Summary
Hier beschrijven we een protocol om te bepalen van pulmonaire schimmel last in muizen met invasieve aspergillose door kwantificering van Gomori van gemodificeerde methanamine zilver kleuring in histologische secties. Gebruik van deze methode resulteerde in vergelijkbare resultaten met minder dieren in vergelijking met de beoordeling van schimmel last van kwantitatieve PCR van longkanker schimmel DNA.
Abstract
De kwantificering van longkanker schimmel last is van cruciaal belang voor de bepaling van het relatieve niveau van immuun bescherming en schimmel virulentie in muismodellen van pulmonaire schimmelinfectie. Hoewel meerdere methoden worden gebruikt om te beoordelen van schimmel last, heeft kwantitatieve polymerase-kettingreactie (qPCR) van de schimmel DNA ontpopt als een techniek met verschillende voordelen ten opzichte van eerdere cultuur gebaseerde methoden. Momenteel, vergt een veelomvattende beoordeling van longkanker pathologie, leukocyten werving, schimmel last en genexpressie in muizen met invasieve aspergillose (IA) het gebruik van een groot aantal experimentele en controledieren. Hier werd de kwantificering van Long histologische vlekken om te bepalen van schimmel last met behulp van een beperkt aantal dieren in detail onderzocht. Long secties werden gekleurd om aan te duiden structuren van de schimmel met Gomori van gemodificeerde methanamine silver (GMS) kleuring. Beelden werden genomen van de GMS gebeitste secties uit 4 aparte velden van elke formaline-vaste paraffine-ingebedde Long. De GMS gekleurd gebieden binnen elk beeld werden gekwantificeerd aan de hand van een analyseprogramma van het beeld, en uit deze kwantificering, het gemiddelde percentage van de gebrandschilderde gebied werd bepaald voor elk monster. Met behulp van deze strategie, daalde eosinophil-deficiënte muizen tentoongesteld schimmel lasten en ziekte met caspofungine therapie, terwijl wild-type muizen met IA geen verbetering met caspofungine. Ook schimmelinfecties last in muizen ontbreekt γδ T cellen waren ook verbeterd door caspofungine, zoals gemeten door qPCR en kwantificering van de GMS. GMS kwantificering wordt daarom voorgesteld als een methode voor de bepaling van de relatieve Long schimmel lasten die kan uiteindelijk het verminderen van het aantal proefdieren nodig voor uitgebreide studies van invasieve aspergillose.
Introduction
IA is een opportunistische infectie die in gevoelige personen met aangeboren of verworven immuun gebreken als gevolg van immuun onderdrukkende therapie of chronische infectie1,2 ontwikkelen kan. Primaire infectie vaak treedt op in de longen, hoewel in sommige gevallen verspreiding van Aspergillus fumigatus naar de lever, nieren, hart en hersenen kan optreden, wat resulteert in uitgebreide weefsel invasie van schimmeldraden vergezeld gaat van een ernstige aandoening en hoge tarieven voor sterfte1,2. Bovendien, de doeltreffendheid van de bestaande farmacotherapieën is beperkt, en kan verder worden verzwakt door de opkomst van antimycoticum-resistente stammen in de omgeving-3. Daarom is het belangrijk om te begrijpen van de mechanismen van schimmel virulentie en host pathologie die ontwikkeling bevorderen of verergering van invasieve schimmelziekte.
Lymfkliertest modellen blijven belangrijk voor mechanistische IA studies, zoals zij toestaan dat onderzoekers te beoordelen van de rollen van schimmel virulentiegenen en hosten van immuun effectoren voor de oprichting en groei van A. fumigatus in vivo4,5. Bijgevolg hebben meerdere strategieën al bedacht om effectief te kwantificeren of schimmel last in groepen van proefdieren6,7te vergelijken. Deze strategieën omvatten cultuur gebaseerde, biochemische, immunoassay of qPCR methoden, elk met verschillende voor- en nadelen. Elk van deze methoden betrekken anderzijds de toewijding van een subset van dieren naast de opgeofferd voor evaluaties van immuun effector functie, gen expressie analyse en vergelijkende histopathologie7. Dus vereisen uitgebreide IA studies vaak grote aantallen onderzoek dieren op een aanzienlijke kosten. Effectieve strategieën die experimentele tijd, dierlijke kosten en ethische overwegingen te verminderen door gebruik te maken van dierlijke weefsels voor meerdere analyses zijn dan ook uiterst waardevolle7.
In dit verslag wordt een methode met een beschrijving van de kwantificering van GMS kleuring in histologische secties voor vergelijking van de relatieve schimmel lasten tussen experimentele groepen muizen met IA ingevoerd. Elke stap van de schimmel cultuur naar infectie, weefsel oogst en verwerking, en beeldacquisitie en data-analyse, wordt in detail beschreven. Schimmel lasten verkregen door GMS kwantificering werden vergeleken met qPCR in neutropenic modellen van IA, inzonderheid caspofungine behandeld wild-type of eosinophil-deficiënte muizen met IA8. De resultaten tonen gelijkenis met GMS kwantificering en qPCR van DNA van de schimmel. Dit suggereert dat de kwantificering van de GMS nuttig voor onderzoekers die zich bezighouden met de histologische analyses als een aanvullende of alternatieve methode voor het vergelijken van de relatieve schimmel last in muizen met IA zijn kan, en uiteindelijk kan verminderen de kosten en het gebruik van onderzoek dieren in complexe, mechanistische studies.
