Summary
A cápsula de polissacarídeo é o factor de virulência primária em Cryptococcus neoformans, e seu tamanho se correlaciona com a virulência da cepa. Medições de diâmetro da cápsula são usadas em testes fenotípicos e para avaliar a eficácia terapêutica. Aqui um método padrão de indução da cápsula é apresentado, e dois métodos de coloração e diâmetro de medição são comparados.
Abstract
A cápsula de polissacarídeo de Cryptococcus neoformans é o factor de virulência primário e um dos mais comumente estudados aspectos desta levedura patogênica. Tamanho da cápsula pode variar amplamente entre estirpes, tem a capacidade de crescer rapidamente quando introduziu a estressantes ou baixas condições de nutrientes e tem sido positivamente correlacionado com a virulência da cepa. Por estas razões, o tamanho da cápsula é de grande interesse para pesquisadores de c. neoformans . O crescimento da cápsula de c. neoformans é induzido durante os testes fenotípicos para ajudar a compreender os efeitos de diferentes tratamentos nas diferenças entre cepas de levedura ou tamanho. Aqui descrevemos um dos métodos padrão da cápsula da indução e comparar dois métodos aceites de coloração e medir o diâmetro da cápsula: (i) a tinta indiana, uma mancha negativa, usado em conjunto com microscopia de luz convencional e (ii) co-coloração com corantes fluorescentes da parede celular e cápsula seguido por microscopia confocal. Finalmente, mostramos como a medição do diâmetro da cápsula de amostras manchadas de tinta da Índia pode ser automatizado usando análise computacional de imagens.
Introduction
Afetando um quarto de milhão de pessoas todos os anos e resultando em mais de 180.000 mortes por ano, o Cryptococcus neoformans é uma levedura patogénica, intracelular e o agente causador da criptococose,1,2, 3. mais atingidas são os pacientes HIV-positivos em países pobres que não têm acesso à terapia anti-retroviral, tornando-os suscetíveis aguda para a doença4,5,6. Dados do CDC indicam que na África subsahariana, c. neoformans mata mais pessoas do que a tuberculose anualmente e mais a cada mês do que qualquer surto de Ebola no registro1. A via mais comum de exposição ocorre de inalar esporos dessecados que são comuns no ambiente7. Ao entrar nos pulmões, existem vários fatores de virulência que contribuem para o sucesso de c. neoformans dentro de indivíduos infectados. A cápsula de polissacarídeo é considerada fator de virulência primário do micróbio, acapsular cepas não são virulentas8.
A cápsula criptocócica é composta de três componentes do princípio: glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM) e mannoproteins (MPs)9. Enquanto o MPs são um componente relativamente menor associada a parede celular da cápsula, são imunogênicas e podem promover uma resposta principalmente pro-inflamatórios9,10. Em contraste, GXM e GalXM compõem a maior parte da cápsula (> 90% em peso) e tem efeitos imunossupressores11. Além de seus efeitos imunomoduladores, o rápido alargamento da cápsula na vivo cria uma barreira mecânica à ingestão por células fagocíticas (isto é, neutrófilos e macrófagos) do hospedeiro12. A cápsula de c. neoformans e sua síntese são complexas, mas em geral, maior diâmetro da cápsula está correlacionado com maior virulência6,13,14. Diante disso, é importante para os investigadores de c. neoformans ser capaz de rapidamente e com precisão quantificar as medições da cápsula.
Tanto a célula de c. neoformans e sua cápsula de polissacarídeo são estruturas dinâmicas e mostram as mudanças ao longo do tempo,15. A cápsula pode mudar em conjunto em resposta a alterações na host ambiente16,17,18, tamanho e densidade. Baixo ferro ou os níveis de nutrientes, a exposição ao soro, o pH fisiológico humano e aumento de CO2 são conhecidos para iniciar o crescimento da cápsula16,18,19,20. Além disso, pesquisadores demonstraram alterações estruturais, resultando em diferenças significativas na imunorreatividade durante uma infecção, emprestando uma vantagem para c. neoformans sobre seu hospedeiro21,22. Isto é sabido porque a arquitetura da cápsula de c. neoformans foi analisada em uma variedade de maneiras. Microscopia eletrônica, por exemplo, revelou que a cápsula tem uma matriz heterogêneo com uma camada interna de elétron-densas debaixo de uma camada externa, mais permeáveis23. Dispersão da luz e o uso de pinças ópticas permitiram pesquisadores elucidar ainda mais suas propriedades macromolecular24. Analisar os resultados de ambas as medições estáticas e dinâmicas de espalhamento de luz, sabemos que a cápsula de polissacarídeo tem um complexo de estrutura ramificação23. Pinça óptica têm sido utilizada para testar a rigidez da estrutura, bem como avaliar sua reatividade de anticorpos24. No entanto, de longe o mais frequentemente empregado análise da cápsula de c. neoformans é a medida do seu tamanho.
