Summary
Вводится метод сальниковый трансплантации островков в мышь. Изолированные островки смешиваются с гидрогеля и смесь помещается в Сальниковая сумка диабетической мыши. Затем контроль уровня глюкозы в крови, и иммуно гистохимический анализ выполняется.
Abstract
Трансплантация островковых было предложено быть потенциальным лечения диабета 1 типа. Последние убедительных доказательств указывает, что настой внутрисосудистого островок далека от идеала и таким образом, вновь становится потенциально ценный сайт для трансплантации островковых сальника. Этот эксперимент требует изоляции островков высокого качества и имплантации островков диабетической получателям. Трансплантации сальника требует хирургического шаги, которые могут быть лучше визуально. Здесь представлены подробные шаги для выполнения этой процедуры. Здесь описываются два способа перемешивания изолированных островков с гидрогеля перед укладкой смеси в Сальниковая сумка диабетических мышей. Различные гидрогели, используются для различных условий. Уровень глюкозы в крови получателей диабетической мышь сингенных островков в сальника наблюдали до 35 дней. Некоторые животные были принесены в жертву после 14 дней для выполнения иммуно гистохимический анализ. Этот подход доклинические трансплантация может использоваться как предварительные данные, ведущих к перевод клинических трансплантации.
Introduction
По данным Международной Федерации диабета (МФД), сахарный диабет в настоящее время затрагивает 382 млн человек, с прогнозируемым увеличением до 592 миллионов человек к 2035 году1. В обоих трансплантации аллогенных и культивированная островок необходим системный иммуносупрессивной терапии. Без иммуносупрессии иммунных отказ является одной из основных причин потери трансплантата2. Существует также серьезной проблемой трансплантированных островковых потери из-за мгновенного крови опосредованной воспалительной реакции (IBMIR)3,4. Однако даже в отсутствие иммунного ответа как сингенных или модели Авто трансплантации островковых клеток, пересаженные в печени через воротной вены теряются из-за воспаления и/или неблагоприятных условий окружающей среды, таких как плохой крови Поставка с сокращением оксигенации и/или питательных веществ5,6. В результате для того чтобы обеспечить долгосрочный метаболические функции, выше островок чисел необходимо компенсировать потерю первоначальных клеток, что уменьшает приживления7.
В попытке оптимизировать приживления островок несколько альтернативных анатомические сайты экспериментально исследованы, а также клинически, с перспективными, но не окончательные результаты8. В то время как некоторые из альтернативных сайтов предлагают легкий и безопасный доступ (например., спазмолитическое, капсула почек, желудка подслизистой и передней камере глаза) или широкой поверхности для больших масс островок (например., брюшной полости), выживания и физиологическое метаболические производительность пересаженные островки по-прежнему ограничены и остаются озабоченность9. Поиск более подходящего места для приживления островок продолжается.
Сальника был среди многих анатомические сайтов, которые были расследованы в раннем развитии трансплантации островковых и оказалась успешной среды для островков10,11,12,13, 14. Однако в части intraportal островок настой стал клинических выбор надлежащего относительной простоте процедуры и ранний успех в животных моделей6. Кроме того, в части, негативы связанных с этим сайтом, особенно ранних островок гибели, были менее понятны и меньше сдерживающих в первые дни экспериментальной островок пересадке как поле созрел. С более поздних убедительных доказательств того, что свидетельствует внутрисосудистого островок настой далеко от идеала, сальника возрождается как потенциально ценный сайт для трансплантации клеток.
Сальника (в виде Сальниковая сумка) предлагает относительные преимущества над печени15,16. Это хорошо васкуляризированной и легко доступны. Это позволяет извлечения трансплантата (если необходимо) и/или биопсия. Периода ишемического, испытываемых островки уменьшается по сравнению с печенью, и сальника может принять относительно большой островок массы, которые не возможно intraportally, где подъем портала давления может привести к осложнениям.
В протоколе испытания в исследовании, используя самцов мышей C57BL/6 между 6-8 недель с массой тела 20 – 25 г. островок получателей были оказаны Диабетическая с одной инъекции Стрептозотоцин с дозой 250 использовалась модель мышь сингенных трансплантации мг/кг ip. Индукции диабета можно считать успешным, если уровень глюкозы в крови мыши больше чем 24 ммоль/Л 48 ч после инъекции и остается выше этого уровня для не менее 5 дней.
