Summary
大網移植マウスの島のための方法を紹介します。膵島は、ハイドロゲルと混合され、混合物は糖尿病マウスの大網のポーチに配置されます。血糖値を監視し、免疫組織化学的解析を行っています。
Abstract
膵島移植は、1 型糖尿病の潜在的な治療であると提案されています。最近の説得力のある証拠は、理想的な膵島の血管内注入を示しますので、大網は膵島移植の可能性がある貴重なサイトとして再浮上。この実験では、高品質の膵島の分離と糖尿病の受信者に膵島移植を必要があります。大網への移植には、視覚的によりよく示すことができる手術の手順が必要です。ここでは、このプロシージャの詳細な手順が掲載されています。糖尿病マウスの大網のポーチに混合物を配置する前にゲルと膵島の混合の 2 つのメソッドは以下のとおりです。別のゲルは、さまざまな条件に使用されます。大網の同系の島の受信者を糖尿病マウスの血糖値は 35 日間の監視されました。免疫組織化学的解析を実行する 14 日後は、いくつかの動物が犠牲になった。この前臨床移植アプローチは、臨床移植への翻訳に至るまで予備のデータとして使用できます。
Introduction
国際糖尿病連合 (IDF) によると、糖尿病は現在、203515 億 9200 万人に投影された増加との 3 億 8200 万人を影響します。両方の同種および異種膵島移植、全身性の免疫抑制療法が必要です。免疫のない免疫拒絶反応は移植の損失の2の主要な原因です。インスタントの血液を介した炎症反応 (IBMIR)3,4による移植膵島の損失の重大な問題もあります。ただし、同系のような免疫応答の不在でもまたは自動移植モデル、門脈経由で肝臓に移植する膵島細胞が炎症のためおよび/または貧しい人々 の血液などの好ましくない環境条件に失われました。減らされた酸素や栄養素5,6を供給します。その結果、長期的な代謝機能を確保するために小島が多いほど生着7を減らす最初のセル損失を補うために必要です。
膵島の生着を最適化しようとして、いくつかの代替解剖学的サイト実験を行った結果のよう臨床的に有望なまだ決定的でない8。簡単かつ安全なアクセスを提供するいくつかの代替サイトに対し (e.g皮膚、腎被膜、胃粘膜、眼の前房内) またはより大きい島の大衆のためのより広い面 (e.g。、腹腔内)、生存および生理。移植膵島の代謝のパフォーマンスはまだ限られている、懸念9を維持します。膵島の生着のためのより適切なサイトの検索が進行中です。
大網は膵島移植の早い開発の調査を行い, 島10、11,12,13、成功の環境を証明する多くの解剖学的サイト 14。ただし、膵島の門脈内注入になった臨床選択期限一部プロシージャの相対的なシンプルさと動物の初期の成功モデル6。また、一部では、ネガは、これに関連するサイト、特に大規模な早期膵島の損失、フィールドとして実験的膵島移植の初期の頃に以下の理解なり拘束された成熟します。膵島の血管内注入がから遠いことを示す最近の説得力のある証拠と理想的な大網は細胞移植の可能性がある貴重なサイトとして再浮上。
(大網ポーチの形) で大網肝15,16上の相対的な利点を提供しています。血管に富んだ、簡単にアクセス可能です。(必要に応じて) 移植や生検の検索をことができます。小島によって経験される虚血期間は肝臓に比べて減り、大網が不可能である門脈的、門脈圧の上昇、大きなアイレット大衆は合併症を引き起こすことができる比較的受け入れることができます。
20-25 g. 小島受信者がレンダリングされた 250 の線量とストレプトゾトシンの単回投与で糖尿病の体重と生後 6-8 週間の間 c57bl/6 男性マウスを用いた研究でテストされたプロトコルに使用された移植の同系マウス モデルmg/kg の ip。糖尿病の誘導は成功とマウスの血糖値は注射後 24 ミリ モル/L 48 h を超えています、上位 5 日の最低レベルのまま。
同系の小島は、以下のいくつかの変更以前に発行された方法年齢一致ドナーの膵臓から分離しました。簡単に言えば、コラゲナーゼは胆管ではなく胆嚢に注入されました。これは、注入の容易さへの改善として行われていた。コラゲナーゼ注入された培養、組織破壊、密度勾配分離に続いて、純粋な島を取得する手摘み。小島未満 10% 熱不活化の牛胎児血清 (FBS) T175 37 ° C でフラスコを添加した CMRL 1066 培地で一晩培養移植前に 95% の空気-5% CO2 。
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Protocol
本研究で使用されるすべてのマウスは、医療動物センターの広東省から得られました。動物の使用は、倫理審査委員会の深セン第二人民病院、動物福祉の原則によって承認されました。
1 大綱膵島移植
注: このプロトコルには、達成するために 2 人が必要です。
- 表 1に記載されている手術の材料を組み立てます。カーテンなど使い捨て滅菌材料で外科領域で無菌のフィールドを準備し、手術中の無菌状態を維持します。すべての手術器具を滅菌します。滅菌ガウンを着用します。
- 個人差で 200 μ L ピペット チップを用いた膵ランゲルハンス島を選ぶ。各マウスは 450-500 膵島と同等 (IEQ) tansplant あたりを受け取ります。それぞれの動物 CMRL 1066 媒体の 100 μ L 滅菌 1.5 mL スナップ トップ チューブに単一移植のため十分な島に配置します。