Protocol
Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comité van Indiana State University, de campus van de gastheer van de Indiana University School of Medicine — Terre Haute.
1. bereiding van A. fumigatus conidiën infectie
- Tijdens het werken in een goed geventileerde zuurkast, meng 125 µL van A. fumigatus 293 stockoplossing met 900 µL cel cultuur rang water (CCGW). Breng de oplossing voor mout extract (MEA) agarplaat via pipet en gelijkmatig met een inoculating lus.
- Bewaar de schimmel plaat in het donker bij 24 ° C gedurende ten minste 14 dagen en ten hoogste 28 dagen.
- Oogst conidiën met glasparels zoals eerder beschreven9.
- Giet 1.5 g van 0.5 mm glaskralen op het bord en zachtjes heen en weer kantelen totdat de parels om te halen conidiën zijn bekleed. Het verzamelen van de kraal/conidiën mengsel in een conische buis 15 mL. Schorten in 5 mL Dulbecco van fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) en vortex.
- Tellen de conidiën in een 50 x verdunning supernatant in de DPBS met behulp van een hemocytometer. Tellen van het aantal conidiën in het gebied dat is afgebeeld in Figuur 1 en vergelijking 1 gebruiken voor het berekenen van de concentratie.
#Conidia × verdunning Factor 10 ×4= conidiën/mL (vergelijking 1)
Opmerking: Extra 4 x 4 vierkant in de hoeken gebieden kunnen worden geteld, met het gemiddelde van deze gebieden als #Conidia in vergelijking 1gebruikt.
Figuur 1: Hemocytometer representatieve ruimte gebruikt voor conidiën tellen (box, pijl).
- Verdun de conidiën vering met steriele zoutoplossing (DPBS) te verkrijgen van de gewenste concentratie, 1.0 x 108 conidiën/mL voor infectie met 5 x 106 conidiën/50 µL. bereiden 50 µL van conidiën oplossing 'n + 2' muizen besmet voor pipetteren account fout.
Opmerking: Standaard schimmel oogst en voorbereiding/filtratie mogelijk als alternatief gebruikt10. De glazen kraal methode is het best gebruikt om ervoor te zorgen dat de conidiën monsters met minimale kleine/oplosbare hyphal antigenen voor aspiratie worden verkregen.
2. bij immuunsuppressie en infectie van lymfkliertest Model
- Het gebruiken van 7-10-week-oude muizen.
Opmerking: BALB/c, C57BL/6 (B6), eosinophil-deficiënte (ΔdblGATA, achtergrond van de BALB/c), en γδ T-cel-deficiënte (TCRδ-/-, B6 achtergrond) muizen werden gebruikt voor deze studie. Voor elk experiment, leeftijd en geslacht-matched werden (zowel mannen als vrouwen) muizen gebruikt voor elke groep. - Afbreken van neutrofielen via intraperitoneaal (IP) injectie van 0,1 mL (0,5 mg) anti-mouse-Ly - 6G antilichaam in een steriele zoutoplossing op 45° in het laterale lagere juiste kwadrant (voor een experimentele schema, Zie Figuur 2).
- 24 uur later, infecteren muizen door aspiratie met 5.0 x 106A. fumigatus conidiën geschorst in 50 µL steriele zoutoplossing (Zie stappen 2.4-2.10)11zoals hiervoor is beschreven. Een subset van dieren met antimycoticum zoals 5 mg/kg caspofungine DIACETAAT in DPBS gebruikt in deze studie na infectie, injecteren (dagelijks, Zie Figuur 2).
- Anesthetize muizen met 99,9% Isofluraan met behulp van een veterinaire anesthesie-machine.
- Plaats een papieren handdoek op de grond van de kamer van de inductie om ontlasting en urine te vangen.
- Plaatst u de muisaanwijzer in de zaal van inductie, beveiligen van het deksel en de vaporizer ingesteld op 5% Isofluraan voor 2 min en 30 s.
Opmerking: Dierenarts zalf wordt niet gebruikt omdat de totale tijd onder verdoving minder dan 5 min is. - Verminderen van de vaporizer aan de helft van de maximale instelling voor 30 s.
- Bevestigen dat de muis is goed verdoofd door het observeren van vertraagde ademhaling, gebrek aan beweging en gebrek aan respons op Teen-snuifje prikkel.
- Verwijder de muis uit de inductie kamer en plaats op een bord van de inslag. Plaatst u de muisaanwijzer met de rug tegen het bord. Ervoor zorgen dat de bovenste snijtanden zijn voorzichtig worden gefixeerd met een elastiekje en de onderste snijtanden zijn voorzichtig worden gefixeerd met een metalen draad.
- Zorgvuldig de tong op volledig uittrekbaar met kleine pincet en Pipetteer 50 µL van conidiën/PBS ophanging aan de voet van de tong te houden.
- Houd de tong volledig uittrekbaar; luisteren voor snelle ademhaling en de verschillende klikkende geluid van aspiratie. Houd gedurende 20 s of tot schorsing is volledig aanzuiging.
- Verwijder de muis uit de inslag van bestuur en zachtjes te plaatsen in een kooi voor observatie.
- Na aspiratie, moet de muis herwinnen bewustzijn binnen 1 min. Monitor de muis totdat volledig bewust en in staat om te lopen rond de kooi. De dieren moeten worden gehuisvest bij 21 ° C en gecontroleerd tweemaal daags totdat de longen worden geoogst.