Сингенных островков были изолированы от поджелудочной железы соответствует возрасту доноров, после ранее опубликованных методов с некоторыми изменениями. Короче говоря коллагеназа вводили желчного пузыря вместо желчных протоков. Это было сделано как улучшение для облегчения легкость инъекции. Настой коллагеназы был следуют инкубации, разрушение тканей, градиент плотности разделения и рука собирание для получения чистого островков. Островки были культивированный на ночь в среде CMRL-1066, дополнена 10% тепло инактивированная плода бычьим сывороточным (ФБС) в T175 колбы при 37 ° C, до 95% воздуха - 5% CO2 до пересадки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все мыши, используемые в данном исследовании были получены от животных медицинский центр Гуандун провинции. Использование животных был одобрен этики обзора Комитет из Шэньчжэнь второй народный госпиталь, в соответствии с принципами защиты животных.
1. островок пересадке для сальника
Примечание: Этот протокол требует 2 человек для выполнения.
- Соберите хирургические материалы, которые перечислены в таблице 1. Подготовить асептических поле в хирургические области с стерильных материалов, таких как шторы и расходных материалов и поддержание асептических условий в хирургии. Стерилизуйте всех хирургических инструментов. Носите халаты стерильные.
- Выберите с помощью кончика пипетки 200 мкл под стереомикроскопом островков. Каждая мышь будет получать 450 – 500 островок эквивалент (IEQ), в tansplant. Для каждого животного место достаточно островков для одного трансплантации в стерильных 1,5 мл трубку оснастки Топ с 100 мкл CMRL-1066 среды.
Примечание: Островков могут быть изолированы в день трансплантации, но это лучше изолировать их за день до восстановления для изоляции процесса. - Держите оснастки верхней трубы с островками на льду до готовности к пересадке.
- Оттепель гидрогеля матрица базальной мембраны и держать его на льду после его удаления из морозильной камеры-20 ° С. Гидрогель жидким при температуре 4 ° C до 10 ° C и затвердевает при более высоких температурах.
- Весят и помечать все Диабетическая получателей мышей. Придать Пентобарбитал натрия 60 мг/кг внутрибрюшинно. Тест глубины анестезии управляющими щепотку мыс. Дать дополнительные 10 мг/кг Пентобарбитал натрия, если животное реагирует на крайнем случае. Если не снять рефлекс, уровень анестезии является правильным для хирургии.
- Тампоном хирургической сайта на животе с помощью 70% этиловом спирте. Бритье волос из сайта с razer лезвием и дезинфицировать области с йодофора. Применять мазь ветеринар глаза, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
- Используйте ножницы офтальмологические открыть живот вдоль средней линии живота с надрезанными 4-5 см. шаг кишечника с левой стороны и крышка с физиологическим пропитанной марлю, чтобы предотвратить чрезмерное обезвоживание во время процедуры по хирургии.
- Используйте ватные тампоны для полностью разоблачить зрительного поля желудка и найдите сальника (находится ниже желудка). Используйте две пары тонкой щипцов для раздуваться сальника. Позаботьтесь, чтобы предотвратить повреждения от разрывов.
- На данный момент полностью разморожен гидрогеля. Спина трубку с островков для 30 s 200 x g и удалить супернатант. Аспирационная 50 мкл гидрогеля, добавить его в пробирку, содержащую островки и Ресуспензируйте смесь осторожно, избегая образования пузырьков. Держите трубы на льду во время процедуры.
- Используйте две пары щипцов подобрать кромки сальника и аккуратно поднимите его сформировать паз между стенки желудка и кишечника, которые можно разместить небольшой объем жидкости с островка трансплантата.
- Пусть второй человек помощь в процедуре и аспирационная ресуспензированы Иле гидрогеля смеси (все содержимое трубки) с кончиком пипетки 200 мкл, доставить содержимое в паз.
- Убедитесь, что смесь хорошо позиционируется в паз, нежно повышение или понижение по краям сальника. Полная позиционирования смеси в течение 3 мин до гидрогеля затвердевает как эффект температуры тела. После того, как Гидрогель множеств, сложите сальника для покрытия трансплантата.
Примечание: сальника будет придерживаться окружающие желудка стены как Гидрогель затвердевает. - После гидрогеля полностью затвердевает, используйте ватные тампоны для перемещения кишечника обратно в брюшной полости, стараясь не коснуться сайте трансплантации.
- 20 мкл цефалоспоринов (5 ~ 10 мг) в брюшную полость для предотвращения инфекции, затем использовать 4-0 шовный материал для закрытия брюшной полости.
