Summary
En metode for omental transplantasjon av holmer i en mus er innført. De isolerte småøyer er blandet med hydrogel og blandingen er plassert i den omental posen diabetiker museklikk. Deretter blodsukker overvåkes og immun-histochemical analyse er utført.
Abstract
Holme transplantasjon har blitt foreslått å være en potensiell behandling for type 1 diabetes. Siste overbevisende bevis indikerer at intravascular Holme infusjon er langt fra ideell og derfor omentum re-voksende som potensielt verdifulle nettsted for Holme transplantasjon. Dette eksperimentet krever isolering av høy kvalitet holmer og implantering av øyene til diabetiker mottakerne. Transplantasjon til omentum krever kirurgisk trinn som kan påvises bedre visuelt. Her presenteres detaljerte trinn for denne prosedyren. To metoder for å blande de isolerte småøyer med hydrogel før du plasserer blandingen inn i omental poseen diabetiker mus er beskrevet her. Forskjellige hydrogels brukes for ulike forhold. Blodsukker diabetiker musen mottakere av syngeneic holmer i omentum var overvåket for opp til 35 dager. Noen dyr ble ofret etter 14 dager å utføre immuno-histochemical analyse. Denne pre-klinisk transplantasjon kan brukes som foreløpige data fører til oversettelse til kliniske transplantasjon.
Introduction
Ifølge International Diabetes Federation (IDF), påvirker diabetes mellitus for tiden 382 millioner mennesker, med en projisert økning 592 millioner mennesker av 20351. Begge allogene og xenogeneic Holme transplantasjon er systemisk suppressive terapi nødvendig. Uten immunsuppresjon er uimottakelig avvisning en viktig årsak til graftet tap2. Det er også et betydelig problem av transplantert Holme tap på grunn av umiddelbar blod mediert inflammatorisk reaksjon (IBMIR)3,4. Men selv i fravær av en immunrespons som syngeneic eller auto-transplantasjon modeller, Holme celler transplantert inn i leveren via portalen blodåre går tapt på grunn av betennelse og/eller ugunstige miljøforhold, som fattig blod gi redusert oksygenering og/eller næringsstoffer5,6. Som et resultat for å sikre langsiktig metabolsk funksjon, er høyere Holme tallene nødvendig for å kompensere for den første celle tap som reduserer engraftment7.
I et forsøk på å optimalisere Holme engraftment, flere alternative anatomiske nettsteder har blitt undersøkt eksperimentelt samt med lovende, ennå ikke endelige resultater klinisk8. Mens noen av webområdene alternativ tilbyr enkel og trygg tilgang (f.eks., hud, nyre kapsel, gastrisk submucosa og fremre kammer av øyet) eller en større overflate for større Holme massene (f.eks., bukhulen), overlevelse og fysiologiske Metabolsk ytelsen av transplanterte øyene er fortsatt begrenset og forblir en bekymring9. Søk etter et mer egnet sted for Holme engraftment pågår.
Omentum var blant de mange anatomiske nettstedene som ble undersøkt i den tidlige utviklingen av Holme transplantasjon, og viste en fremgangsrik for holmer10,11,12,13, 14. Men intraportal Holme infusjon ble klinisk valg forfaller delvis relative enkelhet prosedyren og tidlig suksess på dyr modeller6. Også delvis negativer forbundet med dette området, spesielt massive tidlig Holme tap, var mindre forstått og mindre begrensende i begynnelsen av eksperimentelle Holme transplantasjon som feltet modnet. Med nyere overbevisende bevis indikerer at intravascular Holme infusjon er langt fra ideell, omentum er re-voksende som potensielt verdifulle nettsted for cellen transplantasjon.
Omentum (i form av en omental posen) har relative fordeler over leveren15,16. Det er godt vascularized og lett tilgjengelig. Den lar henting av pode (om nødvendig) eller biopsi. Den iskemiske perioden oppleves av øyene er redusert sammenlignet med leveren, og omentum kan godta relativt store Holme massene som ikke mulig intraportally, der en økning i portalen press kan føre til komplikasjoner.
En syngeneic musemodell av transplantasjon ble brukt i protokollen testet i studien, ansette C57BL/6 mannlige mus mellom 6-8 uker gammel med en kroppsvekt på 20-25 g. Holme mottakere ble gjengitt diabetiker med en enkelt injeksjon av streptozotocin med en dose av 250 mg/kg ip. Induksjon av diabetes kan betraktes vellykket hvis blodsukkernivå museklikk er større enn 24 mmol/L 48 timer etter injeksjon og forblir nivået i minst 5 dager over.