Para quantificar o tamanho da cápsula, os pesquisadores utilizam o que deveria ser uma simples medição: o diâmetro linear da cápsula. Microscópios digitais são usados para capturar imagens de várias células de c. neoformans (geralmente centenas) manchadas com tinta nanquim ou corantes fluorescentes. O tamanho de cada corpo celular e cápsula circundante é medido. Os dados são compilados, e o diâmetro médio da cápsula é calculado subtraindo-se o diâmetro do corpo celular do diâmetro celular (corpo celular + cápsula). Até este ponto, estas medições foram feitas manualmente. Enquanto geralmente exato, este método tem desvantagens para os investigadores. Grandes conjuntos de dados pode demorar dias ou até semanas para analisar com a mão. E porque essas medições são feitas manualmente, subjetividade e erro humano podem afetar o resultado.
Análise de imagem computacional automatizado tornou-se uma ferramenta indispensável para pesquisadores em muitas áreas da biologia celular molecular, permitindo a análise mais rápido e mais confiável de imagens biológicas 25,26,27. Técnicas de análise de imagem precisas são necessárias informações quantitativas de que muitas vezes são conjuntos de dados complexos e imensos o meu. No entanto, algumas medidas, especialmente a medição de c. neoformans cápsula, foram difíceis automatizar. Identificar com precisão a interface entre a parede celular e cápsula, que geralmente aparece como um anel escuro quando imaginada por microscopia de contraste de fase, pode ser problemático para resolver usando um simples limite. Além disso, as células de c. neoformans em cultura tendem a aglutinar-se e segmentação exata das células é necessária para medições precisas.
O objetivo deste projeto foi (i) ilustram um dos protocolos padrão para a indução da cápsula em c. neoformans, (ii) compara e contrasta Nanquim e fluorescência de coloração como dizem respeito para a cápsula de medições de diâmetro, (iii) desenvolver simples, métodos computacionais para medir o diâmetro da cápsula usando imagens da Índia tinta manchada células usando um software de análise de imagem e, (iv) avaliam as vantagens e limitações de medir o diâmetro da cápsula manualmente e usando o software de automação. Podemos achar que os dois métodos de coloração, fluorescentes de rotulagem da parede celular e cápsula, enquanto mais demorados, forneceu os resultados mais consistentes entre experiências. No entanto, ambos os métodos permitiram-nos com sucesso a distinguir entre o laboratório e clínica c. neoformans cápsula de cepas exibindo diferentes tamanhos. Além disso, fomos capazes de automatizar a medição do diâmetro da cápsula de tinta manchada imagens e achei que se tratava de uma alternativa viável para medição manual da cápsula.
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Protocol
Nota: C. neoformans é um patógeno de biossegurança nível 2 (BSL-2) e pesquisadores que trabalham com ela devem tomar as devidas precauções. Detalhada de procedimentos sobre como para com segurança trabalho com patógenos BSL-2 pode ser encontrado no Center for Disease Control (CDC) site, mas é importante notar que todas as pessoas que entram em contacto com o c. neoformans devem ser devidamente treinadas em manipulação os agentes patogénicos e deve usar sempre equipamento de protecção adequado (EPI), geralmente de látex ou luvas de nitrilo. Além disso, rotores em centrífugas devem ser selados para evitar clorofórmio de amostras e todos os derramamentos limpados imediatamente, usando uma solução de água sanitária 10%28.
1. cápsula indução
Nota: Todas as etapas devem ser executadas na temperatura de quarto a menos que indicado o contrário.
- Cultura de c. neoformans em caldo de dextrose (YPD) levedura peptona (pH 6.5 + /-0,2) e incubar a 37 ° C, com agitação até que estejam em fase de registro (aproximadamente 18-36 h).
- Centrifugar as células a 870 x g por 5 min a 21 ° C e lavar três vezes com solução salina tamponada fosfato (PBS).
- Use um hemocytometer (ou um contador de célula automatizada) para contar as células e ressuspender a 2 x 105 células/2 mL em media de essenciais mínimos de Dulbecco (DMEM).
- Para induzir a cápsula, incube a 37 ° C e 5% CO2 para 18 h.
Nota: A combinação de ausência de nutrientes na mídia e a presença de CO2 estimula o crescimento da cápsula de c. neoformans . - Pós-incubação, recolher as células por centrifugação (como acima) e remover todos, mas 5-10 µ l sobrenadante. Ao mesmo tempo, colha uma amostra de un-induzido célula correspondente para cada tensão a ser medido. Usá-los como controles negativos.
Nota: As pelotas de célula serão muito pequenas e podem ser difícil de ver. Tenha cuidado ao aspirar o sobrenadante. - Manchar com tinta nanquim (seção 2.1) ou corantes fluorescentes (seção 2.2).
