クリアランスの結果、両方のグループを受信しなかったキャスポファンギンあった同様 (左のパネル)。図 6キャスポファンギン処理で真菌の負荷の比較を示していて、未処理の野生型または好酸球欠損マウス、真菌 DNA (図 6 a)、代表 GMS の両方の qPCR 4 (対物レンズ 10 倍) の数量フィールド (図 6 b)。両方の技術から生成された結果を示す最も重要な真菌負担キャスポファンギン治療結果が野生型および好酸球欠損マウス (図 6 a) の間に減少します。しかし、未処理のねずみで GMS 数量だけは好酸球 (図 6 b) に欠けているマウスの大幅な減少につながった。全体肺 GMS ステンド セクションの平均面積が算出した (4 X 目標)、違いは少なく統計的な有意性 (図 6) でも 4 の代表 10 X フィールドで得られた結果と同様にされました。図 7は、生存、代表 GMS 染色 (4 10 X フィールド) のイメージおよび真菌の負担の定量化両方の方法による γδ コントロールと比較するキャスポファンギンと扱われた、未処理のマウス T 細胞欠損 (TCRδKO) マウスです。生存率 (図 7 a)、真菌負担 (図 7B-D) TCRδKO マウスのキャスポファンギン治療改善。図 6の結果と同様に、真菌の負担の結果測定 qPCR (図 7 b) と代表による GMS の定量化 (図 7) 同等であった.
図 4: ia (ΔdblGATA) の好酸球-欠損マウスにおけるキャスポファンギンと治療後の生存を増加します。15-30 マウス/グループ。3-6 実験の概要です。p < 0.0001。この図は、以前の文書8から変更されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 野生型、欠乏、およびキャスポファンギン扱われる好酸球またはコントロールから GMS で汚れた肺セクションの代表的な画像未処理アイオワ マウス3-4 マウス/グループの代表。スケール バーは、100 μ m に相当します。この図は、以前の文書8から変更されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 野生型で真菌負担処理 IA またはコントロールと好酸球欠損マウス治療キャスポファンギン。(A) qPCR 真菌 DNA の。15-30 マウス/グループ、3-6 実験の概要です。(B) GMS 定量化組織学的セクションの 4 つのフィールド (対物レンズ 10 倍) から染色 GMS % の意味。(C) GMS の定量化, 全肺セクション (4 × 対物) % の意味。B と C は、5 マウス/グループの要約です。p < 0.05。p < 0.001。p < 0.0001。この図は、以前の文書8で報告されたデータを使用して生成されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: キャスポファンギン治療後 γδ T 細胞欠損マウスにおける IA の重症度を減少します。(A) 生存。(B) qPCR 真菌 DNA の。GMS (C) 組織の定量化。(D) ia、処理または未処理のキャスポファンギン γδ T 細胞から GMS 染色切片の代表的なイメージ。A と B が 7-10 マウス/グループと 2 つの実験の概要です。C と D は、4 マウス/グループの概要です。p < 0.05。p < 0.01。p < 0.001。この図は、以前の文書8から変更されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
この資料の目的は、画像解析と定量化のため肺の GMS 染色組織切片を用いた ia マウスにおける肺真菌負担の決定法を導入することだった。本研究では、治療では抗真菌薬で β グルカン合成対象のキャスポファンギン14改善しなかった生存率や好中球減少症 IA8野生型マウスにおける真菌の負担。しかし、γδ T 細胞や好酸球のない場合は、生存と真菌の負担改善。我々 の研究の結果はまたと比較して広く使われている真菌 DNA qPCR 法6GMS 真菌負担による同等の結果可能性があります示した。
GMS 真菌負担定量化を利用するいくつかの利点があります。最初に、プロセスは、重要な違いを決定するために必要な実験の数を減らす可能性のある既存の組織標本を利用できます。第二に、本研究では少ない動物 GMS 真菌負担定量化真菌 DNA (図 6,図 7) の qPCR と比較して有意差を達成するために必要があります。第三に、qPCR による異なる分離株における真菌の負担の比較は、リボソーム DNA コピー数15で分離依存性の違いによる影響は。対照的に、肺真菌増殖の相対的なレベルが真菌の負担を定める GMS 定量化はコピーの数によって影響を受けません。したがって、GMS 定量化の fungal 重荷用は脊椎動物の使用を減らす、rDNA コピー数の事前確定を必要としません。最後に、真菌の形態を変更する、ほかキャスポファンギン療法真菌断片化が増加し、人工的に肺乳剤12,16 からコロニー形成単位の分離測定と真菌の負担が増す可能性があります。 ,17。したがって、GMS 真菌の負担の定量化は、他の一般的に使用される方法と固有のいくつかの制限を回避できます。
ただし、GMS の定量化および/またはこの研究の限界は、注意してください。まず、著者匹敵する, 各実験群の肺の中で菌糸の生育分布を想定し、客観的フィールド x 全体の肺に真菌の負担の代表的な測定として 4 代表 10 から定量化をこうして使用(図 6 b)。それは、いくつかのインスタンスで相対分布、サイズ、および菌糸の巣の密度が十分に互いに異なるため真菌の負担と qPCR 法によるこのメソッドと等価と異なって表示される可能です。ただし、追加 4 X 客観的フィールドを使用して全肺セクション定量化の結果と同様に、統計的に有意な差 (図 6) の少ない。この計量結果の標準誤差は、客観的かつ最適な分野で増加の背景 X 4 菌糸解像度減少の可能性が高いため、この戦略とともに増加しました。そのため、高倍率の少ないフィールドの代表的な定量化が好ましいです。第二に、のみ 1 つ、中央のセクションは、各サンプルに使われました。それは可能、真菌の分離に基づくまたはマウス系統を使用する菌糸の伸長の不均一な分布のいくつかの研究があります。それらのインスタンスでより代表的な負荷を取得する各パラフィン ブロックの追加セクションを定量化する必要があります。第三に、ムチン (すなわち、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症 (ABPA)18または嚢胞性線維症 (CF)18で定量化気道真菌の増殖)、実質的な生産と GMS の反応を誘発する実験で多糖類が豊富なムチン19非特異的 GMS + 結果をもたらす、従って高い真菌負担を支持していくつかのサンプルを傾斜します。IA の好中球減少症モデルだけは、この研究で使用された、ので、他の免疫有能または抑制のモデルの使用がより少なく対等の結果で不可能です。これらの警告にもかかわらず GMS 定量化 fungal 重荷の決定に匹敵する技術の提供し、さらなる研究の継続的な利用可能性がありますさらに一貫性のある、信頼性の高い、費用対効果としてこの手法の有用性を検証します。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この研究は、によって、インディアナ大学の医学研究の強化費と NIH NIAID 1R03AI122127-01 によって部分的に支えられました。N. a. の部分的サポートされてこの期間中に免疫学者のアメリカの協会から免疫学フェローシップのキャリアによって。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aspergillus fumigatus 293 Stock Solution | Fungal Genetics Stock Center | FGSC #A1100 | |