Syngeneic holmer ble isolert fra bukspyttkjertelen alder-matchet givere fulgte publisert tidligere metoder med noen modifikasjoner. I korte trekk ble collagenase injisert i galleblæren i stedet for gallekanalen. Dette ble gjort som en forbedring å lette enkel injeksjon. Collagenase infusjon var etterfulgt av inkubering, vev avbrudd, tetthet gradert separasjon og håndplukke å få ren holmer. Holmer ble kultivert overnatting i CMRL-1066 medium supplert med 10% inaktivert fosterets bovin serum (FBS) i T175 flasker på 37 ° C, under 95% luft - 5% CO2 før transplantasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle mus brukt i denne studien var oppnådd fra medisinsk dyr senter i Guangdong-provinsen. Bruk av dyr ble godkjent av etikk Review Committee i Shenzhen andre People's Hospital, i samsvar med prinsippene for dyrevelferd.
1. Holme transplantasjon til Omentum
Merk: Denne protokollen krever 2 personer å oppnå.
- Samle kirurgisk materialer som er oppført i tabell 1. Forberede aseptiske felt i kirurgiske steril materiale som gardiner og forbruksmateriell og opprettholde aseptiske forhold gjennom kirurgi. Sterilisere alle kirurgiske instrumenter. Bruk sterilt kjoler.
- Velg øyene med en 200 µL pipette tips under stereomicroscope. Hver musen får 450-500 Holme tilsvarende (IEQ) per tansplant. For hvert dyr, plassere nok holmer for en enkelt transplantasjon inn en bakteriefri 1.5 mL snapin-topp rør med 100 µL CMRL-1066 medium.
Merk: Holmer kan isoleres ved transplantasjon, men det er bedre å isolere dem dagen før at gjenoppretting for isolasjon prosessen. - Holde snapin-topp rør med holmer på is helt klar til å transplantasjon.
- Tine kjelleren membran matrix hydrogel og holde det på is etter fjerner det fra 20 ° C fryseren. Hydrogel er flytende ved 4 ° C til 10 ° C og stivner ved høyere temperaturer.
- Veier og merke alle diabetiker mottaker mus. Injisere 60 mg/kg pentobarbital natrium intraperitoneally. Test den dybden av anestesi ved å tilsette en tå knipe. Gi en ekstra 10 mg/kg pentobarbital natrium hvis dyret reagerer klemme. Hvis det er ingen trekke refleks, anestesi er riktig for kirurgi.
- Vattpinne kirurgiske området på magen med 70% etanol. Barbere håret fra området med razer blad og rense området med Iodophor. Administrere vet salve for øynene å hindre tørrhet under anestesi.
- Bruk ophthalmica saksen åpne magen langs magen midtlinjen med et snitt på 4-5 cm. trekk tarmen til venstre og dekket med saltvann fuktet gasbind å forhindre overdreven dehydrering under kirurgi prosedyre.
- Bruk bomull vattpinner fullt avsløre for magen og finne omentum (plassert nedenfor magen). Bruke to par fine tang for å distend i omentum. Ta vare for å hindre skade fra å rive.
- Hydrogel er helt tint på dette punktet. Spin røret med holmer for 30 s 200 x g og fjern nedbryting. Sug opp 50 µL av hydrogel, legge den til røret som inneholder øyene og resuspend blandingen forsiktig Unngå dannelse av bobler. Holde rørene på is under prosedyren.
- Bruke to par pinsetter å plukke opp kantene på omentum og forsiktig løfte den til å danne en groove mellom mage veggen og tarmen som rommer en liten mengde væske med Holme graftet.
- La den andre personen hjelpe prosedyren og Sug opp resuspended Holme-hydrogel blandingen (hele innholdet av rør) med 200 µL pipette tips, levere innholdet i sporet.
- Kontroller at blandingen er godt plassert i sporet av forsiktig heve eller senke kantene på omentum. Fullstendig plassering av blandingen i 3 minutter før hydrogel stivner som kroppstemperaturen. Når hydrogel sett, bretter du omentum for å dekke graftet.
Merk: omentum vil følge ringmuren mage som hydrogel stivner. - Når hydrogel er helt styrket, bruke bomull vattpinner flytte tarmen tilbake i bukhulen, ta vare ikke for å berøre stedet for transplantasjon.