2. coloração
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Coloração com apenas tinta nanquim
- Para manchar o fermento com tinta nanquim, resuspenda o pellet em restante sobrenadante e adicionar 4μL (aproximadamente metade) de suspensão de células e 4μL de tinta nanquim em uma lâmina de vidro de microscópio. Delicadamente, misture e evitar a formação de espuma.
- Uma lamela de vidro de 13 mm (espessura de 1.5 #) e selar as bordas com um selante atóxico (esmalte claro) para evitar que a amostra de secar.
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Coloração com apenas corantes fluorescentes
- Para manchar o fermento com um corante fluorescente, Ressuspender as células em 50 µ l PBS com 1% albumina de soro bovino (BSA).
- Incubar a cultura com um volume igual de Calcofluor white (CFW) (1 µ g/mL) e cápsula mAb 18B7 (ver Tabela de materiais) conjugada com AlexaFluor488 (AF488) (10 µ g/mL) por 30 min a 37 ° C.
- Centrifugar as células a 870 x g durante 5 min à pós-incubação de 21 ° C e aspire o sobrenadante.
- Resuspenda o pellet celular em 10 µ l PBS com 1% albumina de soro bovino (BSA).
- Pipete 8 µ l de suspensão de células sobre uma lâmina de vidro de microscópio.
- Uma lamela de vidro de 13 mm (espessura de 1.5 #) e selar as bordas com um selante atóxico (esmalte claro) para evitar que a amostra de secar.
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Coloração com tinta da Índia e corantes fluorescentes
- Para mais directamente comparar a eficácia de Nanquim mancha ao de corantes fluorescentes, co manche a mesma população de células com ambos os tipos de mancha. Para fazer isso, primeiro Incube as células com uma cápsula fluorescente e a mancha da parede celular, conforme os passos 2.2.1 - 2.2.3.
- Em seguida, pipetar volumes iguais (4 µ l) da suspensão de células coradas fluorescentemente e tinta nanquim numa lâmina de vidro. Misture suavemente.
- Uma lamela de vidro de 13 mm (espessura de 1.5 #) e selar as bordas com um selante atóxico (esmalte claro) para evitar que a amostra de secar.
3. imagem aquisição/microscopia
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Células de imagem manchada com tinta nanquim.
- Adquira imagens usando um microscópio de luz padrão (ampliação de 100 X).
- Imagem de um mínimo de 50 células por condição.
Nota: O número de células por campo irá variar, e isto é aceitável. É importante, no entanto, que se sobrepõem as células ser mantidos a um mínimo, como estes são difíceis de medir (manualmente e com o software automatizado). Para estas experiências, imagens foram adquiridas em uma profundidade de 16 bits com tempos de exposição otimizados para maximizar o contraste da imagem, minimizando o desfoque causado por pequenos movimentos das células.
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Imagem de células coradas com corantes fluorescentes
- Para as células de imagem por microscopia de fluorescência, abra o software de imagem de microscópio e selecione os apropriado da excitação e emissão de comprimentos de onda para o fluorophores usado (CFW e AF488 são animado usando o 405nm e luzes de 488 nm, respectivamente). Adquira imagens usando um microscópio de fluorescência.
- Imagem de um mínimo de 50 células por condição.
Nota: O número de células por campo irá variar, e isto é aceitável. É importante, no entanto, que se sobrepõem as células ser mantido no mínimo como estas são difíceis de medir (manualmente e com o software automatizado). - Adquira uma série de imagem de z-pilha das células para garantir que o diâmetro máximo da cápsula para cada célula dentro de um determinado campo é obtido.
- No software de controle do microscópio, clique na barra "z-pilha" para abrir o painel de controle "z-pilha" e, em seguida, seleccione a opção "Primeiro/último" no canto superior esquerdo do painel.
- Use o controle de foco fino no microscópio para se concentrar em um nível que está abaixo do ponto mais largo de uma célula de levedura única e as cápsulas para todos dentro do campo de visão atual e clique em "Definir primeiro".
- Use o controle de foco fino para foco acima do ponto mais largo do corpo celular da mesma célula e da cápsula para todas as células dentro do campo de visão atual e clique em "Definir ontem".
- Clique em "Iniciar o experimento" na guia "Aquisição" para adquirir a z-pilha para a posição atual. Repita o processo em várias posições até imagens de z-pilha mínima de 50 células foram adquiridas.
Nota: Para estas experiências, a pinhole confocal foi definido como 1.0 AU e uma sobreposição z-series de 10-20 fatias cobrindo 0,7 µM cada foram adquiridos nas posições selecionadas. AU = unidade arejada.
- Em seguida, converta cada série z-pilha em projeções de intensidade máxima (MIP) usando software de análise de imagem apropriado.
Nota: MIPs projetam a maior intensidade em cada plano da imagem empilhados29. Criação de MIPs permite produzir uma representação 2D de imagens que correspondem a célula máxima e o diâmetro da cápsula dentro da pilha 3D capturado.
