Summary
En metode til omental transplantation af Holme i en mus er indført. De isolerede øer er blandet med hydrogel og blandingen er placeret i den omental pose af en diabetisk mus. Derefter blodglucose overvåges, og immuno-histokemiske analyse udføres.
Abstract
Holmen transplantation er blevet foreslået til at være en potentiel behandling af type 1 diabetes. Seneste overbevisende beviser indikerer, intravaskulær islet infusion er langtfra ideel, og derfor, omentum er re fremvækst som en potentielt værdifulde site for Holmen transplantation. Dette eksperiment kræver isolering af høj kvalitet Holme og implantation af Holme til diabetisk modtagerne. Transplantation til omentum kræver kirurgisk trin, der bedre kan påvises visuelt. Her præsenteres de detaljerede trin til denne procedure. To metoder for at blande de isolerede øer med hydrogel før du placerer blandingen ind i diabetisk mus omental posen er beskrevet her. Forskellige hydrogels anvendes til de forskellige forhold. Blodsukkerniveauer for diabetisk mus modtagere af syngeneic Holme i omentum blev overvåget i op til 35 dage. Nogle dyr blev ofret efter 14 dage til at udføre immuno-histokemiske analyse. Denne præ-klinisk transplantation tilgang kan bruges som foreløbige data fører op til oversættelse af kliniske transplantation.
Introduction
Ifølge internationale Diabetes Føderation (IDF), påvirker diabetes mellitus i øjeblikket 382 millioner mennesker, med en forventet stigning til 592 millioner mennesker af 20351. I både allogene og xenogene islet transplantation er systemisk immunsupprimerende behandling nødvendig. Uden immunosuppression er immun afvisning en væsentlig årsag til graft tab2. Der er også et væsentligt problem af transplanterede islet tab på grund af instant blod medieret inflammatorisk reaktion (IBMIR)3,4. Men selv i mangel af en immunrespons, som i syngeneic eller auto-transplantation modeller, Holmen celler transplanteret ind i leveren via portalen vene er tabt på grund af betændelse og/eller ugunstige miljøforhold, som fattige blod forsyning med nedsat iltning og/eller næringsstoffer5,6. Som et resultat, for at sikre langsigtet metabolisk funktion, er højere islet numre nødvendige for at kompensere for den indledende celletab, der reducerer engraftment7.
I et forsøg på at optimere islet engraftment, flere alternative anatomiske steder har været undersøges eksperimentelt såvel som klinisk, med lovende, men ikke endelige resultater8. Der henviser til, at nogle af de alternative produktionssteder tilbyder nem og sikker adgang (fx., huden, nyrerne kapsel, gastrisk submucosa og forreste kammer i øjet) eller en større overflade for større islet masserne (fx., bughulen), overlevelse og fysiologisk metaboliske præstationer af transplanterede holmene er stadig begrænset og fortsat en bekymring9. Søgning efter et mere passende sted for Holmen engraftment er igangværende.
Omentum var blandt de mange anatomiske steder, der blev undersøgt i den tidlige udvikling af holmen transplantation, og viste sig at være et vellykket miljø for Holme10,11,12,13, 14. Dog intraportal Holmen infusion blev kliniske valg due delvis til den relative enkelhed af proceduren og tidlige succes i dyre modeller6. Også, en del negativer forbundet med dette site, især massive tidlig islet tab, var mindre forståelige og mindre begrænsning i de tidlige dage af eksperimentelle islet transplantation som feltet modnet. Med nyere overbevisende tegn på, at intravaskulær islet infusion er langt fra ideel, omentum er re fremvækst som en potentielt værdifulde site for celle transplantation.
Omentum (i form af en omental pose) tilbyder relative fordele over leveren15,16. Det er godt vaskulariserede og let tilgængeligt. Det giver mulighed for hentning af transplantat (hvis nødvendigt) og/eller biopsi. Den iskæmiske periode oplevet af holmene er reduceret i forhold til leveren, og omentum kan acceptere forholdsvis store islet masserne, der ikke er muligt intraportally, hvor en stigning i portalen pres kan forårsage komplikationer.
En syngeneic musemodel af transplantation blev brugt i den protokol, der er testet i undersøgelsen, beskæftiger C57BL/6 mandlige mus mellem 6 – 8 uger gamle med en vægt på 20-25 g. Islet modtagere blev gjort diabetisk med en enkelt injektion af streptozotocin med en dosis på 250 mg/kg ip. Induktion af diabetes kan betragtes som vellykket, hvis blod glukose niveau af musen er større end 24 mmol/L 48 timer efter injektion og forbliver finansieringsrammer for mindst 5 dage.