- Legge til 20 µL av cephalosporin (5 ~ 10 mg) i bukhulen å hindre infeksjon, deretter bruke 4-0 Sutur lukke magen.
- Returnere musen til buret sitt og gjenta alle trinnene for mottakerne musen. Holde musene varme og overvåke visuelt før de fullt gjenvinne tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal recumbency. Holde musene atskilt fra andre dyr før de er helt friske.
- Sette inn 50 µL av cefazolin natrium (0,05 mg/mL) hver dag i uken som etter operasjonen profylakse. Administrere Bupivicaine + buprenorfin, i.e. Bruk 1-3 dråper 0,25% Bupivicaine på webområdet snitt lokalt før plassering av såret klipp. Administrere Buprenorphine(0.03 mg/ml with sterile 0.9% saline, 0.05-0.10 mg/kg) via intraperitoneal (IP)-ruten.
- Måle ikke-faste blodsukkernivå fra en hale blodåre blodprøve bruker en blodsukkermåler en gang om dagen etter transplantasjon. Når transplantasjonen til omentum, kan Holme graftet ha en forsinket funksjon og ikke oppnår en helt normal blodsukkernivå for 2-3 uker.
- For histology, fjerne omental graftet fra musen på slutten av forsøket etter transplantasjon. Reparere vevet etter histologiske protokollene. Graftet kan bli analysert for immunostai- eller immunofluorescence studier.
2. alternativ metode for transplantasjon til Omentum
Merk: En alternativ fibrin-trombin hydrogel som brukes ved romtemperatur kan erstattes for kjelleren membran matrix hydrogel. Det består av 2 komponenter, en fibrin sealer protein løsning (50 U/mL trombin og 10 mg/mL fibrinogen). Når komponentene, danner de en blodpropp som holder øyene på plass.
- Bruk fibrin-thombin hydrogel sammensatte ved romtemperatur. Som i trinn 1.2 får hver musen 450-500 Holme ekvivalenter (IEQ) per transplantasjon. Plass øyene i en bakteriefri 1.5 mL snapin-topp rør med 100 µL CMRL-1066 medium. Umiddelbart før transplantasjon, Sug opp øyene i et sterilt PE50 rør med en 10 cm og sentrifuge forsiktig (30 s 200 x g) å danne løs pellets.
- Forberede dyret som nevnt ovenfor (trinn 1.5-1.8) med omentum spredt. Bland hydrogel komponentene (10 µL/hver) og plassere på omentum. (Figur 3D)
- Umiddelbart utvise holmer fra slangen på hydrogel. Hydrogel danner en blodpropp rundt øyene. (Figur 3E)
- Kaste omentum over hydrogel og holmer å danne en pose. (Figur 3F) Fortsett med trinnene 1.13 til 1.18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Post-digestive statlige i bukspyttkjertelen er vist i figur 1A. Renset holmer vises i figur 1B. Dithizone flekker og levedyktighet testing av øyene er vist i figur 2. De viktigste trinnene av Holme transplantasjon til omentum vises i Figur 3. Blodsukkernivået mottakere etter omental transplantasjon er vist i Figur 4. Histologiske analyse av grafts er vist i figur 5.
Figur 1 : Bukspyttkjertelen fordøyelsen og Holme isolasjon. (A) bukspyttkjertelen etter fordøyelsen. Merk sand størrelse partikler i suspensjon. (B) * lys bilde av øyene etter isolasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Holme dithizone flekker og fluorescens levedyktighet fargestoffer. (A) holmer er farget i rødt av dithizone. (B) * lys. (C) Propidium Iodide fluorescens røde flekker (død celler). (D) Calcein-AM grønne flekker (levedyktig celler). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Transplantasjon i omentum. (A) etter i mottakerens laparotomy, magen er utsatt og omentum plassert. (B) holmer er blandet i hydrogel og sakte plasseres på omental vev. (C) Holme pode ved høyere forstørrelse. Hydrogel er en semi befestet tilstand. (D) alternativ metode. Hydrogel er plassert på omentum uten holmer. (E) holmer er plassert på hydrogel. (F) av omentum kastes rundt øyene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Blod glukose nivå etter transplantasjon. Ikke-faste blodsukker mottakere (n = 7) opp til 35 dager etter transplantasjon. Pode mottakerne ikke alle får den samme gruppen av holmer slik det er forskjeller i kvalitet og funksjon som resulterer i store svingninger i blodsukkernivå.