注: 小島は移植の日に分離することが、分離プロセスのための回復を許可する前に日を分離するほうがいい。 - 移植する準備ができるまで氷の上の小島にスナップ トップ チューブを保ちます。
- 基底膜マトリックス ハイドロゲルを解凍-20 ° C のフリーザーから除去した後氷の上保管してください。ヒドロゲルは 10 ° C への 4 ° C で液体で、高温で塗りつぶされます。
- 重さし、タグのすべての糖尿病の受信者のマウス。60 mg/kg のペントバルビ タール ナトリウムを腹腔内に挿入します。テスト、つま先ピンチを投与することによって麻酔の深さ。ピンチに動物が反応する場合は、追加の 10 の mg/kg のペントバルビ タール ナトリウムを与えます。ある場合ない麻酔のレベルが手術の正しい反射を撤回します。
- 70% のエタノールを使用して腹部に手術部位を綿棒します。Razer のブレードを持つサイトから髪を剃るし、Iodophor を使用して領域を消毒します。麻酔中の乾燥を防ぐため目に獣医軟膏を管理します。
- 眼科用のハサミを使用して、左側に腸移動 4 に 5 cm。 の切開で腹部正中線に沿って腹部を開く、外科プロシージャの間に過度の脱水症状を防ぐために生理食塩水浸したガーゼでカバーします。
- 綿棒を使用して、完全に胃の視覚的なフィールドを公開し、大網 (胃の下にある) を探します。大網を広げるために微細鉗子の 2 つのペアを使用します。断裂から損傷を防ぐために注意してください。
- ヒドロゲルへ完全にこの時点で凍結されています。30 の膵管をスピン x g と削除上清 200 で s。ハイドロゲルの 50 μ L を吸引、膵管内に追加して、優しく泡の形成を回避するミックスを再懸濁します。プロシージャの間に氷の上の管を保ちます。
- 大網のエッジをピックアップし、胃の壁や腸膵島移植と液体の少量を収容できる間の溝を形成することをゆっくりと上げて鉗子の 2 つのペアを使用します。
- 2 人目の手順で支援し、200 μ L ピペット チップの再懸濁のアイレット ヒドロゲル混合物 (管の全体の内容) を吸引、溝にコンテンツを配信できます。
- 混合物もそっと上げたり下げたりして大網のエッジ投稿溝に配置されることを確認します。ヒドロゲルの前に 3 分以内の混合物の位置決め完了体の温度の効果として立体化します。ヒドロゲルを設定すると後、は、移植をカバーする大網を隠します。
注: ヒドロゲルを確固たるものとして、大網は周囲の胃壁に付着します。 - ヒドロゲルは完全に固化した後は、移植のサイトに触れないように世話、腹腔内に腸の位置を変更するのに綿棒を使用します。
- セファロスポリンの 20 μ L を追加 (5 ~ 10 mg) 腹腔内感染を防ぐために、腹部を閉じます 4-0 縫合糸を使用します。
- そのケージに戻すには、マウス受信者ごとにすべての手順を繰り返します。マウスを暖かく保つ、彼らは完全に胸骨の横臥を維持するために十分な意識を取り戻すまでを視覚的に監視します。マウスは、彼らが完全に回復するまで他の動物別保管してください。
- 術後予防として 1 週間毎日セファゾリンナトリウム (0.05 mg/mL) の 50 μ L を注入します。Bupivicaine + ブプレノルフィンを管理、すなわち 0.25% の 1-3 滴を適用傷のクリップの配置前に局所的に切開部位で Bupivicaine。管理 Buprenorphine(0.03 mg/ml with sterile 0.9% saline, 0.05-0.10 mg/kg) 腹腔内 (IP) 経由。
- 血糖測定器を使用して尾静脈血液サンプルから非空腹時血糖値を測定、移植後一日一回。大網移植、膵島移植があります遅延機能を持っているし、2-3 週間、完全に正常な血糖値のレベルに達しない。
- 組織の次の移植実験の終わりにマウスから、大網を削除します。組織のプロトコルに従って組織を修正します。移植は、免疫染色や蛍光の研究分析できます。
2. 大網への移植方法
注意: 基底膜マトリックス ハイドロゲルの室温で使用される代替フィブリン トロンビン ハイドロゲルを代えることができます。2 つのコンポーネント、フィブリン シーラー タンパク質溶液 (50 U/mL トロンビンおよび 10 mg/mL フィブリノゲン) で構成されています。コンポーネントを混在している場所で、島を保持する血栓が形成されます。
- 室温でフィブリン thombin ハイドロゲル複合を使用します。1.2 の手順のように各マウス移植あたり 450-500 アイレット同等 (IEQ) が表示されます。CMRL 1066 媒体の 100 μ L 滅菌 1.5 mL スナップ トップ チューブに島を配置します。すぐに移植、前に 10 cm の長さのための無菌 PE50 チューブに小島を吸引し、軽く遠心分離機 (30 200 x g で s) 緩やかなペレットを形成します。
- 広がる大網と (手順 1.5-1.8) 上記のように、動物を準備します。ハイドロゲル成分 (10 μ L/各) をミックスし、大網に置きます。(図 3 D)
