Här beskriver vi ett protokoll för att bestämma pulmonell svamp börda i möss med invasiv aspergillos genom kvantifiering av Gomoris modifierade methanamine silver färgning i histologiska sektioner. Användning av denna metod resulterat i jämförbara resultat med mindre djur jämfört med bedömningen av svamp börda med kvantitativ PCR av lung svamp DNA.
Kvantifiering av lung svamp börda är avgörande för fastställandet av de relativa nivåerna av immun skydd och svamp virulens i musmodeller av pulmonell svampinfektion. Även om flera metoder används för att bedöma svamp bördan, har kvantitativa polymeraskedjereaktion (qPCR) svamp DNA framträtt som en teknik med flera fördelar jämfört med tidigare kultur-baserade metoder. För närvarande nödvändiggör en omfattande bedömning av lung patologi, leukocyt rekrytering, svamp börda och genuttryck i möss med invasiv aspergillos (IA) användning av ett betydande antal experimentella och kontrolldjur. Här undersöktes kvantifiering av lung histologiska färgning för att avgöra svamp börda med ett minskat antal djur i detalj. Lungan sektioner var målat för att identifiera svamp strukturer med Gomoris modifierade methanamine silver (GMS) färgning. Bilder är tagna från avsnitten GMS-färgade från 4 diskret fält av varje formalin-fast paraffin-inbäddat lunga. GMS missfärgade områden inom varje bild kvantifierades använder ett program för analys av bilden, och från denna kvantifiering, bestämdes genomsnittliga andelen färgade området för varje prov. Använda denna strategi, minskade eosinofila-brist möss uppvisade svamp börda och sjukdom med kaspofungin terapi, medan vildtyp möss med IA inte förbättrades med kaspofungin. På samma sätt förbättrades också svamp börda i möss som saknar γδ T-celler av kaspofungin, mätt med qPCR och GMS kvantifiering. GMS kvantifiering introduceras därför som en metod för bestämning av relativa lung svamp börda som i slutändan kan minska mängden av försöksdjur krävs för omfattande studier av invasiv aspergillos.
IA är en opportunistisk infektion som kan utvecklas hos mottagliga individer med medfödd eller förvärvad immunbrister på grund av suppressiv immunterapi eller kronisk infektion1,2. Primär infektion ofta sker i lungorna, men i vissa fall spridning av Aspergillusfumigatus till levern, njurarna, hjärtat och hjärnan kan uppstå, vilket resulterar i omfattande vävnad invasion av hyfer åtföljs av svår sjukdom och hög priser för dödlighet1,2. Dessutom effekten av befintliga läkemedelsbehandlingar är begränsad, och kan försvagas ytterligare av framväxten av svampdödande-resistenta stammar i miljö3. Det är därför viktigt att förstå de mekanismer av svamp virulens och värd patologi som främjar utveckling eller försämring av invasiv svampsjukdom.
Murina modeller förblir viktigt för mekanistiska IA studier, eftersom de tillåter forskare att bedöma svamp virulensgener roller och värd immun effektorer för etablering och tillväxt av A. fumigatus invivo4,5. Följaktligen, flera strategier utformats för att faktiskt kvantifiera eller jämföra svamp börda i grupper av försöksdjur6,7. Dessa strategier omfattar kultur-baserade, biokemiska, immunoassay eller qPCR metoder, med distinkta fördelar och nackdelar. Dessutom innebär dessa metoder av en delmängd av djur utöver de offrade för bedömningar av immun effektor funktion, gen uttryck analys och jämförande histopatologi7engagemang. Således kräver omfattande IA studier ofta betydande antal försöksdjur till en betydande kostnad. Effektiva strategier som minskar experimentell tid, djur kostnader och etiska överväganden genom att utnyttja djurvävnader för flera analyser är därför oerhört värdefulla7.
I betänkandet införs en metod som beskriver kvantifiering av GMS färgning i histologiska sektioner för jämförelse av relativ svamp bördan mellan experimentella grupper av möss med IA. Varje steg från svamp kultur till infektion, vävnad skörd och bearbetning, och bild förvärv och dataanalys, beskrivs i detalj. Svamp bördor erhålls genom GMS kvantifiering jämfördes med qPCR neutropen modeller av IA och behandlats med kaspofungin vildtyp eller eosinofila-brist möss med IA8. Resultaten visar likheten med GMS kvantifiering och qPCR av svamp DNA. Detta tyder på att GMS kvantifiering kan vara användbar för forskare bedriver histologiska analyser som en kompletterande eller alternativa metod för jämförelse av relativ svamp börda i möss med IA, och i slutändan kan minska kostnaderna och användning av försöksdjur i komplexa, mekanistiska studier.
Syftet med denna artikel var att införa en metod för bestämning av lung svamp börda i möss med IA genom att utnyttja GMS-färgade lung histologiska sektioner för bildanalys och kvantifiering. I denna studie jämfördes behandling med β-glukan-syntes-targeting svampdödande läkemedel kaspofungin14 inte bättre överlevnad eller svamp börda hos neutropena vildtyp möss med IA8. Men i avsaknad av eosinofiler eller γδ T-celler, överlevnad och svamp börda förbättrat. Resultaten av vår studie visade också att jämförbara resultat kan erhållas av GMS svamp börda i jämförelse med den utbredda svamp DNA qPCR metod6.