Syngeneic Holme blev isoleret fra bugspytkirtlen af alder-matchede donorer efter tidligere udgivne metoder med nogle ændringer. Kort sagt, var collagenase injiceres galdeblære i stedet for galdegang. Dette blev gjort som en forbedring til at lette lethed af injektion. Collagenase infusion blev efterfulgt af inkubation, væv forstyrrelser, tæthed gradient adskillelse og hånd-picking at få ren Holme. Holme var kulturperler natten over i CMRL-1066 medium suppleret med 10% varme-inaktiverede føtal bovint serum (FBS) i T175 kolber ved 37 ° C, under 95% luft - 5% CO2 før transplantation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle mus anvendes i denne undersøgelse blev indhentet fra medicinsk dyr Center i Guangdong-provinsen. Brugen af dyr blev godkendt af den etiske gennemgang Udvalget af Shenzhen anden People's Hospital, i overensstemmelse med principperne om dyrevelfærd.
1. Holmen Transplantation til Omentum
Bemærk: Denne protokol kræver 2 personer til at udføre.
- Samle kirurgisk materialer, som er anført i tabel 1. Forberede aseptisk felt i kirurgisk område med steril materialer som gardiner og engangsartikler og vedligeholde aseptiske betingelser i hele operationen. Sterilisere alle kirurgiske instrumenter. Bære sterile kjoler.
- Vælge holmene ved hjælp af en 200 µL pipette tip under stereomikroskopet. Hver mus vil modtage 450-500 Islet tilsvarende (IEQ) pr. tansplant. For hvert dyr, skal du placere nok Holme til en enkelt transplantation i en sterile 1,5 mL snap-top rør med 100 µL af CMRL-1066 medium.
Bemærk: Holme kan være isoleret på dagen for transplantation, men det er bedre at isolere dem i forgårs for at tillade genoprettelse for isoleret proces. - Holde snap-top rør med småøer på is indtil klar til transplantation.
- Tø basalmembranen matrix hydrogel og holde det på is efter at fjerne det fra-20 ° C fryser. Hydrogel er flydende ved 4 ° C til 10 ° C og størkner ved højere temperaturer.
- Vejer og tag alle diabetisk recipient mus. Injicere 60 mg/kg pentobarbital natrium intraperitoneal. Test den dybde af anæstesi ved at administrere en tå knivspids. Give en yderligere 10 mg/kg pentobarbital natrium, hvis dyr reagerer på knibe. Hvis der er ingen trække refleks, anæstesi er korrekte for kirurgi.
- Vatpind operationsstedet på maven med 70% ethanol. Barber hår fra webstedet med razer klinge og desinficere området med Iodophor. Administrere vet salve til øjnene at forhindre tørhed under anæstesi.
- Brug den oftalmologiske saks til at åbne abdomen langs maven midterlinjen med et snit på 4-5 cm. Træk tarmene til venstre side og dække med saltvand gennemblødt gaze til at undgå overdreven dehydrering under kirurgi procedure.
- Bruge bomuld svaberprøver at udsætte det visuelle felt i maven og Find omentum (placeret under maven). Bruge to par af fine pincet til at svulme op omentum. Sørge for at forhindre skader fra rive.
- Hydrogel er helt optøet på dette punkt. Spin tube med Holme for 30 s på 200 x g og Fjern supernatanten. Opsug 50 µL af hydrogel, føje det til rør indeholdende holmene og resuspend blandingen forsigtigt undgå dannelsen af boblerne. Holde rør på isen under proceduren.
- Bruge to par pincet til at afhente kanterne af omentum og forsigtigt hæve den til at danne en rille mellem gastrisk væg og tarme, der kan rumme en lille mængde væske med islet transplantat.
- Lad den anden person hjælpe med proceduren og Opsug den resuspenderede Holm-hydrogel blanding (hele indholdet af røret) med en 200 µL pipette tip, levere indholdet ind i rillen.
- Sikre, at blandingen er godt placeret i rillen ved forsigtigt at hæve eller sænke kanterne af omentum. Komplet positionering af blandingen i 3 min før hydrogel størkner som en effekt af kropstemperaturen. Efter hydrogel sæt, fold omentum for at dække graften.
Bemærk: omentum vil overholde de omkringliggende gastrisk væg som hydrogel størkner. - Efter hydrogel er helt stivnet, bruge bomuld svaberprøver flytte tarmene tilbage ind i bughulen, pas på ikke for at røre ved stedet for transplantation.
