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Developmental Biology

牙龈三维炎症人体组织当量

doi: 10.3791/57157 Published: April 3, 2018

Summary

该协议的目标是建立一个炎症的人牙龈模型在体外。该组织模型共培养三种类型的人细胞, HaCaT 角质形成细胞, 牙龈成纤维细胞, THP-1 巨噬细胞, 在三维条件下。该模型可用于牙周疾病的研究, 如牙龈炎和牙周炎。

Abstract

牙周疾病 (如牙龈炎和牙周炎) 是成人牙齿丢失的主要原因。牙龈炎症是牙周疾病的基本生理病理。目前在各种类型的动物中建立了牙周疾病的实验模型。然而, 动物模型的生理病理与人类不同, 因此很难分析细胞和分子机制, 并对牙周疾病新药进行评价。在这里, 我们提出了一个详细的协议, 以重建牙龈炎症组织等值的龈 (iGTE)在体外。我们首先使用两种类型的人类细胞, 包括人牙龈成纤维细胞 (HGF) 和人表皮角质细胞 (HaCaT), 在三维条件下, 构建牙龈 (GTE) 的人体组织当量。我们创建一个伤口模型, 使用组织冲床打孔在 GTE。然后, 将人 THP-1 单核细胞与胶原凝胶混合, 注入 GTE 的孔内。通过 adimistration 10 佛波 12-酯 13-醋酸盐 (PMA) 为72小时, THP-1 细胞分化成巨细胞形成炎症灶在 GTE (iGTE) (iGTE 也可以 stumilated 与2µg/毫升脂多糖 (LPS) 48 h 启动炎症).IGTE 是第一个体外模型的炎症牙龈使用人类细胞与三维体系结构。IGTE 反映了牙周疾病的主要病理变化 (免疫 activition、fibryoblasts、上皮细胞、单核和巨噬细胞之间的细胞间相互作用)。GTE, 受伤的 GTE 和 iGTE 可作为多功能工具, 研究伤口愈合, 组织再生, 炎症, 细胞相互作用, 和屏幕潜在药物的牙周疾病。

Introduction

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牙周疾病是成人牙齿丢失的主要原因。牙龈炎和牙周炎是最常见的牙周疾病。牙龈中存在生物膜介导的急性或慢性炎症变化。牙龈炎的特点是急性炎症, 而牙周炎通常呈现为慢性炎症。在组织学层面上, 细菌成分会触发免疫细胞的活化, 如巨噬细胞、淋巴细胞、血浆细胞和桅杆单元1,2。这些免疫细胞, 特别是巨细胞, 与局部细胞 (包括牙龈上皮细胞、成纤维细胞、血管内皮和成骨细胞) 相互作用, 导致牙周组织的炎症性病变3,4。实验模型的牙周疾病已建立在各种类型的动物, 如大鼠, 仓鼠, 兔, 雪貂, 犬, 和灵长类动物。然而, 动物模型的生理病理与人类不同, 因此很难分析细胞和分子机制, 并评估牙周病的新药 5.利用牙周细菌和单层人口腔上皮细胞的共同培养, 研究了牙周感染的机制6。然而, 口腔细胞的单层培养缺乏完整组织的三维 (3D) 细胞结构;因此, 它们无法模拟体外情况。

在这里, 3D 炎症人的牙龈组织等效物 (iGTE) 是用来表示牙周疾病的在体外。这种3D 模型的牙周疾病在单层细胞培养和动物模型之间占据中间位置。三种类型的人类细胞, 包括 HaCaT 角质形成细胞, 牙龈成纤维细胞, 和 THP-1 巨噬细胞, 是由胶原凝胶共同培养, 并刺激炎症启动器, 以建立 iGTE。IGTE 严密模拟了牙龈中细胞分化、细胞相互作用和巨噬细胞活化的体内条件。该模型有许多可能的应用, 药物筛选和测试新的药理方法, 牙周疾病, 以及分析细胞和分子机制的伤口愈合, 炎症, 和组织再生。

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Protocol

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本协议旨在创建人牙龈组织当量, 牙龈伤口模型, 牙龈炎模型。人皮肤表皮角质细胞 (HaCaT) 是亲切提供的 Fusenig 教授 e. 德意志 Krebsforschungszentrum (德国海德堡)7。根据先前发布的协议8, 人牙龈成纤维细胞 (HGFs) 与牙龈组织分离。事先获得知情同意, 并根据道德委员会制定的指导方针, 东京牙科大学生活牙科学院 (授权号码: NDU-T2012-35) 批准了这项研究。协议步骤1–3应在单元格培养罩中执行。

