Summary
De polysaccharide capsule is de primaire virulentiefactor in Cryptococcus neoformans, en haar grootte correleert met de virulentie van de stam. De diameter van de capsule metingen worden gebruikt bij het testen van de fenotypische en te meten van de therapeutische werking. Hier een standaardmethode van capsule inductie wordt gepresenteerd, en twee methoden van kleuring en het meten van de diameter worden vergeleken.
Abstract
De polysaccharide capsule van Cryptococcus neoformans is de primaire virulentiefactor en een van de meest algemeen studeerde aspecten van deze pathogene gist. Capsule grootte sterk kan verschillen tussen stammen, heeft de mogelijkheid om snel te groeien wanneer ingevoerd om stressvolle of lage nutriënten voorwaarden en heeft al positief gecorreleerd met de virulentie van de stam. Om deze redenen is de grootte van de capsule van groot belang voor C. neoformans onderzoekers. De groei van de C. neoformans capsule wordt veroorzaakt tijdens de fenotypische test om te helpen begrijpen van de effecten van verschillende behandelingen op de gist of grootte verschillen tussen stammen. Hier beschrijven we een van de standaardmethoden voor capsule inductie en Vergelijk twee aanvaarde methoden van kleuring en het meten van de diameter van de capsule: (i) Oost-Indische inkt, een negatieve vlek, gebruikt in combinatie met de lichte microscopie van conventionele en (ii) mede kleuring met fluorescente kleurstoffen van zowel de celwand en de capsule gevolgd door confocale microscopie. Tot slot laten we zien hoe de meting van de diameter van de capsule van de Oost-Indische inkt gebeitste monsters kan worden geautomatiseerd met behulp van computationele beeldanalyse.
Introduction
Invloed zijn op een kwart miljoen mensen per jaar, wat resulteert in meer dan 180.000 doden jaarlijks is Cryptococcus neoformans een pathogene, intracellulaire gist en de verwekker van cryptococcosis1,2, 3. zwaarst getroffen zijn HIV-positieve patiënten in arme landen die niet hebben klaar toegang tot antiretrovirale therapie, waardoor ze zeer gevoelig voor de ziekte4,5,6. Gegevens van de CDC blijkt dat in sub-Saharisch Afrika, C. neoformans meer mensen dan tuberculose jaarlijks en meer elke maand dan een Ebola-uitbraak op record1 doodt. De meest voorkomende route van blootstelling treedt op tegen het inademen van gedroogde sporen die gemeengoed in de omgeving-7 zijn. Bij binnenkomst van de longen, zijn er verschillende Virulentiefactoren die aan het succes van C. neoformans binnen besmette personen bijdragen. De polysaccharide capsule wordt beschouwd als de microbe van primaire virulentiefactor, aangezien acapsular stammen niet virulente8.
De cryptococcal capsule bestaat uit drie onderdelen van het principe: glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM), en mannoproteins (MPs)9. Terwijl MPs een relatief kleine celwand-geassocieerde onderdeel van de capsule zijn, ze zijn immunogeen en een meestal pro-inflammatoire respons9,10kunnen bevorderen. In tegenstelling, GXM en GalXM maken het grootste deel van de capsule (> 90% van het gewicht) en immunosuppressieve effecten11hebben. Naast de immunomodulerende gevolgen ervan creëert de snelle uitbreiding van de capsule in vivo een mechanische barrière naar inname door gastheer fagocytische cellen (dat wil zeggen, neutrofielen en macrofagen)12. De capsule C. neoformans en de synthese zijn complex, maar overall, verhoogde capsule diameter is gecorreleerd met verhoogde virulentie6,13,14. Gezien dit, is het belangrijk voor C. neoformans onderzoekers om snel en nauwkeurig kwantificeren capsule metingen te kunnen.
Zowel de cel C. neoformans en haar polysaccharide capsule zijn dynamische structuren en wijzigingen weergeven over tijd15. De capsule kunt wijzigen in dichtheid, de grootte en vergadering in reactie op veranderingen in het ontvangende milieu16,17,18. Laag ijzer of nutriëntengehalten, blootstelling aan serum, de menselijke fysiologische pH en verhoogde CO2 zijn bekend tot capsule groei16,18,19,20. Verder, onderzoekers hebben aangetoond structurele veranderingen ten gevolge aanzienlijke verschillen in de immunoreactivity tijdens een infectie, leningen een voordeel aan C. neoformans over de Heerscharen21,22. Dit is bekend omdat de architectuur van de capsule C. neoformans heeft geanalyseerd in een verscheidenheid van manieren. Elektronenmicroscopie, bijvoorbeeld, is gebleken dat de capsule een heterogene matrix met een elektron-dichte binnenlaag onder een buitenste, meer doorlatende laag23 heeft. Lichtverstrooiing en het gebruik van optisch pincet hebben onderzoekers verder het ophelderen van de macromoleculaire eigenschappen24toegestaan. Het analyseren van de resultaten uit beide metingen van statische en dynamische lichtverstrooiing, weten we dat de polysacharide capsule een complexe vertakkende structuur23 heeft. Optisch pincet zijn gebruikt om de test van de stijfheid van de structuur, alsmede het evalueren van de antistof reactiviteit24. Maar is verreweg het vaakst werkzaam analyse van de capsule C. neoformans de meting van de grootte.