- Tilføj 20 µL af cephalosporin (5 ~ 10 mg) ind i bughulen at forhindre infektion, derefter bruge 4-0 sutur for at lukke maven.
- Returnere musen til sit bur og Gentag alle trin for hver mus modtager. Holde musene varm og overvåge visuelt indtil de fuldt genvinde tilstrækkelig bevidsthed for at opretholde brystbenet recumbency. Holde musene separat fra andre dyr indtil de fuldt ud har tilbagebetalt.
- Injicér 50 µL cefazolin natrium (0,05 mg/mL) hver dag i en uge som post-kirurgi profylakse. Administrere Bupivicaine + buprenorphin, dvs. Påfør 1-3 dråber af 0,25% Bupivicaine på indsnit stedet topisk inden anbringelsen af sår klip. Administrere Buprenorphine(0.03 mg/ml with sterile 0.9% saline, 0.05-0.10 mg/kg) via ruten intraperitoneal (IP).
- Måle ikke-fastende blodsukker niveau fra en hale-venøs blodprøve ved hjælp af et blodsukkerapparat en gang om dagen efter transplantationen. Når omplantning til omentum, kan Holmen graft har en forsinket funktion og ikke nå en helt normal blodsukker niveau for 2-3 uger.
- For histologi, skal du fjerne den omental graft fra mus i slutningen af forsøget efter transplantation. Fix væv efter histologiske protokoller. Graften kan analyseres for immunfarvning eller immunfluorescens undersøgelser.
2. alternativ metode til Transplantation til Omentum
NOTE: En alternativ fibrin-thrombin hydrogel, der er brugt ved stuetemperatur kan erstattes basalmembranen matrix hydrogel. Det består af 2 komponenter, en fibrin sealer protein løsning (50 U/mL thrombin og 10 mg/mL fibrinogen). Når komponenterne er blandet, danner de en blodprop, der holder holmene på plads.
- Bruge fibrin-thombin hydrogel sammensatte ved stuetemperatur. Som i trin 1.2, vil hver mus modtage 450-500 islet ækvivalenter (IEQ) pr. transplantation. Placer holmene i sterile 1,5 mL snap-top rør med 100 µL af CMRL-1066 medium. Umiddelbart før transplantation, Aspirér holmene i en steril PE50 slangen til en længde på 10 cm og centrifugeres forsigtigt (30 s på 200 x g) til at danne en løs pellet.
- Forberede dyret, som anført ovenfor (trin 1,5-1,8) med omentum spredt ud. Bland hydrogel komponenter (10 µL/hver) og placere på omentum. (Figur 3D)
- Straks udvise Holme fra slangen på hydrogel. Hydrogel danner en blodprop omkring holmene. (Figur 3)
- Fold omentum over hydrogel og holme til at danne en pose. (Figur 3F) Fortsæt med trin 1.13 til 1.18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Post-Digestive tilstand af bugspytkirtlen er vist i figur 1A. Renset Holme er vist i figur 1B. Dithizone farvning og levedygtighed afprøvning af holmene er vist i figur 2. De vigtigste trin i Holmen transplantation til omentum er vist i figur 3. Blod glucose niveauer af modtagere efter omental transplantation er vist i figur 4. Histologiske analyse af podninger er vist i figur 5.
Figur 1 : Bugspytkirtlen fordøjelse og Holmen isolation. (A) bugspytkirtlen efter fordøjelsen. Bemærk de sand mellemstore partikler i suspension. (B) lysmikroskopi billede af Holme efter isolation. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Holmen dithizone farvning og fluorescens levedygtighed farvestoffer. (A) Holme farves rød af dithizone. (B) lysmikroskopi. (C) Propidium Iodid fluorescens rød farvning (døde celler). (D) Calcein-AM grøn farvning (levedygtige celler). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Transplantation i omentum. (A) efter den modtagende laparotomi, maven er udsat og omentum placeret. (B) Holme er blandet i hydrogel og langsomt placeret på den omental væv. (C) Islet pode på højere forstørrelse. Hydrogel er en semi-størknede tilstand. (D) alternativ metode. Hydrogel er placeret på omentum uden Holme. (E) Holme er placeret på toppen af hydrogel. (F) omentum foldes omkring holmene. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Blod glucose niveauer efter transplantation. Ikke-fastende blod glucose niveauer af modtagere (n = 7) op til 35 dage efter transplantation. Transplantat modtagere ikke alle modtager samme parti af holmene så der er forskelle i kvalitet og funktion, hvilket resulterer i store udsving i blodsukker niveau.