Figur 5 : Histology. Pode deler (pode henting 14 dager etter transplantasjon) var farget med DAPI (kjerner), anti-musen insulin antistoffer og hematoxylin. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Holme transplantasjon til leveren via portalen blodåre er mest brukte metoden for Holme transplantasjon hos mennesker, men det er fortsatt effektivitet og sikkerhet bekymringer som portalen blodåre tromboser og lever Steatose17. Nyere studier viser at omentum kan være et egnet alternativ til leveren, men mer forskning må gjennomføres før kliniske oversettelse12,14,18,19.
Musen er en passende modell for testing av omentum som et område for Holme transplantasjon. I musen, omentum ligger under veggen og kastes generelt. Størrelsen på omentum i mus er imidlertid små og utfordrende Access. For å bruke det for transplantasjon, er det nødvendig å forsiktig spredt ut i full størrelse og brett det over etter holmer/hydrogel blandingen er avsatt. I en større dyr, omental vevet er mer omfattende og kan være sutured for å konstruere en eller flere poser øyene settes inn. Mus-omentum er skjør og godtar ikke lett suturer uten å bryte. Derfor brukes en hydrogel gjøre posen uten suturer.
Den første metoden (trinn 1.1-1,18), hydrogel brukes er en kjeller membran matrise og består av laminin, kollagen IV og vekstfaktorer. Det stivner som den varmes til kroppstemperatur. I den andre metoden (trinn 2.1-2,4), brukes en annen hydrogel består av 50U/mL trombin og 10 mg/mL fibrinogen. To forskjellige hydrogels brukes til å vise allsidighet av denne teknikken. Den kan tilpasses til å passe mange forhold og bevis på prinsippet. For klinisk bruk, om en sutured pose eller en klinisk-grade hydrogel brukes, teknikken kan kombineres med en minimal invasiv tilnærming, (f.eks., en endoskopisk metode for levering til omentum). Til dette målet kreves det ekstra studier bruker større pattedyr pre-klinisk modeller.
Tid til å normalisere blodsukkernivået i musen mottakerne etter transplantasjon i omentum i vår samt andre studier tyder på at øyene i omentum krever litt lengre tid å oppnå tilstrekkelig insulin produksjon. Revaskularisering effektiviteten synes å være en viktig faktor, som beskrevet i studien. Om tilstedeværelsen av en hydrogel påvirker hastigheten på Holme revaskularisering og ytelse, som gjenstår for å fastsettes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne rapporterer ikke interessekonflikter.
Acknowledgments
Noen av forfatterne av dette arbeidet ble støttes delvis av tilskudd fra nasjonale nøkkel R & D Program i Kina (2017YFC1103704), Sanming prosjektet medisin i Shenzhen (SZSM201412020), fondet for høyt nivå medisinsk disiplin konstruksjon i Shenzhen (2016031638), Shenzhen grunnlaget for vitenskap og teknologi (JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425110110658), Shenzhen grunnlaget for helse og familieplanlegging Commission (SZXJ2017021).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 5 inch (12-13 cm) Scissors | RWD Life Science | S12030-11 | |
| Fine Forceps | RWD Life Science | F11010-13 | |
| Small wound clips | RWD Life Science | R33003-01 | |
| Acutenaculum | RWD Life Science | F31044-13 | |
| 2 pair tissue forceps | RWD Life Science | F13023-10 | |
| 4-0 Suture with needle | Chenghe, China | 17094 | |
| 200 μL Pipette and tips | Gilson | PN11 | |
| One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system | Johnson & Johnson | 33391713 | |
| razor blade | Philips | HC1099/15 | |
| Material and animals | |||
| Pentobarbital Sodium | Sigmaaldrich.com | P3761 | For anesthesia |
| Hydrogel | bdbiosciences.com | 356234 | Basement Membrane Matrix |
| Fibrin-Thrombin Hydrogel | Baxter.com | 1501250 | Components clot when mixed |
| 70% Ethanol | Yingniu medical, Anhui, China | 23170608 | |
| Iodophor | Lierkang medical technology, Shangdong, China | 170521 | |
| Normal saline | Baxter.com | 2B1324 | |
| Cephalosporin | Lukang medical, Shangdong, China | 150303 | |
| Cefazolin | Baxter.com | 2G3508 | |
| lubricant eye ointment | Major Pharmaceuticals | 203964 | |
| streptozotocin | Sigmaaldrich.com | S0130 | |
| collagenase Type V | Sigmaaldrich.com | C9262 | |
| CMRL-1066 media | celltrans, Wenzhou, China | X018D1 | |
| histopaque | Sigmaaldrich.com | 10771 | density gradient |
| PE50 tubing | Braintreesci.com | PE50 100 FT | Polyethylene .023" x .038 |
| Calcein AM | Sigmaaldrich.com | C1359 | |
| Propidium iodide | Sigmaaldrich.com | P4864 | |
| optimal cutting temperature compound (OCT) | Tissue-Tek; Miles, Naperville, IL | 4583 | embedding medium |
| insulin antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 | 8138S | |
| hematoxylin staining media | Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 | 14166S | |
| eosin staining media | Beyotime Biotech, China | C0109 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific Inc. | D1306 | |
| C57Bl/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province | / | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| T175 flasks | Falcon | 353112 | |
| 1.5 mL Snap-top tubes | Axygen | MCT-150-C |
References
- Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes research and clinical practice. 103 (2), 137-149 (2014).