Om te kwantificeren capsule grootte, onderzoekers gebruiken wat moet een eenvoudige meting: de lineaire diameter van de capsule. Digitale microscopen worden gebruikt om beelden van meerdere C. neoformans cellen (in het algemeen honderden) gekleurd met Oost-Indische inkt of fluorescente kleurstoffen te vangen. De grootte van elke cel lichaam en omliggende capsule wordt gemeten. De gegevens zijn samengesteld, en de gemiddelde diameter van de capsule wordt berekend door de diameter van de cel lichaam van de diameter van de gehele cel (cel lichaam + capsule) af te trekken. Tot dit punt, zijn deze metingen gedaan handmatig. Terwijl in het algemeen nauwkeurig, heeft deze methode nadelen voor onderzoekers. Grote gegevenssets kunnen nemen dagen of zelfs weken te analyseren met de hand. En omdat deze metingen zijn handmatig gedaan, subjectiviteit en menselijke fouten het resultaat kunnen beïnvloeden.
Geautomatiseerde computationele beeldanalyse is een onmisbaar hulpmiddel geworden voor onderzoekers op vele terreinen van moleculaire celbiologie, waardoor snellere en meer betrouwbare analyse van biologische beelden 25,26,27. Nauwkeurige beeld analysetechnieken zijn nodig om de kwantitatieve gegevens uit wat vaak complexe en enorme gegevenssets zijn. Echter, sommige metingen, met name het meten van C. neoformans capsule, moeilijk geweest te automatiseren. De interface tussen de celwand en capsule, die over het algemeen wordt weergegeven als een donkere ring wanneer beeld door fase contrast microscopie, nauwkeurig te identificeren kan worden lastig op te lossen met behulp van een eenvoudige drempel. Verder, C. neoformans cellen in cultuur de neiging om het groepje samen en nauwkeurige segmentatie van de cellen is noodzakelijk voor nauwkeurige metingen.
Het doel van dit project was om (i) illustreren een van de standaard protocollen voor capsule inductie in C. neoformans, (ii) vergelijken en contrast Oost-Indische inkt en fluorescentie kleuring als ze betrekking hebben om de capsule van de diameter van de metingen, (iii) de ontwikkeling van eenvoudige, computationele methoden voor het meten van de diameter van de capsule met behulp van beelden van de Oost-Indische inkt gekleurd cellen met behulp van de software van de analyse van een afbeelding, en (iv) beoordeling van de voordelen en beperkingen van het meten van de diameter van de capsule handmatig en met behulp van de software automation. Wij vinden dat de kleuring gemakkelijkst, fluorescerende etikettering van de celwand en capsule, terwijl meer tijd in beslag, de meest consistente resultaten tussen experimenten opgeleverd. Echter beide methoden ingeschakeld ons succesvol onderscheiden tussen lab en klinische C. neoformans capsule spanningen vertonen verschillende maten. Verder konden we automatiseren de meting van de diameter van de capsule van de Oost-Indische inkt gekleurde beelden en vond dat dit een levensvatbaar alternatief voor handmatige meting van de capsule.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: C. neoformans is een ziekteverwekker Biosafety Level 2 (BSL-2) en onderzoekers die werken met het juiste voorzorgsmaatregelen moeten nemen. Gedetailleerde procedures over hoe te veilig werken met BSL-2 ziekteverwekkers kan worden gevonden op het Center for Disease Control (CDC) website, maar het is belangrijk op te merken dat alle personen die in contact C. neoformans komen goed moeten worden opgeleid in behandeling ziekteverwekkers en altijd passende persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), over het algemeen latex of nitril handschoenen moet dragen. Verder moeten de rotoren op centrifuges om te voorkomen dat aerosolization van monsters en eventuele lekkages opgeruimd onmiddellijk met behulp van een 10% bleekwater oplossing28worden verzegeld.