- Herhaal de uitputting van de neutrofiele granulocyten (stap 2.2) 24u na infectie (Figuur 2).
Figuur 2: Experimental schema. Dit cijfer werd vanaf een eerdere publicatie8gewijzigd.
3. de oogst en het behoud van muis longen histologische p.a.
- Anesthetize diep het dier met een fatale dosis van 0,1 ml van 390 mg/ml pentobarbital natrium oplossing IP.
- Euthanasie bevestigen door het observeren van gebrek aan spontane ademhaling en uitblijven van antwoord aan ledematen stimulatie met een pincet. Zodra euthanized, spray het karkas met 70% ethanol te steriliseren.
- Plaats het karkas op een bord van de schuim bedekt met een absorberend stootkussen.
Opmerking: Het karkas moet worden geplaatst op zijn rug met pinnen voor de beveiliging van alle vier de ledematen aan de Raad van het schuim. - Open de holte van de bovenste borst met behulp van schaar met de nodige voorzichtigheid. De ribbenkast weg knippen om bloot van de longen en het hart. Snijd de vena cava inferior toe voor perfusie. Vermijd het snijden van de bloedvaten en organen prikken.
- Langzaam perfuse met 5 mL koude DPBS in het rechterventrikel van het hart in een hoek van 45° met een 25-G naald. Herhaal de perfusie met 5 mL van de 10% formaline.
- Zorgvuldig bloot van de luchtpijp en de omringende vet pads losmaken. Ga voorzichtig te werk en Vermijd prikken in de luchtpijp. Zorg ervoor dat het overmatige bindweefsel wordt verwijderd om volledig visualiseren de luchtpijp voordat u verdergaat. Zodra de luchtpijp wordt blootgesteld, plaats onder de luchtpijp te verheffen het pincet.
- Porren een klein gaatje in de bovenste luchtpijp met behulp van een 25-G naald.
Opmerking: Het gat moet worden geplaatst zodat de gehele canule in de luchtpijp past. Wees voorzichtig om te voorkomen dat de luchtpijp bezwijken. - Plaats een canule door het gat en naar de longen. Beveilig de canule met een chirurgische draad gebonden losjes rond de luchtpijp.
Opmerking: Als de luchtpijp is gescheurd, de canule kan worden geplaatst langs de luchtpijp zoveel mogelijk in de luchtweg. - Met behulp van een injectiespuit, blazen de longen met 1 mL 10% formaline buffer via de canule. Zorg ervoor dat de inflatie van de longen zichtbaar. Als dat niet het geval is, passen de katheter en herhaal. Zodra de longen worden opgeblazen, snel verwijderen van de canule met de nodige voorzichtigheid en draai de draad veilig in het afschermen van de luchtpijp.
Opmerking: Als de luchtpijp is gescheurd en de longen niet kunnen worden opgepompt, de longen nog kunnen worden geoogst, maar dit kan voorkomen dat goede fixatie. - De luchtpijp en de longen zachtjes verwijderen uit de borst door zorgvuldig loskoppelen van het bindweefsel van de luchtpijp met een tang terwijl zachtjes te trekken tot op de draad. Plaats de longen en luchtpijp in een conische buis van 50 mL met 15 mL 10% formaline buffer. Plaats een uiteinde van de draad buiten de buis en verzegel het GLB. Omkeren van de buis om volledig onderdompelen het monster in fixeerspray.
- Opslaan van de monsters bij kamertemperatuur gedurende ten minste 24 uur of totdat zij worden verwerkt.
Let op: Formaline is gevaarlijk. Draag passende persoonlijke beschermingsmiddelen met inbegrip van bril en een gezichtsmasker. Werken onder een chemische motorkap bij de verwerking van de monsters.
4. de oogst en het behoud van muis longen voor DNA schimmel last
- Stappen 3.1-3.5 zoals hierboven beschreven op een aparte muis.
- Langzaam perfuse met 10 mL koude DPBS in het rechterventrikel van het hart in een hoek van 45° met een 25-G naald.
- Accijnzen van de longen met een schaar en plaats in gelabelde 1,5 mL tubes.
- De longen bij-80 ° C worden opgeslagen totdat zij worden verwerkt.
- Gebruik standaard technieken zoals beschreven (insluiten en segmentering) en volgens de protocollen van de fabrikant (Zie Tabel van materialen).
5. microscopie en Imaging
- De kwantificering beeldbewerkingsprogramma te openen (Zie Tabel van materialen).
- Met behulp van een lichte Microscoop, verkrijgen ten minste 4 verschillende velden van de GMS gekleurd dia's (10 X doelstelling). Zorgen dat de beelden vertegenwoordiger van de besmette luchtwegen in de longen met soortgelijke weefsel dichtheid zijn.
Opmerking: Als de dichtheid en de distributie van hyphal foci aanzienlijk verschillen tussen controle en experimentele groepen weergegeven, extra velden kunnen worden genomen, of de GMS-gebied van de gehele Long sectie Image kan worden gemaakt (4 X doelstelling). Afbeeldingen van dezelfde gebieden van de Long (geïdentificeerd door gelijkwaardige weefsel morfologie) op een sectie van de seriële Long gekleurd met haematoxyline en eosine, verkrijgen indien gewenst. - Voeg schaal bars aan de beelden waar nodig en sla de afbeeldingen moeten worden gekwantificeerd. Selecteer, bewerken > Add/Edit kalibratie merken > Menu: lijn dikte, kleur en schaal bar formaat kiezen > Klik op de afbeelding voor waar de schaal bar is te worden geplaatst. Hiermee sluit u het Menu en kies, bewerken > samenvoegen > samenvoegen kalibratie merken > Kies bestand opslaan als > naam van het bestand en klik op opslaan.