I området i närheten finns det flera fördelar med att utnyttja GMS svamp börda kvantifiering. Första kan processen utnyttja befintliga histologiska prover, vilket potentiellt minskar antalet experiment som krävs för att fastställa betydande skillnader. För det andra, i denna studie, mindre djur krävdes för GMS svamp börda kvantifiering att uppnå betydande skillnader jämfört med qPCR av svamp DNA (figur 6, figur 7). För det tredje, jämförelse av svamp börda i olika isolat av qPCR kan påverkas av isolat-beroende skillnader i ribosomal DNA kopia nummer15. GMS kvantifiering påverkas däremot inte av kopienumret, som svamp börda bestäms av relativa nivåer av lung svamptillväxt. Således, användning av GMS kvantifiering för svamp bördan minskar användningen av vertebrate djur och kräver inte före fastställandet av rDNA kopienumret. Slutligen, förutom att ändra svamp morfologi, kaspofungin terapi ökar svamp fragmentering, och thus ökas artificiellt svamp börda mätt med isolering av kolonin bildar enheter från lungan homogenates12,16 ,17. Således, GMS kvantifiering av svamp börda undviker flera begränsningar med andra vanliga metoder.
Begränsningarna av GMS kvantifiering och/eller denna studie är dock viktigt att notera. Först, författarna antog en jämförbar fördelning av hyphal tillväxt i hela lungorna av varje experimentella gruppen, och därför används kvantifiering från 4 representant 10 x objektiva fält som en representativ mätning för svamp bördan i hela lungan (Figur 6B). Det är möjligt att i vissa fall den relativa fördelningen, storlek och täthet av hyphal foci skulle tillräckligt skiljer sig så att svamp bördan skulle se annorlunda ut med denna metod och motsvarande av metoden qPCR. Våra ytterligare resultat med hela lungan avsnitt kvantifiering med fälten som 4 X objektiv visade dock liknande, om än mindre statistiskt signifikanta, skillnader mellan grupperna (figur 6 c). Standardfel för denna kvantifiering ökades med denna strategi, sannolikt på grund av minskad hyphal upplösning med 4 X mål och ökad bakgrund i suboptimala fält. Därför föredras en representativ kvantifiering av färre fält i högre förstoring. För det andra, användes bara en enda, central avsnitt för varje prov. Det är möjligt, baserat på svamp isolaten eller möss stammar används, att vissa studier kan leda till en ojämn fördelning av hyphal tillväxt. I dessa fall bör ytterligare avsnitt hela varje paraffin-block kvantifieras för att få en mer representativ börda. För det tredje, i experiment som inducerar omfattande produktion av muciner (dvs.kvantifiera luftvägarna svamptillväxt i allergisk bronkopulmonell aspergillos (ABPA)18 eller cystisk fibros (CF)18), GMS reaktivitet med polysackarid-rika muciner19 kunde ge ospecifika GMS + resultat och således skeva några prover till förmån för högre fungal börda. Eftersom endast neutropen modellen av IA användes i denna studie, är det möjligt att användningen av andra immun behöriga eller suppressiv modeller kunde resulterar i mindre jämförbara resultat. Trots dessa varningar, GMS kvantifiering ger en jämförbar teknik för att bestämma svamp börda, och dess fortsatta användning i ytterligare studier kan ytterligare validera nyttan av denna metod som konsekvent, tillförlitliga och kostnadseffektiva.
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöddes delvis av en Indiana University skola av medicin Enhancement forskningsbidrag och av NIH-NIAID 1R03AI122127-01. N.A. stöddes delvis under denna period av en karriär inom immunologi Fellowship från den amerikanska Association av Immunologer.