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Células de imagem manchada com tinta nanquim e corantes fluorescentes
- Adquirir imagens usando widefield (ampliação de 40 X) ou um microscópio confocal (63 X ou ampliação de 100 X). Para células manchadas com tinta nanquim e corantes fluorescentes, capture imagens usando um microscópio widefield equipado com um palco controlado por computador e objectivo de imersão de óleo.
Nota: O microscópio em uso deve ser controlado usando um software de imagem CFW. fluorescência que é excitado através de um filtro de excitação 340-380 nm e emitida a luz deverá ser detectada através de um filtro de barreira 435-485 nm reflectido a partir um espelho dicroico 400 nm. AF488 fluorescência pode ser excitada por um filtro de excitação 465-495 nm, e a luz emitida pode ser detectada através de um filtro de barreira 515-555 nm reflectido a partir um espelho dicroico 505 nm. - Um mínimo de 50 células por condição para cada método de coloração de imagem.
- Adquirir imagens usando widefield (ampliação de 40 X) ou um microscópio confocal (63 X ou ampliação de 100 X). Para células manchadas com tinta nanquim e corantes fluorescentes, capture imagens usando um microscópio widefield equipado com um palco controlado por computador e objectivo de imersão de óleo.
4. manual medição da cápsula
- Para células manchadas com tinta nanquim ou fluorescentes manchas, usar um software de medição de célula para manualmente medida cápsula e célula de diâmetro (ver Tabela de materiais). Para fazer isso, vá em "Arquivo" > "Abrir imagem" > "Medida" e use o cursor para desenhar uma linha reta através do ponto mais largo da célula inteira (diâmetro total).
- Em seguida, clique novamente em "Medida" e desenhar uma linha reta através do corpo celular (diâmetro do corpo da célula).
Nota: As medições são salvos automaticamente para as células. - Repita este processo para todas as células (mínimo de 50/grupo).
- Para salvar imagens, uma vez que eles são medidos, clique em "Arquivo" > "Salvar como" e nomeie as imagens apropriadamente.
- Selecione os arquivos recentemente medidos e exportar dados para um software de planilha eletrônica.
- Calcule o diâmetro médio da cápsula usando a equação: ([diâmetro total] - [corpo celular de diâmetro]).
5. automáticos de medição da cápsula
Nota: Para a medição automatizada bem sucedida, usar imagens de 16 bits com um alto nível de contraste e que estão focados corretamente junto com um software de análise de imagem apropriada (consulte a Tabela de materiais). Quando a imagem de c. neoformans para medição da cápsula, é importante concentrar-se no anel escuro na fronteira entre a parede celular e cápsula. Isso permite que o software corretamente delinear da célula e cápsula.
- Inverter e criar uma cópia de toda Índia tinta manchada imagens de célula, usando um software de edição de imagem apropriado (consulte a Tabela de materiais). Para fazer isso, clique em "Arquivo" > "Open" para abrir a Índia tinta manchada imagens e depois "Control" + "I" para inverter a imagem. Clique em "Arquivo" > "Salvar como" para salvar a imagem invertida.
- Para importar o original e invertido imagens no software clique em "Arquivo" > "Importar sequência" > "Carregar imagem" > "Definir sequência (manualmente)" > "Dimensões (canal)" > "Importar" > "Aplicar".
Nota: Os corpos de células de c. neoformans e cápsulas podem ser identificadas e mascarados usando algoritmos específicos - conhecidos como 'Receitas' - incluídas no software. - Use a receita de 'Analisador de Colônia (fluorescência)' na imagem invertida para detectar e mascarar o corpo da célula e, em seguida, clique em "aplicar". A imagem invertida, o anel escuro, definir os limites da célula de c. neoformans torna-se mais brilhante do que a cápsula circundante.
- Use a receita de 'Analisador de Colônia (fluorescência)' na imagem invertida para segmentar os corpos de células de c. neoformans de suas cápsulas e, em seguida, clique em "aplicar". Isso cria uma máscara de contagem. Renomear esta máscara de contagem "Corpo celular" clicando na guia rotulada "máscara de contagem".
Nota: A receita é composta de várias etapas de processamento de imagem: remoção, detecção de objeto, separação do objeto e filtragem de subconjunto de fundo. - Em seguida, usar a receita de 'Proliferação celular' na imagem original para detectar e mascarar a cápsula e clique em "aplicar". Isso cria uma máscara de contagem. Renomear esta máscara de contagem "Cápsula" clicando na guia rotulada "máscara de contagem".