- すぐに、ハイドロゲルにチューブから島を追放します。ヒドロゲルは、独島のまわりの血栓を形成します。(図 3E)
- 大網を折り重ね、ハイドロゲルと袋を形成する島。(図 3 f)1.13 に 1.18 の手順に進みます。
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Representative Results
膵臓の post-digestive の状態は、図 1 aに表示されます。精製小島は図 1 bに示します。ジチゾン染色と小島の生存率試験は、図 2のとおりです。大網に膵島移植の主な手順は、図 3のとおりです。大網移植後受信者の血糖値は、図 4のとおりです。移植後の組織学的解析を図 5に示します。
図 1: 膵臓の消化、膵島分離します。(A) 次の消化膵臓。砂粒子懸濁液に注意してください。(B) 光顕像分離後島。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 膵島ジチゾン染色と蛍光性染料。(A) 島のジチゾンで赤で染まっています。(B) 光学顕微鏡検査。(C) Propidium ヨウ化蛍光レッド (角質) を染色します。(D) カルセイン AM、緑染色 (生菌)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 大網移植します。(A) 受信者開腹胃が露出し、大網にあります。 (B) 島、ハイドロゲルの混合し、ゆっくりと大網の組織に配置。(C) 膵島グラフトより高い倍率で。ヒドロゲルは、半凝固状態です。(D) 方法。ハイドロゲルは小島.なし大網に配置されます。(E) の小島は、ゲルの上に配置されます。大網 (F) は、島の周り折り返されている.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 血ブドウ糖のレベルのポスト移植します。受信者の非空腹時血糖値 (n = 7) 移植後 35 日前まで。移植の受信者品質と血糖値の大幅な変動で機能の違いがあるようには、島の同じバッチを受信すべてでした。
図 5: 組織。移植 (移植検索移植後 14 日) 染色 DAPI (核)、抗マウス インスリン抗体、ヘマトキシリンと。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
門脈を介して肝膵島移植はヒトでは、最もよく使われる膵島移植の方法がまだ門脈血栓症と肝脂肪変性17など効率と安全性の懸念があります。最近の研究では、大網肝臓臨床翻訳12,14,18,19の前に実施するより多くの研究ニーズに適切な代わりであるかもしれないことを示します。
マウスは、膵島移植のためのサイトとして、大網をテストに最適モデルです。マウスの大網は胃の壁の下にあるし、一般的に折り返されています。しかし、マウス大網のサイズは小さいとアクセスへの挑戦です。移植のためにそれを使用するために静かにフル サイズに広がるから、小島/ハイドロゲル ミックスが到着した後、それを倍にする必要です。大型の動物で大網の組織はより広範なは、小島の堆積を 1 つまたは複数の袋を構築に縫合することができます。マウス大網が脆弱であり、簡単に壊すことがなく縫合を受け入れていません。このため、ハイドロゲルは縫合しないでポーチを作るためです。
最初のメソッド (手順 1.1-1.18) で使用ハイドロゲルは基底膜マトリックス、ラミニン、コラーゲン IV、成長因子から成る。それは、体温に温めを立体化します。2 番目のメソッド (手順 2.1-2.4)、50 u/mL トロンビンと 10 mg/mL フィブリノーゲンから成る異なるヒドロゲルを使用します。2 つの異なるゲルは、この手法の多様性を表示する使用されます。それは原則の証拠を確立し、多くの状況に合うように仕立てられるかもしれません。臨床応用に縫合ポーチまたは臨床グレード ヒドロゲルを使用するかどうか手法と併用できる低侵襲アプローチ (e.g。、大網への配信の内視鏡法)。この目的より大きい哺乳類の前臨床モデルを使用して追加の研究が必要です。
私たちと同様、他の研究で大網移植後マウス受信者の血糖値を正常化する時間は、大網の小島が十分なインシュリンの生産を達成するためにわずかに長い時間を必要とすることをお勧めします。血行再建術の効率は、研究の概説、1 つの重要な要因のように見えます。ハイドロゲルの存在アイレット血行再建術とパフォーマンスの速度に影響するかどうか決定する残っているの。
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Disclosures
利害の衝突を報告しません。
Acknowledgments
いくつかのこの作品の作家は一部国立キー R & D 中国プログラム (2017YFC1103704)、三明プロジェクト深圳 (SZSM201412020)、高レベル医療分野建設の深セン (2016031638) のための基金で医学部からの補助金によってサポートされていた深セン科学技術 (JCJY20160229204849975、GJHZ20170314171357556、JCYJ20160425110110658)、健康と家族計画委員会 (SZXJ2017021) の深圳財団の基金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 5 inch (12-13 cm) Scissors | RWD Life Science | S12030-11 | |