1. 制备3D 人牙龈组织当量 (GTE) (图 1A)

  1. 混合胶原 i 型-一凝胶与10% 浓缩的内存α和10% 重建缓冲器 (2.2 克 NaHCO3和4.47 克 HEPES 100 毫升 0.05 N 氢氧化钠) 在15毫升不育管由吹打。将混合胶原蛋白溶液放在冰上, 直到使用。
  2. 安置24井文化插入物 (孔大小3.0 µm) 入24井板材。
  3. 使用0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液从培养基表面去除 HGFs。悬浮细胞在10毫升培养基 A (记忆α + 20% 血清 + 1% GlutaMAX)。通过 Bürker 细胞计数器计数单元格。
    1. 提取所需数量的细胞 (1-5 x105细胞/毫升), 然后离心机为4分钟在 190 x g。
    2. 在混合胶原溶液中悬浮细胞。把混合物放在冰上, 直到下一步。
  4. 将0.5 毫升的细胞胶原混合物 (0.5–2.5 x 105细胞/井) 添加到区域性插入, 而不产生任何气泡。在 5% CO2在37摄氏度的湿润气氛中孵化混合物, 以使混合物凝结成凝胶, 10–30。
    注: 将胶原蛋白混合物加入培养基的中心, 避免胶原凝胶的不均匀形成。
  5. 加入1毫升培养基到井中, 0.5 毫升插入。在湿润气氛中孵育24小时或一夜的培养板, 5% CO2在37摄氏度。
  6. 使用0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液从培养表面去除 HaCaT 细胞。将细胞悬浮在中等 B 的10毫升内 (DMEM + 10% 只血清 + 1% GlutaMAX) 并计数细胞。提取所需数量的细胞 (1–5 x 105细胞/毫升) 与吸管, 离心机为4分钟在 190 x g. 暂停中 B 中的单元格。
  7. 从培养物中移除培养基, 其中含有肝细胞生长因子胶原混合物, 由吸入。添加0.5 毫升的 HaCaT 细胞悬浮 (0.5–2.5 x 105细胞/井) 的顶部的 HGF-胶原蛋白混合物。培养24小时或一夜之间的文化。
    注: 在这个时间点, 培养基在文化中应该是中等的, 而培养基在培养基中插入应该是中等的 B。
  8. 用 KSR 培养基 (共培养培养基) 取代培养基 (GlutaMAX + 15% 剔除血清替代 + 1%) + 5%。增加1毫升培养基入文化井和0.5 毫升入文化插入物。培养的 24–48 h。
  9. 用 KSR 培养基 + 1% 的血清取代培养基。增加1毫升入文化井和0.5 毫升入文化插入物。培养24小时或一夜之间的文化。
  10. 用0.7–1毫升 KSR 培养基将培养基中的培养基替换好。从区域性插入中完全移除介质 (该培养基应暴露于空气中)。培养几个星期的文化。每星期两次在文化中改变培养基。
    注意: 不要让中等水平上升以上的文化表面 (顶层组成的角质细胞)。始终保持文化表面干燥。

2. 准备受伤的 GTE (图 1B)

  1. 准备一个1–3毫米直径的组织冲床。用高压釜消毒121摄氏度, 20 分钟。
  2. 将组织冲床垂直推入 GTE 约300µm 深, 并在组织中打孔以模拟伤口。
  3. 在这一步, 使用伤员 GTE 调查伤口愈合和组织再生。或者, 用10% 福尔马林中性缓冲液固定 GTE 进行组织学分析。

3. 炎症 GTE 的制备 (iGTE) (图 1B)

  1. 根据上一个报告9培养 THP-1 细胞。
  2. 混合胶原 i 型-一凝胶与10% 浓缩 RPMI 1640, 10% 重建缓冲器 (2.2 克 NaHCO3和 4.47 g HEPES 在100毫升 0.05 N 氢氧化钠) 和 10 ng/毫升。将混合胶原蛋白溶液放在冰上, 直到使用。
  3. 计算 106 THP-1 细胞和离心机4分钟 190 x g. 在混合胶原溶液的1毫升中悬浮细胞。把混合物放在冰上, 直到下一步。
  4. 将10–30µL THP-1-collagen 混合物添加到 GTE 受伤地区。将培养基替换为含有 10 0.7–1毫升的 KSR 培养基。
  5. 在 5% CO2在37摄氏度的湿润气氛中孵化混合物72小时。
  6. 使用模型来调查牙龈炎或牙周疾病 (例如, 添加潜在的抗炎药物 iGTE, 以观察其对细胞因子释放的影响10)。或者, 省略72小时的治疗, 加入2µg/毫升的 LPS 进入培养, 并孵化组织在一个湿润的气氛与 5% CO2在37摄氏度 48 h11,12