6. met behulp van een Image Processing Program voor het berekenen van de schimmel last (Figuur 3)
- Open een beeld processing programma. Selecteer Bestand > map met monsters te kwantificeren > afbeelding (figuur 3A). Selecteer Beeld > Type > omzetten in "RGB Stack" (figuur 3B).
- Gebruik de pijl-rechts-toets om de tweede van de drie bepaalde beelden (figuur 3B). Raken van "controle + verschuiving + T" om de "Drempel" menu instellingen adjustor (Figuur 3 c). Zoek de oorspronkelijke .tiff- of JPG-afbeelding als een referentie en open met een afbeelding weergeven programma (Figuur 3 c).
- Trek de bovenste schuifregelaar helemaal naar links en de onderste schuifknop totdat het gebied geselecteerd (in rood) is de vertegenwoordiger van het beeld van de microscopie (meestal variërend van 130-160 zoals rechts van de schuifregelaar (Figuur 3 c).
- Zodra geselecteerd, druk op "Set" > "OK" (figuur 3D). Selecteer "Analyseren" > "Set metingen" > check van "Gebied, gebied de Fractie, te beperken tot drempel, Display Label" en laat de onderkant instellingen (de waterdruppel-waas spijskaart en decimalen) als standaard > "OK" (figuur 3D).
- Belangrijke gebieden van witruimte of achtergrondkleuring kunnen worden uitgesloten door de selectie van het juiste weefsel met een gebied of veelhoek.
- Ten slotte selecteert, "Analyze" > "Maatregel" (een venster met gegevens wordt weergegeven, of een tabblad op de windows-taakbalk weergegeven met het label, "Resultaten") (figuur 3E). De gegevens overbrengen naar een data-analyseprogramma voor graphing en statistische analyse.
- Het gemiddelde van de vier gebied percentages voor elk monster Long invoeren. 5-8 monsters zijn in het algemeen voldoende om het detecteren van de verschillen tussen groepen. Als het vergelijken van twee experimentele groepen, voert u een ongepaard student t-test om te bepalen van betekenis.
Figuur 3: vertegenwoordiger screenshots voor elke stap van GMS histologische field kwantificering. (A) selecteert u Bestand > map met monsters te kwantificeren > Selecteer afbeelding. (B) Selecteer Beeld > Type > omzetten in "RGB Stack". Gebruik de pijl-rechts-toets om de tweede van de drie bepaalde beelden. (C) Hit "control + shift + T" om de "Drempel" menu instellingen adjustor. De oorspronkelijke .tiff- of JPG-afbeelding als een verwijzing zoeken en openen met foto viewer-programma. Haal de bovenste schuifregelaar helemaal links en past u de schuifregelaar onder totdat het gebied geselecteerd (in rood) is de vertegenwoordiger van het beeld van de microscopie (meestal variërend van 130-160 zoals rechts van de schuifregelaar. (D) zodra de geselecteerde pers "Set" > "OK". Selecteer "Analyseren" > "Set metingen" > check van "Gebied, gebied de Fractie, te beperken tot drempel, Display Label" en laat de onderkant instellingen (de waterdruppel-waas spijskaart en decimalen) als standaard > "OK". (E) tot slot Selecteer "analyseren" > "Maatregel" (een venster met gegevens wordt weergegeven, of een tabblad op de windows-taakbalk weergegeven met het label "Resultaten"). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
7. DNA schimmel last
- De longen verwijderen-80 ° C en lyophilize gedurende ten minste 4 uur ('s nachts is optimale) of tot volledig gedroogd door een droog systeem van bevriezen.
- Terwijl de longen drogen, bereiden DNA-extractie-buffer (0,1 M NaCl, 10 mM EDTA pH 8.0, 10 mM Tris HCl pH 8.0, en 0,5% SDS).
- Plaats de bereid DNA-extractie-buffer in een bad van 60 ° C water vooraf opwarmen. Ook het plaatsen van fenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1) in een conische buis van 50 mL en voorzien in een scheiding.
- Plaats de gelyofiliseerd longen in een schroefdop van 2 mL tube met 0,2 mL glazen kralen. Met behulp van een klopper kraal, grind droog longweefsel voor 15-30 s totdat het vormt een fijn poeder.
- Voeg goed 0.8 mL warme DNA-extractie buffer toe aan elke buis en vortex. Incubeer elke buis gedurende 15 min. in een bad van 65 ° C kraal en vervolgens vortex vóór het incuberen voor een extra 15 min. Na incubatie, vortex, waarna centrifuge buizen bij 25.000 x g gedurende 10 minuten.
- Label 3 sets van 1,5 mL tubes voor elk van de monsters en breng de bovenste laag van de bovendrijvende substantie in een set van buizen. Wees voorzichtig terwijl pipetteren uit de bovenste laag van waterige om verstoring van de middelste laag.
- Voeg gelijke hoeveelheid fenol: chloroform: Isoamylalcohol toe en meng goed. Centrifugeer dan bij 25.000 x g gedurende 15 minuten vóór pipetteren uit de bovenste laag in de tweede set van buizen.