- Bellin, M. D., et al. Potent Induction Immunotherapy Promotes Long-Term Insulin Independence After Islet Transplantation in Type 1 Diabetes. American Journal of Transplantation. 12 (6), 1576-1583 (2012).
- Moberg, L., et al. Production of tissue factor by pancreatic islet cells as a trigger of detrimental thrombotic reactions in clinical islet transplantation. The lancet. 360 (9350), 2039-2045 (2002).
- Nilsson, B., Ekdahl, K. N., Korsgren, O. Control of instant blood-mediated inflammatory reaction to improve islets of Langerhans engraftment. Current Opinion in Organ Transplantation. 16 (6), 620-626 (2011).
- Bellin, M. D., et al. Similar islet function in islet allotransplant and autotransplant recipients, despite lower islet mass in autotransplants. Transplantation. 91 (3), 367-372 (2011).
- Bruni, A., Gala-Lopez, B., Pepper, A. R., Abualhassan, N. S., Shapiro, A. J. Islet cell transplantation for the treatment of type 1 diabetes: recent advances and future challenges. Diabetes, metabolic syndrome and obesity: targets and therapy. 7, 211 (2014).
- Shapiro, A. J., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nature reviews Endocrinology. 13 (5), 268-277 (2017).
- Cantarelli, E., Piemonti, L. Alternative transplantation sites for pancreatic islet grafts. Current diabetes reports. 11 (5), 364 (2011).
- Cantarelli, E., et al. Murine animal models for preclinical islet transplantation: no model fits all (research purposes). Islets. 5 (2), 79-86 (2013).
- Beli, E., et al. Erratum to: CX3CR1 deficiency accelerates the development of retinopathy in a rodent model of type 1 diabetes. J Mol Med (Berl). 95 (5), 565-566 (2017).
- Hafner, J., et al. Regional Patterns of Retinal Oxygen Saturation and Microvascular Hemodynamic Parameters Preceding Retinopathy in Patients With Type II Diabetes. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (12), 5541-5547 (2017).
- Schmidt, C. Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum. Nature Biotechnology. 35 (1), 82017 (2017).
- Voigt, M., et al. Prevalence and Progression Rate of Diabetic Retinopathy in Type 2 Diabetes Patients in Correlation with the Duration of Diabetes. Exp Clin Endocrinol Diabetes. , (2017).
- Baidal, D. A., et al. Bioengineering of an Intraabdominal Endocrine Pancreas. New England Journal of Medicine. 376 (19), 1887-1889 (2017).
- Espes, D., et al. Rapid restoration of vascularity and oxygenation in mouse and human islets transplanted to omentum may contribute to their superior function compared to intraportally transplanted islets. American Journal of Transplantation. , (2016).
- Berman, D. M., et al. Bioengineering the endocrine pancreas: intraomental islet transplantation within a biologic resorbable scaffold. Diabetes. 65 (5), 1350-1361 (2016).
- Delaune, V., Berney, T., Lacotte, S., Toso, C. Intraportal islet transplantation: the impact of the liver micro-environment. Transplant International. 30 (3), 227-238 (2017).
- Espes, D., et al. Rapid restoration of vascularity and oxygenation in mouse and human islets transplanted to omentum may contribute to their superior function compared to intraportally transplanted islets. American Journal of Transplantation. 16 (11), 3246-3254 (2016).
- Hajizadeh-Saffar, E., et al. Inducible VEGF expression by human embryonic stem cell-derived mesenchymal stromal cells reduces the minimal islet mass required to reverse diabetes. Scientific Reports. 5, (2015).