- Вернуть его клетки мыши и повторите все шаги для каждой мыши получателя. Согревались мышей и визуально контролировать до тех пор, пока они полностью восстановить достаточно сознания для поддержания грудной recumbency. Храните отдельно от других животных мышей до тех пор, пока они полностью выздоровел.
- Придать 50 мкл Цефазолин натрия (0,05 мг/мл) каждый день в течение недели как профилактика послеоперационных. Администрирование Bupivicaine + бупренорфина, т.е. применять 1-3 капли 0,25% Bupivicaine на сайте разрез местно до размещения рану клипов. Администрирование Buprenorphine(0.03 mg/ml with sterile 0.9% saline, 0.05-0.10 mg/kg) через внутрибрюшинного маршрут (IP).
- Измерить пост-уровень глюкозы в крови из вен хвост крови с помощью измерителя глюкозы крови один раз в день после пересадки. При пересадке для сальника, островок трансплантата может иметь функцию задержки и не достигают уровня глюкозы в крови вполне нормальная для 2-3 недели.
- Для гистологии удалите сальниковый трансплантата из мыши в конце эксперимента после трансплантации. Исправьте ткани по данным гистологических протоколы. Трансплантат могут быть проанализированы для иммуноокрашивания или иммунофлюоресценции исследований.
2. альтернативный метод для трансплантации для сальника
Примечание: Альтернативные фибрин тромбиновое гидрогеля, который используется при комнатной температуре может быть заменен для матрицы гидрогеля базальной мембраны. Он состоит из 2 компонентов, фибринового герметика белка решение (50 ед/мл тромбина и фибриногена 10 мг/мл). Когда компоненты смешиваются, они образуют сгусток, хранящий островки на месте.
- Используйте фибрин thombin гидрогеля соединения при комнатной температуре. Как шаг 1.2 каждая мышь будет получать 450 – 500 островок эквиваленты (IEQ) за пересадки. Место островки в стерильных 1,5 мл трубки оснастки Топ с 100 мкл CMRL-1066 среды. Сразу же до трансплантации, аспирационная островки в стерильные PE50 трубка длиной 10 см и осторожно центрифуги (30 s на 200 x g) сформировать сыпучих гранул.
- Подготовьте животное, как указано выше (шаги 1,5-1,8) с сальника, разложить. Смешать компоненты гидрогеля (10 мкл/каждый) и место на сальника. (Рис. 3D)
- Немедленно изгнать островков из труб на Гидрогель. Гидрогель образует сгусток вокруг островках. (Рисунок 3E)
- Сложите сальника над гидрогеля и островков сформировать чехле. (Рисунок 3F) Продолжите выполнение шагов 1.13-1.18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
POST-DIGESTIVE Состояние поджелудочной железы показана на рисунке 1A. Очищенный островков показаны на рисунке 1B. Дитизон окрашивание и жизнеспособности тестирование островки показаны на рисунке 2. На рисунке 3показаны основные этапы трансплантации островковых для сальника. Уровень глюкозы в крови получателей после пересадки сальниковый показаны на рисунке 4. Гистологический анализ имплантатов показано на рисунке 5.
Рисунок 1 : Поджелудочной железы пищеварение и островок изоляции. (A) после переваривания поджелудочная железа. Обратите внимание на песке размера частиц в суспензии. (B) световой микроскопии изображение островков после изоляции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Островок Дитизон окрашивание и флуоресценции жизнеспособности красителей. (A) островков в красном запятнана дитизона. (B) световой микроскопии. (C) пропидий йодидом флуоресценции красного окрашивания (мертвые клетки). (D) Флуорексон-ам зеленое окрашивание (жизнеспособных клеток). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Трансплантация в сальника. (A) после получателей лапаротомическими, подвергается желудка и сальника расположен. Островков (B) смешиваются в гидрогеля и медленно помещаются сальниковый ткани. (C) островок прививка на увеличение. Гидрогель-полу затвердевших государство. (D) альтернативный метод. Гидрогель помещается на сальника без островки. (E) островков помещаются поверх гидрогеля. (F) сальника складывается вокруг островках. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : После трансплантат уровни глюкозы крови. Non пост уровень глюкозы в крови получателей (n = 7) до 35 дней после пересадки. Трансплантат получателей не все получили той же партии островки так есть различия в качество и функции, что приводит к резким колебаниям уровня глюкозы в крови.