- Usando a receita, 'Cápsula partição', crie uma nova máscara na imagem original para particionar cápsulas adjacentes entre si. Para fazer isso, clique em "Partição de cápsula" no menu suspenso de receita. Na caixa de partição de cápsula, escolha a máscara de contagem agora renomeado "Cápsula" (5.5) para a região da cápsula. Escolha a máscara de contagem agora renomeado "Corpo celular" para células Crypto (5.4). Escolha "Original" para o canal de entrada e "criar máscara para Partitioned cápsula. Clique em "Apply
Nota: A receita gera células e diâmetro da cápsula, definido como a média dos eixos mais longas e mais curtos atravessando o centro da célula e cápsula e medições de área de máscaras de deteção. Encontre a saída que está localizada na guia planilha neste software. Repita este processo para todas as imagens (mínimo de 50 células/grupo). Parâmetros da receita poderiam ser ajustados para otimizar a deteção de imagens individuais ou otimizados para a deteção de lote de várias imagens. Medidas adicionais podem ser calculadas pela receita para a caracterização completa da célula e morfologia da cápsula. - Exporte dados para um software de planilha de escolha para posterior análise.
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Representative Results
Para ilustrar a indução da cápsula, coloracao celular, imagens e técnicas de medição, usamos três estirpes de c. neoformans: Coe o laboratório comum, bem caracterizado, H99S30e duas cepas isoladas clinicamente de anteriormente diâmetro da cápsula desconhecido, B18 e B5231.
O fluxo de trabalho de indução da cápsula, coloração e aquisição de imagens usando tinta de India é mostrado na figura 1A. Imagens tiradas de todas as três estirpes são mostradas na figura 1B , pré e pós-indução. O pesquisador saberá se a indução da cápsula foi um sucesso, comparando as células que sofreram indução da cápsula para aqueles da mesma cultura que não tenham. Um aumento de tamanho de clara é geralmente aparente na pós-indução da maioria das cepas, embora algumas cepas irão expor naturalmente pequenas cápsulas, mesmo após a indução (ver imagens do B18 na figura 1B). Note-se que a indução da cápsula falhará se mídia rica residual não é removida antes da indução ou se não houver CO2 . Nestes casos, serão observados apenas modestos (se houver) aumentos no tamanho da cápsula. Diâmetros de todas as três estirpes foram medidos manualmente e os resultados são mostrados na Figura 1. Em dois dos três experimentos, não houve diferença de tamanho entre H99S e B18. No entanto, uma diferença significativa no tamanho foi consistentemente observada entre a maior tensão, B52 e H99S e B18 (p < 0,001 e p < 0,001, respectivamente, padrão mínimo quadrados testar com contrastes simples, tamanho da amostra = 50 células/tensão ).
Figura 2A mostra o fluxo de trabalho de indução da cápsula, coloração e aquisição de imagens usando dois corantes fluorescentes, um para a cápsula (18B7-AF488) e outro para a parede celular (Calcofluor White). Imagens foram capturadas como z-pilhas para todas as três estirpes pós-indução, garantindo que o diâmetro máximo de cápsula e corpo celular foi capturado para cada célula a ser medido (Figura 2B). Cada pilha-z foi processada para produzir projeções de intensidade máxima, comprimindo a pilha 3-dimensional em uma imagem 2D antes da análise (Figura 2). Estas foram então medidas manualmente (Figura 2D). Ao contrário as medições para a Índia tinta manchada de células, o fluorescente coloração habilitado nos para discriminar entre todas as três estirpes com base na sua cápsula diâmetro em todos os três se repete do experimento. Aqui, descobrimos que o B18 tinham o menor diâmetro da cápsula e B52 maiores (p < 0,001 para todas as comparações, teste padrão mínimos quadrados com efeitos simples, tamanho da amostra = 50 células/tensão).
Para avaliar os dois métodos de coloração de c. neoformans cápsula, medições de todas as três estirpes foram comparadas. Não houve diferença significativa entre os tamanhos da cápsula determinado usando os dois métodos de coloração (Figura 3A) (ANOVA multivariada com efeitos simples, tamanho da amostra = 50 células/tensão). Esta conclusão é consistente com os resultados de uma experiência separada onde a tensão de laboratório, H99S, foi co manchado com tinta de India e corantes fluorescentes (Figura 3B-C). No entanto, houve maior variabilidade entre experiências usando tinta da Índia, como evidenciado pelo fato de que apenas um dos três experimentos mostraram uma diferença significativa no tamanho da cápsula entre H99S e B18, em comparação com a diferença significativa observada entre estas linhagens em todos os três experimentos fluorescentes (Figura3D-E) (ANOVA multivariada com efeitos simples, tamanho da amostra = 50 células/tensão).