4. GTE 和 iGTE 文化的固定和全芒染色

  1. 文化的固定。
    1. 从24井板中取出培养基。用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 冲洗组织2次。
    2. 添加1毫升10% 福尔马林中性缓冲液到插入和1毫升的文化良好。把24井板放在冰箱里, 一夜4摄氏度。
    3. 第二天取出10% 福尔马林中性缓冲液。
    4. 对于整个染色, 固定后用 PBS 清洗组织3-4 次。
    5. 对于苏木精和伊红 (H & E) 染色和常规染色, 进行脱水, 石蜡嵌入和切片。
      注: 对于整个装载染色, 可以省略此步骤。
  2. 全芒染色
    注意: 此协议是从参考13中的一个修改的。
    1. 在 PBS 0.5–1% 10–30, 每一次清洗组织3x。
    2. 在室温下, 在阻塞缓冲液中孵化两次组织30分钟 (PBS 1% 海卫二 + 10% BSA)。
    3. 每2×在阻塞缓冲液中清洗组织, 5–10分钟。
    4. 添加50µL 的主要抗体溶液在所需的稀释/浓度的插入。使用薄塑料保鲜膜包装的插入物, 以避免干燥的组织。
    5. 在4摄氏度孵育组织1到2天。
    6. 清洗组织3次, 在 PBS 1% 海卫30分钟 + 10% BSA。再洗3次, 在 PBS 1% 海卫5分钟。
    7. 添加50µL 的二级抗体在阻塞缓冲 (PBS 1% 海卫两 + 10% BSA) 和5µL 的赫斯特33342解决方案 (NucBlue 活细胞染色) 每个插入。使用薄塑料保鲜膜包装的插入物, 以避免干燥的组织。
    8. 在4摄氏度孵育1到2天。将24井板裹在湿纸巾上, 然后放入塑料袋中, 用于整个孵化过程。
    9. 清洗组织3次, 在 PBS 1% 海卫10分钟
    10. 用锋利的针头切开培养物的膜以获得组织。将薄膜放到幻灯片上。
      注: 组织应在膜上。
    11. 添加2–3滴荧光贴装培养基。用盖玻璃覆盖组织, 在黑暗中贮存4摄氏度直到分析。
    12. 用共聚焦激光扫描显微镜 (LSM) 查看组织。

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Representative Results

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HaCaT 细胞在相对比显微镜观察下显示典型的角质形成形态 (图 2A)。扫描电镜 (SEM) 图像表明, HaCaT 细胞表面被许多微绒毛覆盖。HaCaT 细胞之间的细胞间连接由膜过程介导 (图 2B)。HaCaT 细胞表达牙龈上皮标记 K8/1814, 表明 HaCaT 细胞适合牙龈重建 (图 2C)。

图 3A显示了一个成功的 GTE 示例,图 3B显示了一个失败的 GTE 示例。不成功的试用版 (图 3B) 是由未添加到区域性插入中心的胶原凝胶混合物引起的。图 3C显示了 GTE 的伤口模型可以通过用组织打孔在组织中冲孔来制造。H & E 染色 (图 3D) 和 SEM 图像 (图 3E) 表明, 在19天的种植, 约10–20层的 HaCaT 细胞形成上皮, 胶原凝胶嵌入的肝细胞形成固有的叶片。在重建后的 GTE 的固有层中, 细胞生长因子表现出成纤维细胞的特征形态 (图 3F), 并被明确定义的胶原纤维阵列包围 (图 3G)。免疫荧光染色表明, 波形和 TE-7 (两者都是真皮成纤维细胞标记15) 表达在固有层的 GTE (图 4A4B)。K19, 一个特定标记的交界和口袋上皮在牙周炎16, 是弱表达在 GTE 上皮 (图 4C), 并强烈表达在上皮的 iGTE (图 4D)。这些数据表明, HaCaT 细胞可以分化为主要上皮细胞在牙周炎, 特别是在炎症刺激的固有层。