Рисунок 5 : Гистология. Трансплантат секции (прививка поиска через 14 дней после пересадки) окрашивали DAPI (ядер), антитела анти мыши инсулина и гематоксилином. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Островок пересадке печени через воротной вены является наиболее часто используемый метод трансплантации островковых в организме человека, но есть еще проблемы эффективности и безопасности, такие как стеатоз печени и тромбоз воротной вены17. Недавние исследования показывают, что сальника может быть подходящей альтернативой для печени, но больше исследования необходимо проводиться до клинических перевод12,14,18,19.
Мышь является подходящей моделью для тестирования сальника как сайт для трансплантации островковых. В мыши сальника расположен под стенки желудка и обычно складывается. Однако размер сальника мышей малых и сложным для доступа. Для того, чтобы использовать его для трансплантации, необходимо осторожно разложил его до полного размера, затем перегните его и после сдачи на хранение островков/Гидрогель микс. В более крупных животных сальниковая ткани является более обширным и может быть зашивается построить один или несколько Чехлы, в которые зачисляются островки. Сальника мыши хрупкие и не легко согласиться швов без ломки. По этой причине гидрогеля используется чтобы мешочек без швов.
В первом методе (шаги 1.1 – 1.18) гидрогеля используется матрица базальной мембраны и состоит из Ламинин, коллаген IV и факторов роста. Он затвердевает, как она нагревается до температуры тела. Во втором методе (шаги 2.1 – 2.4) различные гидрогеля используется состоящий из тромбина 50У/мл и 10 мг/мл фибриногена. Два разных гидрогели используются чтобы показать универсальность этой техники. Это может быть приспособлены с учетом многих обстоятельств и для доказательства принципа. Для клинического применения, зашивается мешочек используется ли или клинические класса гидрогеля, техника комбинируется с минимально инвазивной подход, (например., Эндоскопический метод доставки сальника). Для этой цели необходимы дополнительные исследования с использованием более крупных млекопитающих доклинических моделей.
Время нормализовать уровень глюкозы в крови в мыши получателей после трансплантации в сальника в нашей, а также другие исследования показывают, что островки в сальника требуют немного больше времени для достижения достаточного производства инсулина. Реваскуляризации эффективности, как представляется, является одним из важных факторов, как указано в исследовании. Является ли наличие гидрогеля влияет на скорость островок реваскуляризации и производительности, что еще предстоит определить.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы сообщают не коллизии интересов.
Acknowledgments
Некоторые из авторов этой работы были поддержаны в части субсидий из национального ключ R & D программы Китая (2017YFC1103704), проект Саньмин медицины в Шэньчжэнь (SZSM201412020), фонд для высокого уровня медицинской дисциплины строительство Шэньчжэнь (2016031638), Шэньчжэнь фонд науки и техники (JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425110110658), Shenzhen фонд здравоохранения и планирования семьи Комиссии (SZXJ2017021).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 5 inch (12-13 cm) Scissors | RWD Life Science | S12030-11 | |
| Fine Forceps | RWD Life Science | F11010-13 | |
| Small wound clips | RWD Life Science | R33003-01 | |
| Acutenaculum | RWD Life Science | F31044-13 | |
| 2 pair tissue forceps | RWD Life Science | F13023-10 | |
| 4-0 Suture with needle | Chenghe, China | 17094 | |
| 200 μL Pipette and tips | Gilson | PN11 | |
| One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system | Johnson & Johnson | 33391713 | |
| razor blade | Philips | HC1099/15 | |
| Material and animals | |||
| Pentobarbital Sodium | Sigmaaldrich.com | P3761 | For anesthesia |
| Hydrogel | bdbiosciences.com | 356234 | Basement Membrane Matrix |
| Fibrin-Thrombin Hydrogel | Baxter.com | 1501250 | Components clot when mixed |
| 70% Ethanol | Yingniu medical, Anhui, China | 23170608 | |
| Iodophor | Lierkang medical technology, Shangdong, China | 170521 | |
| Normal saline | Baxter.com | 2B1324 | |
| Cephalosporin | Lukang medical, Shangdong, China | 150303 | |
| Cefazolin | Baxter.com | 2G3508 | |
| lubricant eye ointment | Major Pharmaceuticals | 203964 | |
| streptozotocin | Sigmaaldrich.com | S0130 | |
| collagenase Type V | Sigmaaldrich.com | C9262 | |
| CMRL-1066 media | celltrans, Wenzhou, China | X018D1 | |
| histopaque | Sigmaaldrich.com | 10771 | density gradient |
| PE50 tubing | Braintreesci.com | PE50 100 FT | Polyethylene .023" x .038 |
| Calcein AM | Sigmaaldrich.com | C1359 | |
| Propidium iodide | Sigmaaldrich.com | P4864 | |
| optimal cutting temperature compound (OCT) | Tissue-Tek; Miles, Naperville, IL | 4583 | embedding medium |
| insulin antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 | 8138S | |
| hematoxylin staining media | Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 | 14166S | |
| eosin staining media | Beyotime Biotech, China | C0109 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific Inc. | D1306 | |
| C57Bl/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province | / | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| T175 flasks | Falcon | 353112 | |
| 1.5 mL Snap-top tubes | Axygen | MCT-150-C |
References
- Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes research and clinical practice. 103 (2), 137-149 (2014).