Tinta nanquim manchada imagens que atenderem aos critérios constantes do protocolo (secção 5) pode ser medida usando um sistema automatizado. O fluxo de trabalho mostrado na Figura 4A guias o usuário pelas etapas necessárias para utilizar as receitas projetado para medir a cápsula de c. neoformans . Depois de desenvolver o fluxo de trabalho, que foi validada por um cache de imagens já existentes de células de c. neoformans por três pesquisadores utilizando métodos manuais e automatizados de medição. Não havia diferenças significativas entre medições do pesquisador quando feita manualmente, e isso também era verdade quando as medições foram feitas usando software de análise de imagem automático (Figura 4B) (ANOVA, tamanho da amostra = 50 células/pesquisador). No entanto, havia um pequeno mas diferença significativa no tamanho da cápsula relatados entre os dois métodos ANOVA (Figura 4), tamanho da amostra = 150 células/grupo. Diâmetro da cápsula foi consistentemente ligeiramente menor quando medido através de automação de medição manual (0,3 µm, p < 0,001). Além disso, ao comparar entre medições do tamanho da cápsula feitas por pesquisadores separados dos mesmos conjuntos de imagem, o erro-padrão era menor quando o software de análise de imagem foi utilizada para a quantificação em vez de métodos manuais, que é sugestivo de mais medições precisas, reprodutíveis, usando o método automatizado. Para a medição automatizada bem sucedido, células devem estar em foco, ter um meio de grande cápsula e não ser excessivamente em cluster (Figura 4). Nós achamos que imagens mal concentradas de células em cluster com pequenas cápsulas poderiam não ser automaticamente medidas no software. No entanto, afirmamos que estes também podem ser difíceis de medir com precisão usando métodos manuais.
Figura 1 : Tinta nanquim mancha para medir C. neoformans cápsula. () Representação esquemática de c. neoformans cápsula medida pela mancha de tinta nanquim. Em breve, expressão da cápsula é induzido usando a privação de nutrientes e exposição ao CO2, as células são resuspended em tinta nanquim e montadas em lâminas de vidro. Imagens de células coradas são adquiridas por microscopia de luz, com campos que também selecionados pelo usuário ou por telha-digitalização usando um palco controlado por computador. Imagens podem ser analisadas manualmente ou processadas para análise e segmentação de imagens automatizados. (B) imagens da estirpe de laboratório comum, H99S e duas estirpes clínicas, B18 e B52, pré e pós-cápsula de indução. Barras de escala representam 10 µm (C) gráfico de um representante experiência apresentando diâmetro da cápsula de todas as três estirpes manchado com tinta de India e medido manualmente (o erro é representado como erro padrão (SE)). Significância estatística é indicada da seguinte forma: *, p < 0,05; * *, p < 0,01; e * * *, p < 0,001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Coloração fluorescente para medir C. neoformans cápsula. (A) representação esquemática de c. neoformans cápsula medida pelo Calcofluor White (CFW) e coloração de 18B7-AF488 co. Após a indução da cápsula e coloração, as células são montadas e fotografadas por laser, microscopia confocal. Como as células podem ser em diferentes planos focais, z-pilhas são adquiridos em cada posição. Estas são processadas para produzir projeções de intensidade máxima que podem ser usadas para medir com precisão o diâmetro máximo da cápsula para cada célula. (B) Imagens da estirpe de laboratório comum, H99S e duas estirpes clínicas, B18 e B52, pós-cápsula de indução. Nota: Escala barras representam 10 µm para todas as imagens. Máximo (C) projeções de intensidade de fluorescente etiquetado células de c. neoformans . (D) Gráfico de um experimento representativo mostrando manualmente medido o diâmetro da cápsula de todas as três estirpes manchado com CFW e 18B7-AF488 (o erro é representado como erro padrão (SE)). Significância estatística é indicada como segue: *, p < 0,05; * *, p < 0,01; e * * *, p < 0,001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Comparação dos resultados entre tinta nanquim e coloração fluorescente. (A) análise de três cepas de c. neoformans manchado com tinta nanquim ou corantes fluorescentes, n = 3 (o erro é representado como erro padrão (SE)). (B) imagens de uma única célula de c. neoformans manchado com tinta de India e os dois corantes fluorescentes (barra de escala representa 13 µm). Linhas horizontais demarcam as bordas da cápsula e as linhas verticais demarcam as bordas do corpo celular. (C) quantificação de um experimento representativo de H99S co manchado com tinta de India e corantes fluorescentes (o erro é representado como erro padrão (SE)). (D, E) Representação da variabilidade de diâmetro da cápsula entre experimentos de Nanquim (D) e experimentos fluorescentes (E). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Análise computacional de C. neoformans diâmetro da cápsula de imagens da Índia tinta manchada células. (A) representação esquemática de segmentação de imagens e medição de cápsula de c. neoformans usando uma técnica de medição automatizada (ver Tabela de materiais). (B) comparação das medições da cápsula, interpretada por 3 investigadores separados usando métodos automatizados (Automated 1-3) e manual (Manual 1-3). Cada investigador usado um cache idêntico de c. neoformans imagens por ambos os métodos (o erro é representado como StDev). (C) combinado com média de medição manual e automatizadas medições (erro é representado como erro padrão (SE)). Exemplos de ambos ideal (D) e (E) imagens de não-ideal de c. neoformans. Imagens de non-ideal não podem ser medidas com sucesso no software. Significância estatística é indicada da seguinte forma: *, p < 0,05; * *, p < 0,01; e * * *, p < 0,001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Durante décadas, a cápsula tem sido um grande foco de pesquisa para os micologistas e clínicos interessados em c. neoformans e criptococose devido ao seu papel como um fator de virulência principais para o patógeno. Usando microscopia para medir diferenças no tamanho da cápsula entre estirpes e sob crescimento diferente condições podem fornecer informações importantes sobre o patógeno e suas respostas aos diversos estímulos (ou seja, diferentes condições ambientais, tratamentos com drogas potenciais, etc.) aqui, descrevemos um método para induzir o crescimento da cápsula em c. neoformanse comparados dois diferentes protocolos de coloração de cápsula. Finalmente, mostramos como o software de análise de imagem pode ser usado para automatizar a medição do diâmetro da cápsula de imagens da Índia tinta manchada células, produzindo resultados que eram comparáveis aos métodos de medição manual.