炎症性牙龈疾病, 如牙龈炎和牙周炎, 组织学特点是存在淋巴细胞和巨噬细胞, 并导致纤维化和组织坏死17,18。在本协议中, THP-1 细胞被用作 iGTE 的炎症细胞。如图 5中所示, 如果不进行 THP-1, 则会呈现单核细胞形态学, 其中大部分在介质中浮动(图 5A)。相比之下, 在72小时接触到 10 ng/毫升后, 超过50% 的 THP-1 细胞被分化成巨噬细胞样的单元格, 并附着在培养表面上 (图 5B)。类似于 HaCaT 和 HGF 细胞8, THP-1 细胞生长良好的胶原凝胶在共培养培养基 (KSR 培养基), 并分化成巨噬细胞样, 在治疗后 (图 5C)。染色表明, 粘附 THP-1 细胞表达 CD68 (巨噬细胞19的标记) (图 5D) 和 CD14 (巨噬细胞的另一个标记) (图 6)。为了形成 iGTE, THP-1 单核细胞嵌入胶原凝胶中, 并注入到模拟伤口的孔中 (图 5E)。在72小时后 (10 ng/毫升)-刺激, THP-1 细胞分化成巨细胞 (图 5F) 内的孔模拟伤口和表达 CD68 (图 5G), 表明他们能够形成炎症灶在受伤的 GTE。

整个装入免疫组化 (图 6) 表明, 模拟伤口的 THP-1 细胞不仅表达了 CD14 (巨噬细胞的另一种标记), 而且还表达了波形以及孔边缘的纤维细胞。波形由活性巨噬细胞20表示。数据证实 THP-1 巨噬细胞是功能性的。

Figure 1
图 1: 实验设计.3D 人体组织的牙龈 (GTE) (A) 和炎症性 GTE (iGTE) (B) 的实验性设置。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: HaCaT 角质形成细胞的特性.(A) 在文化中 HaCaT 细胞的相对比显微图像。缩放条 = 50 µm (B) HaCaT 细胞的 SEM 图像。(C) 牙龈上皮细胞标记 K8/18 的 HaCaT 细胞免疫组化染色。格林, K8/18。蓝色, DAPI。缩放条 = 10 µm.请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 3D 人体牙龈组织当量 (GTE) 的特性.(A) 在文化中成功 GTE 的示例。组织在文化插入的中间。(B) 失败 GTE 的示例: GTE 的一部分与组织分离, 并偏向于墙壁 (红色箭头)。(C) 受伤的 GTE: 黄色箭头表示由组织冲床打的孔。(D) H & E 染色 GTE 培养19天 (14 天的空气暴露)。缩放条 = 50 µm (E) 19 天栽培的垂直剖面的 SEM 图像。(F) 胶原凝胶中生长因子细胞的相对比显微图像, 形成 GTE 的固有层。缩放条 = 25 µm. (G) GTE 的固有层中细胞生长因子周围的大胶原纤维的扫描电镜图像。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: GTE 中的波形、TE-7 和 K19 的表达式.GTE 的免疫荧光染色波形 (AB) 和 TE-7 (B) 在 GTE 中, 表皮标记 K19 GTE (C) 和 iGTE (D)。红色, 波形和 K19。格林, TE-7。蓝色, DAPI。E、表皮;LP, 固有的叶片。缩放条 = 50 µm (ACD)、20µm (B)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5: THP-1 单元格的特性.(A) 文化中未分化的 THP-1 细胞。缩放条 = 15 µm (B) 区分 THP-1 巨噬细胞。缩放条 = 15 µm. (C) THP-1 细胞嵌入 KSR 培养基中的胶原凝胶中, 并以 24 h. 鳞片棒 = 50 µm 的方法治疗. (D) 巨噬细胞标记 THP-1 巨噬细胞的免疫组化染色。瑞德, CD68蓝色, DAPI。刻度条 = 5 µm (E) THP-1-collagen 混合在 HGE 的受伤孔中。刻度条 = 25 µm (F) THP-1 细胞在治疗后72小时被分化成巨细胞 (红色箭头)。缩放条 = 25 µm (G) THP-1 细胞表达的巨细胞标记 CD68。黄色虚线表示 H & e 刻度条中受伤孔的面积 = 100 µm 红色, CD68。蓝色, 赫斯特33342。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6: iGTE 的特性.CD14 (绿色) 和波形 (红) 的全组免疫组织化学在 iGTE 上进行。通过 iGTE 捕获的 Z 系列图像 (C) (总计为416µm。面板1是 LSM 扫描的第一部分, 面板25是最后一个。间隔约为16.64 µm 节之间)。代表部分 (A) (z 系列图像的17号)、正射影像和 3D z 堆栈图像(B) 显示了在 iGTE 中模拟伤口的孔中 CD14 和波形阳性 THP-1 巨噬细胞的3D 分布。LSM 在 iGTE 中的扫描位置在 (D) 和左上角 (A) 中指示。刻度条 = 50 µm. 黄色虚线表示 iGTE 受伤洞的面积。请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