- Bellin, M. D., et al. Potent Induction Immunotherapy Promotes Long-Term Insulin Independence After Islet Transplantation in Type 1 Diabetes. American Journal of Transplantation. 12 (6), 1576-1583 (2012).
- Moberg, L., et al. Production of tissue factor by pancreatic islet cells as a trigger of detrimental thrombotic reactions in clinical islet transplantation. The lancet. 360 (9350), 2039-2045 (2002).
- Nilsson, B., Ekdahl, K. N., Korsgren, O. Control of instant blood-mediated inflammatory reaction to improve islets of Langerhans engraftment. Current Opinion in Organ Transplantation. 16 (6), 620-626 (2011).
- Bellin, M. D., et al. Similar islet function in islet allotransplant and autotransplant recipients, despite lower islet mass in autotransplants. Transplantation. 91 (3), 367-372 (2011).
- Bruni, A., Gala-Lopez, B., Pepper, A. R., Abualhassan, N. S., Shapiro, A. J. Islet cell transplantation for the treatment of type 1 diabetes: recent advances and future challenges. Diabetes, metabolic syndrome and obesity: targets and therapy. 7, 211 (2014).
- Shapiro, A. J., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nature reviews Endocrinology. 13 (5), 268-277 (2017).
- Cantarelli, E., Piemonti, L. Alternative transplantation sites for pancreatic islet grafts. Current diabetes reports. 11 (5), 364 (2011).
- Cantarelli, E., et al. Murine animal models for preclinical islet transplantation: no model fits all (research purposes). Islets. 5 (2), 79-86 (2013).
- Beli, E., et al. Erratum to: CX3CR1 deficiency accelerates the development of retinopathy in a rodent model of type 1 diabetes. J Mol Med (Berl). 95 (5), 565-566 (2017).
- Hafner, J., et al. Regional Patterns of Retinal Oxygen Saturation and Microvascular Hemodynamic Parameters Preceding Retinopathy in Patients With Type II Diabetes. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (12), 5541-5547 (2017).
- Schmidt, C. Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum. Nature Biotechnology. 35 (1), 82017 (2017).
- Voigt, M., et al. Prevalence and Progression Rate of Diabetic Retinopathy in Type 2 Diabetes Patients in Correlation with the Duration of Diabetes. Exp Clin Endocrinol Diabetes. , (2017).
- Baidal, D. A., et al. Bioengineering of an Intraabdominal Endocrine Pancreas. New England Journal of Medicine. 376 (19), 1887-1889 (2017).
- Espes, D., et al. Rapid restoration of vascularity and oxygenation in mouse and human islets transplanted to omentum may contribute to their superior function compared to intraportally transplanted islets. American Journal of Transplantation. , (2016).
- Berman, D. M., et al. Bioengineering the endocrine pancreas: intraomental islet transplantation within a biologic resorbable scaffold. Diabetes. 65 (5), 1350-1361 (2016).
- Delaune, V., Berney, T., Lacotte, S., Toso, C. Intraportal islet transplantation: the impact of the liver micro-environment. Transplant International. 30 (3), 227-238 (2017).
- Espes, D., et al. Rapid restoration of vascularity and oxygenation in mouse and human islets transplanted to omentum may contribute to their superior function compared to intraportally transplanted islets. American Journal of Transplantation. 16 (11), 3246-3254 (2016).
- Hajizadeh-Saffar, E., et al. Inducible VEGF expression by human embryonic stem cell-derived mesenchymal stromal cells reduces the minimal islet mass required to reverse diabetes. Scientific Reports. 5, (2015).