Em nossos experimentos, comparamos duas estirpes clínicas, B18 e B52, com H99S, uma estirpe de laboratório padrão de tamanho conhecido de cápsula18. Coloração de ambos os métodos mostraram que a cepa clínica, B52, tinha o maior diâmetro da cápsula das três cepas testadas. No entanto, os resultados de medições fluorescentes foram capazes de discernir a diferença entre as duas variedades com menor tamanho da cápsula onde medições de tinta da Índia não eram. Os resultados de ambos os métodos de coloração foram consistentes, sugerindo que ambos são válidos, mas que usando imagens de fluorescente manchadas c. neoformans podem permitir aumento da sensibilidade na medição de tensões com a pequena cápsula. Usando projeções máximos geradas a partir de imagens de z-pilha de fluorescente células coradas permite que os pesquisadores assegurar que as medições do exato diâmetro da cápsula podem ser feitas mesmo quando as células de imagens estão em planos focais diferentes. Estas medidas são mais difíceis para c. neoformans fotografada usando tinta de India e de microscopia de luz padrão. Em qualquer imagem, células adjacentes podem sentar-se em ligeiramente diferentes planos focais, tornando-se difícil de resolver com precisão o limite do corpo celular-cápsula para todas as células. Isto possivelmente poderia confundir a capacidade dos investigadores de detectar pequenas alterações no tamanho da cápsula ou pequenas diferenças entre cepas.
Cada método tem suas próprias vantagens inerentes. Tinta de India é o mais comumente usada por pesquisadores por causa da sua acessibilidade, facilidade de uso e estabilidade (não degradar ao longo do tempo como podem algumas manchas fluorescentes). Porque a tinta nanquim é uma mancha negativa, simples que pode ser usada em conjunto com microscópios de luz padrão, que são mais acessíveis do que os microscópios fluorescentes. No entanto, se não usado nas proporções corretas (tinta: tampão de India), a mancha pode criar um fundo de "penas" quando imaginada, que pode complicar a análise automatizada de imagens. Enquanto caro e mais demorado para usar, corantes fluorescentes podem ser vantajosas para a sua flexibilidade, e como nós mostramos, sua sensibilidade. Eles são particularmente úteis para a medição da cápsula fardo de tamanho e célula em experimentos envolvendo o c. neoformans têm sido fagocitados por células do sistema imunológico e necessários para o exame histológico de c. neoformans cápsula em amostras de tecido (uma técnica não descrita neste artigo)32. Se a coloração com corantes fluorescentes, tais como o calcofluor branco ou anti-GXM fluorescente etiquetado anticorpos, é problemática (p. ex., insuficiente a coloração), isso geralmente pode ser superado através da otimização do protocolo de coloração (aumentar/diminuir o concentração e/ou incubação tempo com a tintura).
Independentemente da metodologia de coloração, encontramos que a indução da cápsula e captura de imagem apropriada são passos críticos no protocolo. O protocolo descrito neste documento é um dos vários métodos padrão para a indução da cápsula em c. neoformans e tem sido utilizado com sucesso em laboratórios de levedura para muitos anos23. Indução da cápsula de c. neoformans é CO2-dependente e ocorre somente sob condições estressantes23,33. Portanto, é fundamental que ocorre em uma 5% CO2 incubadora usando um meio de crescimento deficiente nutrientes adequados. Se suspeita essa cápsula não tem sido induzida após um período padrão de incubação (geralmente 18-24 h), as células devem ser comparadas a uma cultura de controle uninduced que não foi exposta a condições estressantes. Comparar os dois determinará se a indução foi eficaz. Uma indução bem-sucedida é um em que a maioria das células fazer uma cápsula maior, em comparação com o controle uninduced. Porque não todas as células irão induzir, as células a ser medido devem ser uma representação heterogênea de células disponíveis.