| Fine Forceps | RWD Life Science | F11010-13 | |
| Small wound clips | RWD Life Science | R33003-01 | |
| Acutenaculum | RWD Life Science | F31044-13 | |
| 2 pair tissue forceps | RWD Life Science | F13023-10 | |
| 4-0 Suture with needle | Chenghe, China | 17094 | |
| 200 μL Pipette and tips | Gilson | PN11 | |
| One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system | Johnson & Johnson | 33391713 | |
| razor blade | Philips | HC1099/15 | |
| Material and animals | |||
| Pentobarbital Sodium | Sigmaaldrich.com | P3761 | For anesthesia |
| Hydrogel | bdbiosciences.com | 356234 | Basement Membrane Matrix |
| Fibrin-Thrombin Hydrogel | Baxter.com | 1501250 | Components clot when mixed |
| 70% Ethanol | Yingniu medical, Anhui, China | 23170608 | |
| Iodophor | Lierkang medical technology, Shangdong, China | 170521 | |
| Normal saline | Baxter.com | 2B1324 | |
| Cephalosporin | Lukang medical, Shangdong, China | 150303 | |
| Cefazolin | Baxter.com | 2G3508 | |
| lubricant eye ointment | Major Pharmaceuticals | 203964 | |
| streptozotocin | Sigmaaldrich.com | S0130 | |
| collagenase Type V | Sigmaaldrich.com | C9262 | |
| CMRL-1066 media | celltrans, Wenzhou, China | X018D1 | |
| histopaque | Sigmaaldrich.com | 10771 | density gradient |
| PE50 tubing | Braintreesci.com | PE50 100 FT | Polyethylene .023" x .038 |
| Calcein AM | Sigmaaldrich.com | C1359 | |
| Propidium iodide | Sigmaaldrich.com | P4864 | |
| optimal cutting temperature compound (OCT) | Tissue-Tek; Miles, Naperville, IL | 4583 | embedding medium |
| insulin antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 | 8138S | |
| hematoxylin staining media | Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 | 14166S | |
| eosin staining media | Beyotime Biotech, China | C0109 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific Inc. | D1306 | |
| C57Bl/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province | / | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| T175 flasks | Falcon | 353112 | |
| 1.5 mL Snap-top tubes | Axygen | MCT-150-C |
References
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