- Toevoegen van gelijk volume chloroform: isoamyl chloroform, meng goed en centrifugeer bij 25.000 x g gedurende 10 minuten zorgvuldig Pipet uit de bovenste laag in de derde set van buizen.
- Voeg toe 500 µL van isopropanol en 50 µL NaoAc (pH 5.2), meng goed, en laat monsters te broeden bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Vervolgens Centrifugeer bij 25.000 x g gedurende 30 min en decanteren van de bovendrijvende substantie.
- Wassen van de DNA-pellet met 750 µL van ijs koud 70% ethanol en Centrifugeer gedurende 5 min op 25.000 x g. Decant de ethanol en laat dat de pellets aan de lucht drogen in de buizen in een fume hoods voor 40 min.
- Resuspendeer de droge korrels in 300 µL van TE buffer.
Opmerking: Het DNA kan worden opgeslagen bij-20 ° C tot gekwantificeerd. - Kwantificeren van DNA met een spectrofotometer en 100 µL van 0,2 µg/µL van elk DNA-monster voorbereiden qPCR analyse.
- Het uitvoeren van een standaard qPCR in drievoud met 1 microgram van DNA-monster, schimmel 18S rDNA primer, zoals hiervoor is beschreven en sonde wordt ingesteld met een aangepaste sonde quencher (5'- / 56-FAM/AGC CAG CGG/ZEN/CCC GCA AAT G/3IABkFQ /-3')12,,13.
- Voorbereiden van een standaard curve van A. fumigatus genomic DNA en bereken de concentratie van schimmel DNA in pg in elk monster met behulp van de gemiddelde verslaggever kleurstof Ct-waarden.
- Plot de pg/µg schimmel DNA met de standaardfout van het gemiddelde. Uitvoeren van een student t-test analyse om te bepalen van betekenis.
Opmerking: als een minder toxisch alternatief voor de DNA-extractie van fenol-chloroform gebruikt hierin, kolom op basis van DNA-extractie kits kunnen worden gebruikt.
Representative Results
Figuur 4 bevat een grafiek van de overleving van wild type of eosinophil-deficiënte muizen met IA behandeld met caspofungine. De resultaten tonen aan dat eosinophil-deficiënte muizen tentoongesteld verhoogde overleving in vergelijking met wild-type muizen (50% sterfte / 100% sterfte, respectievelijk). Figuur 5 toont vertegenwoordiger GMS kleuring van neutropenic wild-type en eosinophil-deficiënte muizen met IA behandeld of onbehandeld met caspofungine. Caspofungine behandeling resulteerde in relatieve schimmel mijnen in eosinophil-deficiënte, maar niet wild-type muizen (juiste panelen), terwijl beide groepen die geen caspofungine waren vergelijkbaar (linker panelen). Figuur 6 geeft een vergelijking van schimmel last in caspofungine behandelde en onbehandelde wild-type of eosinophil-deficiënte muizen controle, met behulp van de beide qPCR van schimmel DNA (figuur 6A) en vertegenwoordiger GMS kwantificering van 4 (10 X doelstelling) velden) Figuur 6B). De resultaten die zijn gegenereerd op basis van beide technieken blijkt dat caspofungine behandelingsresultaten in de meest significante schimmel lasten tussen wild-type en eosinophil-deficiënte muizen (figuur 6A afnemen). Echter in onbehandelde muizen resulteerden alleen GMS kwantificering in een aanzienlijke daling in muizen ontbreekt eosinofielen (figuur 6B). Wanneer de gemiddelde oppervlakte van geheel-lung GMS gebeitste secties werden berekend (4 X doelstelling), de verschillen kwamen overeen met de resultaten verkregen met 4 vertegenwoordiger 10 X velden, maar met minder statistische significantie (Figuur 6 c). Figure 7 toont overleving, beelden van vertegenwoordiger GMS kleuring (4 10 X velden), en kwantificering van schimmel last door beide methoden in γδ (TCRδKO) T-cel-deficiënte muizen die werden behandeld met caspofungine in vergelijking met controle, onbehandeld muizen. Caspofungine behandeling betere overleving (figuur 7A) en schimmel last (figuur 7B-D) bij TCRδKO muizen. Vergelijkbaar met de resultaten van Figuur 6, de resultaten van schimmel lasten zoals gemeten door het qPCR (figuur 7B) en vertegenwoordiger GMS kwantificering (Figuur 7 c) waren vergelijkbaar.