1. de capsule inductie
Opmerking: Alle stappen moeten worden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld.
- C. neoformans in Gist-pepton dextrose (YPD) Bouillon (pH 6,5 +/-0.2) cultuur en Incubeer bij 37 ° C met schudden tot ze in logboek fase (ongeveer 18-36 h).
- Centrifugeer cellen bij 870 x g gedurende 5 minuten bij 21 ° C en spoel driemaal met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Gebruik een hemocytometer (of een geautomatiseerde cel teller) om te rekenen van de cellen en resuspendeer bij 2 x 105 cellen/2 mL in Dulbecco van minimale essentiële media (DMEM).
- Om de capsule, Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 voor 18u.
Opmerking: De combinatie van het ontbreken van voedingsstoffen in de media en de aanwezigheid van CO2 C. neoformans capsule groei stimuleert. - Na incubatie, oogsten van de cellen door centrifugeren (zoals hierboven) en het verwijderen van alle, maar 5-10 µL supernatant. Op hetzelfde moment, de oogst een overeenkomstige un-geïnduceerde cel steekproef voor elke spanning te meten. Gebruik deze als negatieve controles.
Opmerking: De cel pellets zullen zeer klein en moeilijk te zien. Wees voorzichtig bij het zuigen supernatant. - Vlek met Oost-Indische inkt (punt 2.1) of fluorescente kleurstoffen (punt 2.2).
2. kleuring
-
Kleuring met alleen Oost-Indische inkt
- Om de gist met Oost-Indische inkt vlekken, resuspendeer de pellet in het resterende supernatant en toevoegen van 4μL (ongeveer de helft) van celsuspensie en 4μL voor Oost-Indische inkt op een glasplaatje Microscoop. Voorzichtig mengen en Vermijd schuimvorming.
- Breng een dekglaasje van 13 mm glas aan (#1.5 dikte) en verzegel randen met een niet-toxisch sealant (duidelijk nagellak) om te voorkomen dat het monster uitdrogen.
-
Kleuring met alleen fluorescente kleurstoffen
- Om de gist met een fluorescente kleurstof vlek, resuspendeer de pellet cel in 50 µL PBS met 1% bovien serumalbumine (BSA).
- Incubeer de cultuur met een gelijk volume Calcofluor wit (CFW) (1 µg/mL) en capsule mAb 18B7 (Zie Tabel van materialen) geconjugeerd met AlexaFluor488 (AF488) (10 µg/mL) gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
- Centrifugeer cellen bij 870 x g gedurende 5 minuten bij 21 ° C na incubatie en supernatant gecombineerd.
- Resuspendeer de pellet cel in 10 µL PBS met 1% bovien serumalbumine (BSA).
- Pipetteer 8 µL celsuspensie op een glasplaatje Microscoop.
- Breng een dekglaasje van 13 mm glas aan (#1.5 dikte) en verzegel randen met een niet-toxisch sealant (duidelijk nagellak) om te voorkomen dat het monster uitdrogen.
-
Kleuring met zowel Oost-Indische inkt en fluorescente kleurstoffen
- Als u wilt meer direct vergelijken de werkzaamheid van de Oost-Indische inkt vlekken die van fluorescente kleurstoffen, vlek mede de dezelfde celpopulatie met beide soorten van de vlek. Om dit te doen, incubeer eerste cellen met zowel een TL capsule en de celwand vlek, volgens stappen 2.2.1 - 2.2.3.
- Pipetteer vervolgens gelijk volumes (4 µL) van de fluorescently gebeitst celsuspensie en de Oost-Indische inkt op een glasplaatje. Voorzichtig mengen.
- Breng een dekglaasje van 13 mm glas aan (#1.5 dikte) en verzegel de randen met een niet-toxisch sealant (duidelijk nagellak) om te voorkomen dat het monster uitdrogen.
3. image Acquisition/microscopie
-
Imaging cellen gekleurd met Oost-Indische inkt.
- Verwerven van beelden met behulp van een standaard lichte Microscoop (100 X vergroting).
- Het imago van een minimum van 50 cellen per voorwaarde.
Opmerking: Het aantal cellen per veld zal variëren, en dit is aanvaardbaar. Het is belangrijk, echter dat overlappende cellen worden bewaard bij een minimum, zoals deze moeilijk zijn te meten (zowel handmatig als met geautomatiseerde software). Voor deze experimenten, werden beelden verkregen op een diepte van 16 bits met belichtingstijden geoptimaliseerd om het afbeeldingscontrast te maximaliseren terwijl het minimaliseren van de onscherpte veroorzaakt door kleine bewegingen van de cellen.