Aspergillus fumigatus 293 Stock Solution | Fungal Genetics Stock Center | FGSC #A1100 | |
HyPure Cell Culture Grade Water | Thermo Fisher Scientific | SH30529.03 | |
Malt Extract | MP Biomedicals | 2155315 | White Powder |
BD BBL Acidicase Dehydrated Culture Media: Peptone | Fisher Scientific | L11843 | |
Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS) | Fisher Scientific | D16-3 | |
Fisher BioReagents Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
Auto Dry Cabinet | Shanghai Hasuc Instrument Manufacture Co.,LTD | HSFC160FD | |
1300 Series Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific | 1375 | |
0.5 mm Glass Beads | BioSpec Products | 11079105 | |
15 ml Conical Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
Hemacytometer | Fisher Scientific | # 0267110 | |
Leica Model DME Microscope | Leica | 13595XXX | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662-500 ml | |
1.5 ml tubes | Fisher Scientific | # 05-408-129 | |
BD Precisionglide syringe needles, gauge 27, L 1/2 in. | Sigma-Aldrich | Z192384 | |
Anti-mouse-Ly-6G antibody | BioXCell | BP0075-1 | Clone 1A8 |
Caspofungin diacetate | Sigma-Aldrich | SML0425 | |
Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 1169567762 | |
Non-Rebreathing Table Top Veterinary Anesthesia Machine | Supera Anesthesia Innovations | M3000 | |
Pureline Oxygen Concentrator | Supera Anesthesia Innovations | OC8000 | |
Slant Board Restraint | Indiana State University Facilities Management | Custom made | |
Gilson PIPETMAN Classic 200 ml Pipets | Fisher Scientific | F123601G | |
Pentobarbital Sodium (Fatal-Plus) | Vortech Pharmaceuticals | 0298-9373-68 | |
General-Purpose Broad-Tipped Forceps | Fisher Scientific | 10-300 | |
Fisherbrand Standard Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-951-20 | |
Fisherbrand General-Purpose Curved Forceps | Fisher Scientific | 10-275 | |
Ethyl Alcohol-200 Proof | PHARMCO-AAPER | 111000200 | |
Fisherbrand Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-63 | |
BD Precisionglide syringe needles, gauge 25, L 1 in. | Fisher Scientific | Z192406 | |
All-Plastic Norm-Ject Syringes | Fisher Scientific | 14-817-30 | |
IV CATH ANGIOCATH 22GX1GIN 50B | Fisher Scientific | NC9742754 | |
Formalin Solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | |
50 ml Conical Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
Thermo Scientific Shandon Embedding Cassettes II in Tube Packs | Fisher Scientific | B1000729 | |
Fisherfinest Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22-900-700 | |
Disposable Base Molds | Fisher Scientific | 22-363-554 | |
Reichert Jung Histocut 820 Microtome | Labequip.com | 31930 | |
Water Bath | Precision Scientific | 66630-23 | |
CO2 Incubator | Fisher Scientific | 116875H | |
Silver Stain (Modified GMS) Kit | Sigma-Aldrich | HT100A-1KT | |
Fast Green FCF | Fisher Scientific | AC410530250 | |
Frosted Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | |
Fisherfinest Superslip Cover Glass | Fisher Scientific | 12-545-89 | |
Cytoseal XYL | Fisher Scientific | 22-050-262 | |
Olympus Provis AX70 Microscope | Olympus | OLYMPUS-AX70 | |
U-PHOTO Universal Photo System | Olympus | OLYMPUS-U-PHOTO | |
U-MCB-2 MULTI CONTROL BOX | Olympus | OLYMPUS-U-MCB-2 | |
U-PS POWER SUPPLY UNIT | Olympus | OLYMPUS-U-PS | |
FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze Dry System | LABCONCO | 7740020 | |
Maxima C Plus Vacuum Pump | Fisher Scientific | 01-257-80 | Displacement- 6.1 cfm |
1-Butanol | Fisher Scientific | A383-4 | |
AMRESCO PHENOL-CHLORFORM-OSOAMYL 100ML DFS | Fisher Scientific | NC9573988 | |
Free-Standing Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | # 02-682-557 | |
Mini-Beadbeater-24 | BioSpec Products | 112011 | |
BioSpec ProductsSupplier Diversity Partner 2.3 MM ZIRCONIA BEADS | Fisher Scientific | NC0451999 | |
Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus | Fisher Scientific | A144S | |
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate | Fisher Scientific | S311 | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), White Powder, Electrophoresis | Fisher Scientific | BP166 | |
Chloroform/isoamyl alcohol 24:1 | Fisher Scientific | AC327155000 | |
Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer | Fisher Scientific | 11-120-570 | |
Thermo Scientific™ ABsolute Blue qPCR Mixes | Fisher Scientific | AB4137A | |
Hybridization Probe, 5′-FAM-AGCCAGCGGCCCGCAAATG-TAMRA-3′ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
Sense Amplification Primer, 5′-GGCCCTTAAATAGCCCGGT-3′ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
Antisense Amplification Primer, 5′-TGAGCCGATAGTCCCCCTAA-3′ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
Applied Biosystems™ MicroAmp™ Optical 8-Tube Strip, 0.2mL | Fisher Scientific | 43-165-67 | |
Thermo Scientific Domed and Flat PCR Cap Strips | Fisher Scientific | AB-0386 | |
Mx3005P QPCR System, 110 Volt | Agilent | 401443 | Stratagene is now owned by Agilent |
BALB/c mice | The Jackson Laboratory | 000651 | |
C57BL/6 (B6) mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
Eosinophil-deficient (ΔdblGATA, BALB/c background) mice | The Jackson Laboratory | 005653 | |
γδ T cell-deficient (TCRδ-/-, B6 background) mice | The Jackson Laboratory | 002120 | |
ImageJ Software | National Institutes of Health | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
Spot Advanced Software | Spot Imaging | SPOT53A | http://www.spotimaging.com/software/spot-advanced/ |
GraphPad Prism 6 | GraphPad Software | N/A | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
Fisherbrand Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
Step 4.5 | http://www.bdbiosciences.com/sg/resources/protocols/paraffin_sections.jsp ; http://www.jove.com/science-education/5039 ; http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/General_Information/1/ht100.pdf |