Figuur 4: verhoogd overleven in (ΔdblGATA) eosinophil-deficiënte muizen met IA na behandeling met caspofungine. 15-30 muizen/groep. Samenvatting van 3-6 experimenten. p < 0,0001. Dit cijfer werd vanaf een eerdere publicatie8gewijzigd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: representatieve beelden van GMS gebeitste Long secties met wild-type, eosinophil ontoereikend, en caspofungine-behandeld of besturingselement onbehandeld muizen met IA. Vertegenwoordiger van 3-4 muizen/groep. Schaal bar is gelijk aan 100 µm. Dit cijfer werd vanaf een eerdere publicatie8gewijzigd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: schimmel last bij wild-type, eosinophil-deficiënte muizen met IA behandeld of besturingselement behandeld met caspofungine. (A) qPCR van DNA van de schimmel. 15-30 muizen/samenvattingsrij van een groep, van 3-6 experimenten. (B) GMS kwantificering van histologische secties, gemiddelde % van GMS kleuring van 4 velden (10 x doelstelling). (C) GMS kwantificering, gemiddelde % van de gehele Long sectie (4 X doelstelling). B en C zijn een samenvatting van 5 muizen/groep. p < 0.05. p < 0,001. p < 0,0001. Deze afbeelding is gegenereerd met behulp van de gegevens die werden gerapporteerd in een eerdere publicatie8. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7: ernst van IA in γδ T-cel-deficiënte muizen daalde na behandeling van caspofungine. (A) overleven. (B) qPCR van DNA van de schimmel. (C) GMS kwantificering van histologie. (D) representatieve beelden van GMS gebeitste secties van γδ T cellen met IA, behandelde of onbehandelde met caspofungine. A en B zijn een samenvatting van twee experimenten met 7-10 muizen/groep. C en D zijn een samenvatting van 4 muizen/groep. p < 0.05. p < 0,01. p < 0,001. Dit cijfer werd vanaf een eerdere publicatie8gewijzigd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Het doel van dit artikel was om een methode voor de bepaling van de schimmel last long in muizen met IA met behulp van GMS gebeitste Long histologische secties voor beeldanalyse en kwantificering. In deze studie, de behandeling met de β-glucaan-synthese-targeting antischimmel drug caspofungine14 geen verbetering overlevings- of schimmel last in neutropenic wild-type muizen met IA8. Echter bij het ontbreken van eosinofielen of γδ T cellen, overleving en schimmel lasten verbeterd. De resultaten van onze studie toonde ook aan dat vergelijkbare resultaten kunnen worden verkregen door de schimmel last GMS in vergelijking met de veel gebruikte schimmel DNA qPCR methode6.
Er zijn verschillende voordelen aan het gebruik makend van GMS schimmel last kwantificering. Eerst, kan het proces gebruik maken van bestaande histologische monsters, waardoor het aantal experimenten vereist om te bepalen van verschillen mogelijk. Ten tweede, in deze studie, minder dieren nodig waren voor GMS schimmel last kwantificering te bereiken significante verschillen in vergelijking met de qPCR van de schimmel DNA (Figuur 6, Figuur 7). Ten derde, vergelijking van schimmel lasten in verschillende isolaten door qPCR kan worden beïnvloed door isolaat-afhankelijke verschillen in ribosomal DNA kopie nummer15. GMS kwantificering is daarentegen niet beïnvloed door exemplaaraantal, zoals schimmel last wordt bepaald door de relatieve niveaus van longkanker de groei van zwammen. Dus, het gebruik van GMS kwantificering voor schimmel lasten vermindert het gebruik van gewervelde dieren en vereist geen voorafgaande bepaling van rDNA exemplaaraantal. Tot slot, naast het wijzigen van schimmel morfologie, caspofungine therapie verhoogt schimmel versnippering en dus kan kunstmatig verhogen schimmel last wanneer gemeten door isolatie van kolonie vormende eenheden van Long homogenates12,16 ,17. Dus vermijdt GMS kwantificering van schimmel last verscheidene beperkingen die inherent zijn aan met andere veelgebruikte methoden.
De beperkingen van GMS kwantificering en/of deze studie zijn echter belangrijk op te merken. Ten eerste, de auteurs uitgegaan van een vergelijkbare verdeling van hyphal groei in de longen van elke experimentele groep, en dus gebruikt kwantificering van 4 vertegenwoordiger 10 x objectieve velden als een representatieve meting voor de schimmel last in de gehele Long (Figuur 6B). Het is mogelijk dat in sommige gevallen de relatieve verdeling, de grootte en de dichtheid van hyphal foci voldoende verschillen zou dus dat de schimmel last er anders uit met deze methode en gelijkwaardig door de qPCR-methode zien zou. Onze bijkomende resultaten met hele Long sectie kwantificering met behulp van de 4 X objectieve velden toonde echter vergelijkbaar, zij het minder statistisch significant, verschillen tussen groepen (Figuur 6 c). De standaardfout van deze kwantificering werd verhoogd met deze strategie, waarschijnlijk als gevolg van de verminderde hyphal resolutie met de 4 X doelstelling en verhoogde achtergrond in suboptimaal velden. Een representatieve kwantificering van minder velden bij hogere vergroting heeft daarom de voorkeur. Ten tweede, werd slechts een enkele, centrale sectie gebruikt voor elk monster. Het is mogelijk, op basis van de schimmel isolaten of muizen stammen gebruikt, dat sommige studies kunnen leiden tot een ongelijke verdeling van hyphal groei. In die gevallen, moeten extra secties in elk blok van paraffine worden gekwantificeerd om te verkrijgen van een meer representatieve belasting. Ten derde: in experimenten die aanzienlijke productie van mucinen (d.w.z., kwantificering airway groei van zwammen in allergische broncho aspergillose (ABPA)18 of cystic fibrosis (CF)18), GMS reactiviteit met veroorzaken polysaccharide-rijke mucinen19 kunnen aspecifieke GMS + resultaten opleveren en zo scheef sommige monsters in het voordeel van de hogere schimmel Last. Aangezien alleen de neutropenic model van IA in deze studie werd gebruikt, is het mogelijk dat het gebruik van andere immuun bevoegde of onderdrukkende modellen kan resultaten in minder vergelijkbare resultaten. Ondanks deze kanttekeningen, GMS kwantificering biedt een vergelijkbare techniek om te bepalen van schimmel last en het verdere gebruik ervan in de bijkomende studies kan het nut van deze methode als consistente, betrouwbare en kosteneffectieve verder valideren.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door een Indiana University School van geneeskunde Enhancement onderzoeksbeurs en door de NIH-NIAID 1R03AI122127-01. N.A. werd het gedeeltelijk ondersteund gedurende deze periode door een carrière in immunologie Fellowship van de Amerikaanse vereniging van immunologen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aspergillus fumigatus 293 Stock Solution | Fungal Genetics Stock Center | FGSC #A1100 | |