| HyPure Cell Culture Grade Water | Thermo Fisher Scientific | SH30529.03 | |
| Malt Extract | MP Biomedicals | 2155315 | White Powder |
| BD BBL Acidicase Dehydrated Culture Media: Peptone | Fisher Scientific | L11843 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS) | Fisher Scientific | D16-3 | |
| Fisher BioReagents Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| Auto Dry Cabinet | Shanghai Hasuc Instrument Manufacture Co.,LTD | HSFC160FD | |
| 1300 Series Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific | 1375 | |
| 0.5 mm Glass Beads | BioSpec Products | 11079105 | |
| 15 ml Conical Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | # 0267110 | |
| Leica Model DME Microscope | Leica | 13595XXX | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662-500 ml | |
| 1.5 ml tubes | Fisher Scientific | # 05-408-129 | |
| BD Precisionglide syringe needles, gauge 27, L 1/2 in. | Sigma-Aldrich | Z192384 | |
| Anti-mouse-Ly-6G antibody | BioXCell | BP0075-1 | Clone 1A8 |
| Caspofungin diacetate | Sigma-Aldrich | SML0425 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 1169567762 | |
| Non-Rebreathing Table Top Veterinary Anesthesia Machine | Supera Anesthesia Innovations | M3000 | |
| Pureline Oxygen Concentrator | Supera Anesthesia Innovations | OC8000 | |
| Slant Board Restraint | Indiana State University Facilities Management | Custom made | |
| Gilson PIPETMAN Classic 200 ml Pipets | Fisher Scientific | F123601G | |
| Pentobarbital Sodium (Fatal-Plus) | Vortech Pharmaceuticals | 0298-9373-68 | |
| General-Purpose Broad-Tipped Forceps | Fisher Scientific | 10-300 | |
| Fisherbrand Standard Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-951-20 | |
| Fisherbrand General-Purpose Curved Forceps | Fisher Scientific | 10-275 | |
| Ethyl Alcohol-200 Proof | PHARMCO-AAPER | 111000200 | |
| Fisherbrand Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-63 | |
| BD Precisionglide syringe needles, gauge 25, L 1 in. | Fisher Scientific | Z192406 | |
| All-Plastic Norm-Ject Syringes | Fisher Scientific | 14-817-30 | |
| IV CATH ANGIOCATH 22GX1GIN 50B | Fisher Scientific | NC9742754 | |
| Formalin Solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | |
| 50 ml Conical Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| Thermo Scientific Shandon Embedding Cassettes II in Tube Packs | Fisher Scientific | B1000729 | |
| Fisherfinest Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22-900-700 | |
| Disposable Base Molds | Fisher Scientific | 22-363-554 | |
| Reichert Jung Histocut 820 Microtome | Labequip.com | 31930 | |
| Water Bath | Precision Scientific | 66630-23 | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | 116875H | |
| Silver Stain (Modified GMS) Kit | Sigma-Aldrich | HT100A-1KT | |