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该协议是基于创建牙龈组织当量和皮下脂肪组织等价的方法, 以前的报告中描述的8,21,22。虽然这是一个简单而简单的方法, 但有些步骤需要特别注意。例如, 胶原混合物应保持在冰上, 直到使用, 以避免凝胶形成的解决方案。当将胶原蛋白混合物添加到区域性插入中时, 请确保将该溶液注入插入中心, 以避免形成有偏见的凝胶 (如图 3B)。在 GTE 打一个洞也需要技巧。如果组织太湿, 组织打孔机有时无法拾取组织。组织活检系统或对钳将有帮助;然而, 受伤地点的尺寸会有很大的改变。也可以使用尖针注射器注射 THP-1 细胞胶原蛋白混合物而不打孔 (确保凝胶不会堵塞针头)。

这种方法的局限性在于它无法完美地代表牙龈炎和牙周炎的复杂生物学现象, 因为 iGTE 缺乏血管、神经细胞和其他免疫细胞, 炎症不是由宿主-生物膜相互作用。然而, 它是唯一的体外牙龈炎组织模型的人类细胞, 部分呈现炎症牙龈的病理。该模型可以修改为更类似于真正的牙龈炎和牙周病 1) 共同培养 GTE 与生物膜, 以创建宿主-生物膜相互作用或刺激炎症反应的 iGTE 使用 LPS (在外层膜的化合物革兰阴性菌和强烈炎症引发剂正如我们在协议中建议的那样), 2) 在提取的牙齿上播种胶原-HGF 溶液, 形成牙龈-牙齿复合体, 观察牙龈炎症如何影响硬组织, 以及 3) 使用人牙龈上皮细胞形成 GTE 和 iGTE 的表皮。

在这里提出的方法, GTE 和 iGTE 文化可以作为多功能的工具来研究伤口愈合, 组织再生, 炎症, 细胞相互作用, 并筛查潜在的药物牙龈炎和牙周病。

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Disclosures

作者声明没有利益冲突。

Acknowledgments

这项工作得到了日本促进科学促进会 (26861689 和 17K11813) 资助的部分支持。作者感谢纳撒尼尔. 格林先生校对。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagen type I-A Nitta Gelatin Inc For making dermis of GTE
MEM-alpha Thermo Fisher Scientific 11900073 Cell culture medium
Cell Culture Insert (for 24-well plate), pore size 3.0 μm Corning, Inc. 353096 For tissue culture
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061 Cell culture reagent
DMEM Thermo Fisher Scientific 31600034 Cell culture medium
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828028 Cell culture reagent
Tissue puncher Shibata system service co., LTD SP-703 For punching holes in GTE
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific 31800022 Cell culture medium
BSA Sigma-Aldrich A3294 For immunostaining
Hoechst 33342 (NucBlue Live Cell stain) Thermo Fisher Scientific R37605 For labeling nuclei
Fluorescence mount medium Dako For mounting samples after immunostaining
Anti-Cytokeratin 8+18 antibody [5D3] abcam ab17139 For identifying epithelium
Scaning electron microscope Hitachi, Ltd. HITACHI S-4000 For observing samples' surface topography and composition
Confocal laser scanning microscopy LSM 700; Carl Zeiss Microscopy Co., Ltd. LSM 700 For observing samples' immunofluorescence staining
Anti-Cytokeratin 19 antibody abcam ab52625 For identifying epithelium
Anti-vimentin antibody abcam ab92547 For identifying fibroblasts and activated macrophages
Anti-TE-7 antibody Millipore CBL271 For identifying fibroblasts in the dermis
Anti-CD68 antibody Sigma-Aldrich SAB2700244 For identifying macrophages
Human CD14 Antibody R&D Systems MAB3832-SP For identifying macrophages
Alexa Fluor 594-conjugated secondary goat anti-rabbit antibody Thermo Fisher Scientific A11012 For immunofluorescence staining
Alexa Fluor 488-conjugated secondary goat anti-mouse antibody Thermo Fisher Scientific A11001 For immunofluorescence staining
EVOS FL Cell Imaging System Thermo Fisher Scientific For observing the sample's immunofluorescence staining
THP-1 cells Riken BRC cell bank RCB1189 For making iGTE
PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate) Sigma-Aldrich P8139 For differentiatting THP-1 cells

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References

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Xiao, L., Okamura, H., Kumazawa, Y. Three-dimensional Inflammatory Human Tissue Equivalents of Gingiva. J. Vis. Exp. (134), e57157, doi:10.3791/57157 (2018).More

Xiao, L., Okamura, H., Kumazawa, Y. Three-dimensional Inflammatory Human Tissue Equivalents of Gingiva. J. Vis. Exp. (134), e57157, doi:10.3791/57157 (2018).

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