| HyPure Cell Culture Grade Water | Thermo Fisher Scientific | SH30529.03 | |
| Malt Extract | MP Biomedicals | 2155315 | White Powder |
| BD BBL Acidicase Dehydrated Culture Media: Peptone | Fisher Scientific | L11843 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS) | Fisher Scientific | D16-3 | |
| Fisher BioReagents Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| Auto Dry Cabinet | Shanghai Hasuc Instrument Manufacture Co.,LTD | HSFC160FD | |
| 1300 Series Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific | 1375 | |
| 0.5 mm Glass Beads | BioSpec Products | 11079105 | |
| 15 ml Conical Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | # 0267110 | |
| Leica Model DME Microscope | Leica | 13595XXX | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662-500 ml | |
| 1.5 ml tubes | Fisher Scientific | # 05-408-129 | |
| BD Precisionglide syringe needles, gauge 27, L 1/2 in. | Sigma-Aldrich | Z192384 | |
| Anti-mouse-Ly-6G antibody | BioXCell | BP0075-1 | Clone 1A8 |
| Caspofungin diacetate | Sigma-Aldrich | SML0425 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 1169567762 | |
| Non-Rebreathing Table Top Veterinary Anesthesia Machine | Supera Anesthesia Innovations | M3000 | |
| Pureline Oxygen Concentrator | Supera Anesthesia Innovations | OC8000 | |
| Slant Board Restraint | Indiana State University Facilities Management | Custom made | |
| Gilson PIPETMAN Classic 200 ml Pipets | Fisher Scientific | F123601G | |
| Pentobarbital Sodium (Fatal-Plus) | Vortech Pharmaceuticals | 0298-9373-68 | |
| General-Purpose Broad-Tipped Forceps | Fisher Scientific | 10-300 | |
| Fisherbrand Standard Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-951-20 | |
| Fisherbrand General-Purpose Curved Forceps | Fisher Scientific | 10-275 | |
| Ethyl Alcohol-200 Proof | PHARMCO-AAPER | 111000200 | |
| Fisherbrand Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-63 | |
| BD Precisionglide syringe needles, gauge 25, L 1 in. | Fisher Scientific | Z192406 | |
| All-Plastic Norm-Ject Syringes | Fisher Scientific | 14-817-30 | |
| IV CATH ANGIOCATH 22GX1GIN 50B | Fisher Scientific | NC9742754 | |
| Formalin Solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | |
| 50 ml Conical Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| Thermo Scientific Shandon Embedding Cassettes II in Tube Packs | Fisher Scientific | B1000729 | |
| Fisherfinest Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22-900-700 | |
| Disposable Base Molds | Fisher Scientific | 22-363-554 | |
| Reichert Jung Histocut 820 Microtome | Labequip.com | 31930 | |
| Water Bath | Precision Scientific | 66630-23 | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | 116875H | |
| Silver Stain (Modified GMS) Kit | Sigma-Aldrich | HT100A-1KT | |
| Fast Green FCF | Fisher Scientific | AC410530250 | |
| Frosted Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | |
| Fisherfinest Superslip Cover Glass | Fisher Scientific | 12-545-89 | |
| Cytoseal XYL | Fisher Scientific | 22-050-262 | |
| Olympus Provis AX70 Microscope | Olympus | OLYMPUS-AX70 | |
| U-PHOTO Universal Photo System | Olympus | OLYMPUS-U-PHOTO | |
| U-MCB-2 MULTI CONTROL BOX | Olympus | OLYMPUS-U-MCB-2 | |
| U-PS POWER SUPPLY UNIT | Olympus | OLYMPUS-U-PS | |
| FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze Dry System | LABCONCO | 7740020 | |
| Maxima C Plus Vacuum Pump | Fisher Scientific | 01-257-80 | Displacement- 6.1 cfm |
| 1-Butanol | Fisher Scientific | A383-4 | |
| AMRESCO PHENOL-CHLORFORM-OSOAMYL 100ML DFS | Fisher Scientific | NC9573988 | |
| Free-Standing Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | # 02-682-557 | |
| Mini-Beadbeater-24 | BioSpec Products | 112011 | |
| BioSpec ProductsSupplier Diversity Partner 2.3 MM ZIRCONIA BEADS | Fisher Scientific | NC0451999 | |
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus | Fisher Scientific | A144S | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate | Fisher Scientific | S311 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), White Powder, Electrophoresis | Fisher Scientific | BP166 | |
| Chloroform/isoamyl alcohol 24:1 | Fisher Scientific | AC327155000 | |
| Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer | Fisher Scientific | 11-120-570 | |
| Thermo Scientific™ ABsolute Blue qPCR Mixes | Fisher Scientific | AB4137A | |
| Hybridization Probe, 5′-FAM-AGCCAGCGGCCCGCAAATG-TAMRA-3′ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Sense Amplification Primer, 5′-GGCCCTTAAATAGCCCGGT-3′ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Antisense Amplification Primer, 5′-TGAGCCGATAGTCCCCCTAA-3′ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Applied Biosystems™ MicroAmp™ Optical 8-Tube Strip, 0.2mL | Fisher Scientific | 43-165-67 | |
| Thermo Scientific Domed and Flat PCR Cap Strips | Fisher Scientific | AB-0386 | |
| Mx3005P QPCR System, 110 Volt | Agilent | 401443 | Stratagene is now owned by Agilent |
| BALB/c mice | The Jackson Laboratory | 000651 | |
| C57BL/6 (B6) mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Eosinophil-deficient (ΔdblGATA, BALB/c background) mice | The Jackson Laboratory | 005653 | |
| γδ T cell-deficient (TCRδ-/-, B6 background) mice | The Jackson Laboratory | 002120 | |
| ImageJ Software | National Institutes of Health | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Spot Advanced Software | Spot Imaging | SPOT53A | http://www.spotimaging.com/software/spot-advanced/ |
| GraphPad Prism 6 | GraphPad Software | N/A | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
| Fisherbrand Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Step 4.5 | http://www.bdbiosciences.com/sg/resources/protocols/paraffin_sections.jsp ; http://www.jove.com/science-education/5039 ; http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/General_Information/1/ht100.pdf |
References
- Hohl, T. M., Feldmesser, M. Aspergillus fumigatus: principles of pathogenesis and host defense. Eukaryot Cell. 6 (11), 1953-1963 (2007).
- Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. Aspergillus fumigatus--what makes the species a ubiquitous human fungal pathogen? PLoS Pathog. 9 (12), e1003743 (2013).
- Ostrosky-Zeichner, L., Casadevall, A., Galgiani, J. N., Odds, F. C., Rex, J. H. An insight into the antifungal pipeline: selected new molecules and beyond. Nat Rev Drug Discov. 9 (9), 719-727 (2010).
- Desoubeaux, G., Cray, C. Rodent Models of Invasive Aspergillosis due to Aspergillus fumigatus: Still a Long Path toward Standardization. Front Microbiol. 8, 841 (2017).
- Hohl, T. M. Overview of vertebrate animal models of fungal infection. J Immunol Methods. 410, 100-112 (2014).
- Sheppard, D. C., et al. Comparison of three methodologies for the determination of pulmonary fungal burden in experimental murine aspergillosis. Clin Microbiol Infect. 12 (4), 376-380 (2006).
- Patterson, T. F. The future of animal models of invasive aspergillosis. Med Mycol. 43 Suppl 1, S115-S119 (2005).
- Amarsaikhan, N., et al. Caspofungin Increases Fungal Chitin and Eosinophil and gammadelta T Cell-Dependent Pathology in Invasive Aspergillosis. J Immunol. 199 (2), 624-632 (2017).
- Templeton, S. P., Buskirk, A. D., Law, B., Green, B. J., Beezhold, D. H. Role of germination in murine airway CD8+ T-cell responses to Aspergillus conidia. PLoS One. 6 (4), e18777 (2011).
- Brunel, S. F., et al. Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus. J Vis Exp. (122), (2017).
- Rao, G. V., et al. Efficacy of a technique for exposing the mouse lung to particles aspirated from the pharynx. J Toxicol Environ Health A. 66 (15), 1441-1452 (2003).
- Bowman, J. C., et al. Quantitative PCR assay to measure Aspergillus fumigatus burden in a murine model of disseminated aspergillosis: demonstration of efficacy of caspofungin acetate. Antimicrob Agents Chemother. 45 (12), 3474-3481 (2001).
- Li, H., et al. The small GTPase RacA mediates intracellular reactive oxygen species production, polarized growth, and virulence in the human fungal pathogen Aspergillus fumigatus. Eukaryot Cell. 10 (2), 174-186 (2011).
- Sucher, A. J., Chahine, E. B., Balcer, H. E. Echinocandins: the newest class of antifungals. Ann Pharmacother. 43 (10), 1647-1657 (2009).
- Herrera, M. L., Vallor, A. C., Gelfond, J. A., Patterson, T. F., Wickes, B. L. Strain-dependent variation in 18S ribosomal DNA Copy numbers in Aspergillus fumigatus. J Clin Microbiol. 47 (5), 1325-1332 (2009).
- Kirkpatrick, W. R., Perea, S., Coco, B. J., Patterson, T. F. Efficacy of caspofungin alone and in combination with voriconazole in a Guinea pig model of invasive aspergillosis. Antimicrob Agents Chemother. 46 (8), 2564-2568 (2002).
- Petraitiene, R., et al. Antifungal efficacy of caspofungin (MK-0991) in experimental pulmonary aspergillosis in persistently neutropenic rabbits: pharmacokinetics, drug disposition, and relationship to galactomannan antigenemia. Antimicrob Agents Chemother. 46 (1), 12-23 (2002).
- Cowley, A. C., Thornton, D. J., Denning, D. W., Horsley, A. Aspergillosis and the role of mucins in cystic fibrosis. Pediatr Pulmonol. 52 (4), 548-555 (2017).
- Taylor, M. J., et al. Detection of fungal organisms in eosinophilic mucin using a fluorescein-labeled chitin-specific binding protein. Otolaryngol Head Neck Surg. 127 (5), 377-383 (2002).