| Fast Green FCF | Fisher Scientific | AC410530250 | |
| Frosted Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | |
| Fisherfinest Superslip Cover Glass | Fisher Scientific | 12-545-89 | |
| Cytoseal XYL | Fisher Scientific | 22-050-262 | |
| Olympus Provis AX70 Microscope | Olympus | OLYMPUS-AX70 | |
| U-PHOTO Universal Photo System | Olympus | OLYMPUS-U-PHOTO | |
| U-MCB-2 MULTI CONTROL BOX | Olympus | OLYMPUS-U-MCB-2 | |
| U-PS POWER SUPPLY UNIT | Olympus | OLYMPUS-U-PS | |
| FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze Dry System | LABCONCO | 7740020 | |
| Maxima C Plus Vacuum Pump | Fisher Scientific | 01-257-80 | Displacement- 6.1 cfm |
| 1-Butanol | Fisher Scientific | A383-4 | |
| AMRESCO PHENOL-CHLORFORM-OSOAMYL 100ML DFS | Fisher Scientific | NC9573988 | |
| Free-Standing Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | # 02-682-557 | |
| Mini-Beadbeater-24 | BioSpec Products | 112011 | |
| BioSpec ProductsSupplier Diversity Partner 2.3 MM ZIRCONIA BEADS | Fisher Scientific | NC0451999 | |
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus | Fisher Scientific | A144S | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate | Fisher Scientific | S311 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), White Powder, Electrophoresis | Fisher Scientific | BP166 | |
| Chloroform/isoamyl alcohol 24:1 | Fisher Scientific | AC327155000 | |
| Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer | Fisher Scientific | 11-120-570 | |
| Thermo Scientific™ ABsolute Blue qPCR Mixes | Fisher Scientific | AB4137A | |
| Hybridization Probe, 5′-FAM-AGCCAGCGGCCCGCAAATG-TAMRA-3′ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Sense Amplification Primer, 5′-GGCCCTTAAATAGCCCGGT-3′ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Antisense Amplification Primer, 5′-TGAGCCGATAGTCCCCCTAA-3′ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Applied Biosystems™ MicroAmp™ Optical 8-Tube Strip, 0.2mL | Fisher Scientific | 43-165-67 | |
| Thermo Scientific Domed and Flat PCR Cap Strips | Fisher Scientific | AB-0386 | |
| Mx3005P QPCR System, 110 Volt | Agilent | 401443 | Stratagene is now owned by Agilent |
| BALB/c mice | The Jackson Laboratory | 000651 | |
| C57BL/6 (B6) mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Eosinophil-deficient (ΔdblGATA, BALB/c background) mice | The Jackson Laboratory | 005653 | |
| γδ T cell-deficient (TCRδ-/-, B6 background) mice | The Jackson Laboratory | 002120 | |
| ImageJ Software | National Institutes of Health | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Spot Advanced Software | Spot Imaging | SPOT53A | http://www.spotimaging.com/software/spot-advanced/ |
| GraphPad Prism 6 | GraphPad Software | N/A | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
| Fisherbrand Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Step 4.5 | http://www.bdbiosciences.com/sg/resources/protocols/paraffin_sections.jsp ; http://www.jove.com/science-education/5039 ; http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/General_Information/1/ht100.pdf |
References
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