-
Imaging cellen gekleurd met fluorescente kleurstoffen
- Naar image de cellen door fluorescentie microscopie, open de Microscoop denkbaar software en selecteer de juiste excitatie en emissie golflengten voor de fluorophores gebruikt (CFW en AF488 zijn opgewekt met behulp van de 405nm en 488 nm verlichting, respectievelijk). Verwerven van beelden met behulp van een fluorescentie Microscoop.
- Het imago van een minimum van 50 cellen per voorwaarde.
Opmerking: Het aantal cellen per veld zal variëren, en dit is aanvaardbaar. Het is belangrijk, echter dat overlappende cellen tot een minimum worden gehouden, zoals deze moeilijk zijn te meten (zowel handmatig als met geautomatiseerde software). - Verwerven van een z-stack afbeelding serie van de cellen om ervoor te zorgen dat de maximale capsule diameter voor elke cel binnen een bepaald gebied wordt verkregen.
- In de software van de controle van de Microscoop, klik op de balk "z-stack" openstellen van het "z-stack" control panel en selecteer de optie van de "Eerste/laatste" in de linker bovenhoek van het paneel.
- Gebruik de schone-focus controle op de Microscoop te concentreren op een niveau dat lager is dan het breedste punt van een enkele gistcel en de capsules voor alle binnen het gezichtsveld van de huidige en klik op "Eerste instellen".
- De fine-focus controle te richten boven het breedste punt van de cel lichaam van dezelfde cel en de capsule voor alle cellen binnen het gezichtsveld van de huidige en klik op "Instellen Last".
- Klik vervolgens op "Start Experiment" op het tabblad van de "Overname" te verwerven van de z-stack voor de huidige positie. Herhaal de procedure op meerdere posities tot z-stack beelden van een minimum van 50 cellen zijn verkregen.
Opmerking: Bij deze experimenten, was de confocal pinhole ingesteld op 1.0 AU en een overlappende z-Reeksen van 10-20 segmenten die betrekking hebben op elk 0,7 µM werden verworven op de geselecteerde posities. AU = luchtige eenheid.
- Vervolgens converteren naar elke z-stack serie maximumlichtsterkte projecties (MIP) met behulp van de software van de analyse van de juiste afbeelding.
Opmerking: MIPs project de grootste intensiteit op elk vliegtuig van de afbeelding van de gestapelde29. Creëren van MIPs kan men voor de productie van een 2D-weergave van beelden die met de maximale cel en de capsule diameter binnen de vastgelegde 3D-stack corresponderen.
-
Imaging cellen gekleurd met zowel Oost-Indische inkt en fluorescente kleurstoffen
- Verwerven van beelden met behulp van een widefield (40 X vergroting) of de confocal microscoop (63 X of 100 X vergroting). Voor cellen gekleurd met zowel Oost-Indische inkt en fluorescente kleurstoffen, opnamen met behulp van een widefield Microscoop uitgerust met een computergestuurde toneel- en olie-immersie-doelstelling.
Opmerking: De Microscoop in gebruik moet worden gecontroleerd met behulp van een imagingsoftware CFW. fluorescentie die wordt opgewekt door een filter van 340-380 nm excitatie en uitgestraalde licht moet worden gedetecteerd door een 435-485 nm barrière filter weerkaatst door een dichroïde spiegel van 400 nm. AF488 fluorescentie kan worden opgewekt door een filter van 465-495 nm excitatie en uitgestraalde licht kan worden opgespoord door een 515-555 nm barrière filter weerkaatst door een 505-nm dichroïde spiegel. - Het imago van een minimum van 50 cellen per voorwaarde voor elke kleuringstechniek.
- Verwerven van beelden met behulp van een widefield (40 X vergroting) of de confocal microscoop (63 X of 100 X vergroting). Voor cellen gekleurd met zowel Oost-Indische inkt en fluorescente kleurstoffen, opnamen met behulp van een widefield Microscoop uitgerust met een computergestuurde toneel- en olie-immersie-doelstelling.
4. handmatige meting van de Capsule
- Voor cellen gekleurd met Oost-Indische inkt of fluorescerende vlekken, een cel meting software handmatig maatregel capsule en cel diameter te gebruiken (Zie Tabel van materialen). Om dit te doen, ga naar 'Bestand' > "Open afbeelding" > "Maatregel" en gebruik de cursor om een rechte lijn door het breedste punt van de hele cel (totale diameter) tekenen.