Figur 5 : Histologi. Transplantat sektioner (pode hentning 14 dage efter transplantation) var plettet med DAPI (kerner), anti-mus insulin antistoffer og hæmatoxylin. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Holmen transplantation leveren via portalen vene er mest anvendte metode til Holmen transplantation hos mennesker, men der er stadig effektivitet og sikkerhed bekymringer som portal vene trombose og leveren steatose17. Nylige undersøgelser viser, at omentum kan være et egnet alternativ til leveren, men mere forskning skal udføres før kliniske oversættelse12,14,18,19.
Musen er en velegnet model for at teste omentum som et websted til Holmen transplantation. I musen, omentum er placeret under maven væggen og foldes generelt. Størrelsen af omentum i mus er imidlertid lille og udfordrende at adgang. For at bruge det til transplantation, er det nødvendigt at forsigtigt sprede det til dens fuld størrelse så fold det over efter Holme/hydrogel mix er deponeret. I et større dyr, den omental væv er mere omfattende og kan være sutureres for at konstruere en eller flere poser som holmene er deponeret. Musen omentum er skrøbelige og kan ikke let acceptere suturer uden at knække. Af denne grund bruges en hydrogel til at gøre pose uden suturer.
I den første metode (trin 1.1-1.18) hydrogel bruges er en matrix, basalmembranen og er sammensat af laminin, kollagen IV og vækstfaktorer. Det størkner som varmes til kropstemperatur. I den anden metode (trin 2.1-2.4), bruges en anden hydrogel sammensat af 50U/mL thrombin og 10 mg/mL fibrinogen. To forskellige hydrogels anvendes til at vise alsidigheden i denne teknik. Det kan være skræddersyet til at passe mange omstændigheder og at etablere bevis for princippet. Til kliniske applikationer, om en syet etui eller en klinisk-grade hydrogel bruges, teknikken kan kombineres med en minimalt invasiv metode, (fx., en endoskopisk metode til levering til omentum). Til dette formål kræves supplerende undersøgelser ved hjælp af større pattedyr prækliniske modeller.
Tid til at normalisere blodsukkeret i mus modtagere efter transplantation i omentum i vores, såvel som andre studier tyder på at Holme i omentum kræver lidt længere tid at opnå tilstrækkelig insulinproduktion. Revaskularisering effektivitet synes at være en vigtig faktor, som beskrevet i undersøgelsen. Om tilstedeværelsen af en hydrogel påvirker hastigheden af holmen revaskularisering og ydeevne, der stadig skal fastlægges.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne rapport ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Nogle af forfatterne af dette arbejde blev støttet i en del af tilskud fra National nøglen R & D Program i Kina (2017YFC1103704), Sanming projekt af medicin i Shenzhen (SZSM201412020), fonden for højt niveau medicinsk disciplin konstruktion af Shenzhen (2016031638), Shenzhen grundlaget for videnskab og teknologi (JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425110110658), Shenzhen grundlaget for sundhed og familieplanlægning Kommissionen (SZXJ2017021).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 5 inch (12-13 cm) Scissors | RWD Life Science | S12030-11 | |
| Fine Forceps | RWD Life Science | F11010-13 | |
| Small wound clips | RWD Life Science | R33003-01 | |
| Acutenaculum | RWD Life Science | F31044-13 | |
| 2 pair tissue forceps | RWD Life Science | F13023-10 | |
| 4-0 Suture with needle | Chenghe, China | 17094 | |
| 200 μL Pipette and tips | Gilson | PN11 | |
| One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system | Johnson & Johnson | 33391713 | |
| razor blade | Philips | HC1099/15 | |
| Material and animals | |||
| Pentobarbital Sodium | Sigmaaldrich.com | P3761 | For anesthesia |
| Hydrogel | bdbiosciences.com | 356234 | Basement Membrane Matrix |
| Fibrin-Thrombin Hydrogel | Baxter.com | 1501250 | Components clot when mixed |
| 70% Ethanol | Yingniu medical, Anhui, China | 23170608 | |
| Iodophor | Lierkang medical technology, Shangdong, China | 170521 | |
| Normal saline | Baxter.com | 2B1324 | |
| Cephalosporin | Lukang medical, Shangdong, China | 150303 | |
| Cefazolin | Baxter.com | 2G3508 | |
| lubricant eye ointment | Major Pharmaceuticals | 203964 | |
| streptozotocin | Sigmaaldrich.com | S0130 | |
| collagenase Type V | Sigmaaldrich.com | C9262 | |
| CMRL-1066 media | celltrans, Wenzhou, China | X018D1 | |
| histopaque | Sigmaaldrich.com | 10771 | density gradient |
| PE50 tubing | Braintreesci.com | PE50 100 FT | Polyethylene .023" x .038 |
| Calcein AM | Sigmaaldrich.com | C1359 | |
| Propidium iodide | Sigmaaldrich.com | P4864 | |
| optimal cutting temperature compound (OCT) | Tissue-Tek; Miles, Naperville, IL | 4583 | embedding medium |
| insulin antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 | 8138S | |
| hematoxylin staining media | Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 | 14166S | |
| eosin staining media | Beyotime Biotech, China | C0109 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific Inc. | D1306 | |
| C57Bl/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province | / | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| T175 flasks | Falcon | 353112 | |
| 1.5 mL Snap-top tubes | Axygen | MCT-150-C |
References
- Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes research and clinical practice. 103 (2), 137-149 (2014).