A importância da aquisição de imagem consistente não pode ser exagerada, especialmente se automáticos de medição é o objetivo. Foco, contraste, fluorescência do fundo, bem como a profundidade de bits e imagem compressão dos arquivos é considerações importantes. Quando possível, devem ser evitados grandes aglomerados de células que não se sentam em um único plano focal, embora alguns brotamento e tocando as células são aceitáveis e podem ser inevitáveis (esta regra deve ser seguida para medição manual e automatizada). Este problema pode ser contornado até certo ponto quando usar imagem confocal de fluorescente manchado de células. O uso de z-pilhas para produzir projeções de intensidade máxima pode permitir uma medição precisa de células em diferentes planos focais de uma única imagem29. Além disso, imagens devem ser adquiridas rapidamente após a preparação da amostra. Isto pode ser particularmente importante para a Índia tinta manchada amostras como quando eles começam a secar, pode diminuir o contraste entre os elementos de background e foreground (as células) e características indesejáveis de fundo podem ser melhoradas, o que leva à reduzida automatizado precisão da segmentação.
Embora as medições de diâmetro da cápsula são comuns na Comunidade de c. neoformans , até agora eles normalmente realizados manualmente, que requer considerável tempo e recursos humanos. No entanto, medição manual é aceitos no campo e resultados podem ser obtidos à custa pouco. Avanços em software de análise de imagem tornaram possível dar os primeiros passos em direção a automatizar estas medições. A simples natureza do corpo celular de c. neoformans e cápsula - aparecendo como um círculo dentro de um círculo - em imagens 2D faz a medição de seus tamanhos relativamente simples para pacotes de software de segmentação de imagem automatizada, sem a necessidade de desenvolver o romance algoritmos. Em vez disso, vinculando-se algoritmos existentes, cápsulas e células de c. neoformans podem ser detectadas, segmentadas e medidas. Usando essa abordagem, nós automatizamos as medições do diâmetro da cápsula de c. neoformans para células manchadas com o mais comumente utilizado cápsula corante, tinta da Índia e compararam esses para medição manual para os mesmos conjuntos de dados. Este método oferece o benefício de reprodutibilidade e retirando muito do erro humano associado com a medição manual, poupando o tempo do pesquisador. Além disso, medidas adicionais podem ser incorporadas com o mínimo esforço do fluxo de trabalho de análise automatizada. Nós sentimos que a análise automatizada de imagem é uma abordagem promissora que permite que os pesquisadores medir um grande número de c. neoformans cápsula com um alto grau de precisão e eficiência.
No geral, Nós demonstramos como induzir o crescimento da cápsula em c. neoformans, manchar as amostras com tinta nanquim ou corantes fluorescentes e medir o diâmetro da cápsula usando medições manuais e automatizadas em uma análise de imagem com êxito software. Nossos resultados sugerem que os dois métodos de coloração são viáveis e geralmente produzem resultados consistentes (embora haja mais variabilidade com medições de Nanquim). Além disso, métodos manuais e automatizados de medição têm a capacidade de discernir diferentes tamanhos da cápsula.
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Disclosures
O autor, Hoyin Lai, é o gerente de produto na DRVision que publica o software de análise de imagem automático, Aivia.
Acknowledgments
Agradecemos o programa de doutorado de Biociências moleculares (MOBI) e o departamento de biologia na Universidade meio de estado de Tennessee (MTSU) para fornecer o financiamento para este estudo. O projeto também foi financiado em parte por uma concessão de projetos especiais, atribuída a D.E.N. pela Fundação MTSU.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Capsule Induction | |||
| C. neoformans cells | The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University). The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania). | ||
| Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD) | Fisher Scientific | DF0428-17-5 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O) | ||
| DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | |
| 6-well plates | Falcon | CL5335-5EA | |
| Shaking incubator | Thermo Scientific | MaxQ6000 | |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | Isotemp | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Legend XTR | |
| Staining | |||
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Legend Micro 21R | |
| India ink | Fisher Scientific | 14-910-56 | |
| Calcofluor white | Sigma-Aldrich | 18909-100ML-F | |
| 18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488 | A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University) | ||
| PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA) | PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized. | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Glass coverslips | Corning | 2855-18 | #1.5 thickness |
| Clear nail polish or other non-toxic sealant | |||
| Image Acquisition | |||
| Immersion oil | Cargille | 16484 | |
| Light microscope with immersion oil objective | Zeiss | Zeiss Axio A1 with a Plan - NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective | |
| Light microscope camera | Zeiss | Zeiss Axiocam ErCD camera | |
| Confocal microscope with oil immersion objective | Zeiss | LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective. | |
| Confocal microscope software | Zen 2009 | ||
| Confocal microscope camera | Nikon | Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer. | |
| Widefield imaging software | Nikon Elements (Nikon) | ||
| Capsule Measurement | |||
| Image editing software | Photoshop (Adobe) | ||
| Microscope software for manual measurement | Axiovision (Carl Zeiss) | ||
| Image analysis software for automated meesurement | Aivia (DRVision Technologies) | ||
| Spreadsheet software | Excel (Microsoft) |
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