- Bellin, M. D., et al. Potent Induction Immunotherapy Promotes Long-Term Insulin Independence After Islet Transplantation in Type 1 Diabetes. American Journal of Transplantation. 12 (6), 1576-1583 (2012).
- Moberg, L., et al. Production of tissue factor by pancreatic islet cells as a trigger of detrimental thrombotic reactions in clinical islet transplantation. The lancet. 360 (9350), 2039-2045 (2002).
- Nilsson, B., Ekdahl, K. N., Korsgren, O. Control of instant blood-mediated inflammatory reaction to improve islets of Langerhans engraftment. Current Opinion in Organ Transplantation. 16 (6), 620-626 (2011).
- Bellin, M. D., et al. Similar islet function in islet allotransplant and autotransplant recipients, despite lower islet mass in autotransplants. Transplantation. 91 (3), 367-372 (2011).
- Bruni, A., Gala-Lopez, B., Pepper, A. R., Abualhassan, N. S., Shapiro, A. J. Islet cell transplantation for the treatment of type 1 diabetes: recent advances and future challenges. Diabetes, metabolic syndrome and obesity: targets and therapy. 7, 211 (2014).
- Shapiro, A. J., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nature reviews Endocrinology. 13 (5), 268-277 (2017).
- Cantarelli, E., Piemonti, L. Alternative transplantation sites for pancreatic islet grafts. Current diabetes reports. 11 (5), 364 (2011).
- Cantarelli, E., et al. Murine animal models for preclinical islet transplantation: no model fits all (research purposes). Islets. 5 (2), 79-86 (2013).
- Beli, E., et al. Erratum to: CX3CR1 deficiency accelerates the development of retinopathy in a rodent model of type 1 diabetes. J Mol Med (Berl). 95 (5), 565-566 (2017).
- Hafner, J., et al. Regional Patterns of Retinal Oxygen Saturation and Microvascular Hemodynamic Parameters Preceding Retinopathy in Patients With Type II Diabetes. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (12), 5541-5547 (2017).
- Schmidt, C. Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum. Nature Biotechnology. 35 (1), 82017 (2017).
- Voigt, M., et al. Prevalence and Progression Rate of Diabetic Retinopathy in Type 2 Diabetes Patients in Correlation with the Duration of Diabetes. Exp Clin Endocrinol Diabetes. , (2017).
- Baidal, D. A., et al. Bioengineering of an Intraabdominal Endocrine Pancreas. New England Journal of Medicine. 376 (19), 1887-1889 (2017).
- Espes, D., et al. Rapid restoration of vascularity and oxygenation in mouse and human islets transplanted to omentum may contribute to their superior function compared to intraportally transplanted islets. American Journal of Transplantation. , (2016).
- Berman, D. M., et al. Bioengineering the endocrine pancreas: intraomental islet transplantation within a biologic resorbable scaffold. Diabetes. 65 (5), 1350-1361 (2016).
- Delaune, V., Berney, T., Lacotte, S., Toso, C. Intraportal islet transplantation: the impact of the liver micro-environment. Transplant International. 30 (3), 227-238 (2017).
- Espes, D., et al. Rapid restoration of vascularity and oxygenation in mouse and human islets transplanted to omentum may contribute to their superior function compared to intraportally transplanted islets. American Journal of Transplantation. 16 (11), 3246-3254 (2016).
- Hajizadeh-Saffar, E., et al. Inducible VEGF expression by human embryonic stem cell-derived mesenchymal stromal cells reduces the minimal islet mass required to reverse diabetes. Scientific Reports. 5, (2015).