- Vervolgens klikt u opnieuw op "Maatregel" en teken een rechte lijn door het lichaam van de cel (de diameter van de cel lichaam).
Opmerking: Metingen worden automatisch opgeslagen op de cellen. - Herhaal dit proces voor alle cellen (minimaal 50/groep).
- Als beelden wilt opslaan zodra zij worden gemeten, klik op "Bestand" > "Save As" en de naam van de afbeeldingen op de juiste manier.
- Selecteer de zojuist gemeten bestanden en gegevens exporteren naar een spreadsheet-software.
- Berekenen van de gemiddelde diameter van de capsule met behulp van de vergelijking: ([totale doorsnede] - [de diameter van de cel lichaam]).
5. geautomatiseerde meting van de Capsule
Opmerking: Voor succesvolle geautomatiseerde meting, gebruikt u 16-bits afbeeldingen met een hoog contrast en die zijn goed gericht samen met de software van de analyse van een passende afbeelding (Zie Tabel van materialen). Wanneer imaging C. neoformans voor capsule meting, is het belangrijk om zich te concentreren op de donkere ring op de grens tussen de celwand en de capsule. Hierdoor kan de software af te bakenen correct de cel en de capsule.
- Omkeren en een kopie maken van alle Oost-Indische inkt gekleurd cel beelden met behulp van een geschikte software voor het bewerken van afbeeldingen (Zie Tabel van materialen). Om dit te doen, klikt u op 'Bestand' > 'Open' te openen van de Oost-Indische inkt gekleurde beelden en vervolgens "Control" + "I" om de afbeelding omkeren. Klik op "Bestand" > "Save As" om de omgekeerde beeld te bewaren.
- Afbeeldingen in de software importeren van zowel de oorspronkelijke als de omgekeerde Klik op "Bestand" > "Importeren Sequence" > "Load Image" > "Definiëren volgnummer (handmatig)" > "Afmetingen (kanaal)" > "Import" > "Apply".
Opmerking: De C. neoformans cel organen en capsules kunnen worden geïdentificeerd en gemaskeerd met behulp van specifieke algoritmen - hierna aangeduid als 'recepten' - opgenomen in de software. - Het recept 'Kolonie Analyzer (fluorescentie)' op de omgekeerde afbeelding gebruiken om te detecteren en de cel lichaam te maskeren, dan klik op "apply". In de omgekeerde afbeelding wordt de donkere ring definiëren de celgrens C. neoformans helderder dan de omliggende capsule.
- Gebruik het recept van de 'Kolonie Analyzer (fluorescentie)' op de omgekeerde afbeelding te segment van de C. neoformans cel organen uit hun capsules, dan klik op "apply". Hiermee maakt u een masker graaf. Wijzig de naam van dit masker graaf "Cel lichaam" door met de rechtermuisknop op het tabblad met het label "graaf mask".
Opmerking: Het recept bestaat uit meerdere stappen voor beeldverwerking: achtergrond verwijderen, object detectie object scheiding en subset filteren. - Vervolgens het recept 'Celproliferatie' op de oorspronkelijke afbeelding gebruiken om te detecteren en maskeren de capsule en klik op "apply". Hiermee maakt u een masker graaf. Wijzig de naam van dit masker graaf "Capsule" door met de rechtermuisknop op het tabblad met het label "graaf mask".
- Met behulp van het recept, 'Capsule verdeling', het maken van een nieuwe masker op de oorspronkelijke afbeelding om te partitioneren van aangrenzende capsules uit elkaar. Om dit te doen, klik op "Capsule partitie" van het recept dropdownmenu. Kies in het vak Capsule partitie het masker nu omgedoopt tot graaf "Capsule" (5.5) voor Capsule regio. Kies het masker nu omgedoopt tot graaf "Cel lichaam" voor Crypto cellen (5.4). Kies "Original" voor het invoerkanaal, en "Create Mask voor Partitioned Capsule. Klik op "Apply
Opmerking: Het recept genereert cel en capsule diameter, gedefinieerd als het gemiddelde van de langste en kortste assen overschrijding van het midden van de cel en capsule en metingen van het gebied van detectie maskers. Vind de uitgang die is gelegen onder het tabblad van het werkblad in deze software. Herhaal dit proces voor alle afbeeldingen (minimaal 50 cellen/groep). Het recept van parameters kunnen worden afgestemd om te optimaliseren detectie van afzonderlijke beelden of geoptimaliseerd voor batch detectie van meerdere afbeeldingen. Aanvullende metingen kunnen worden berekend door het recept voor uitgebreide karakterisering van de cel en de capsule morfologie. - Gegevens exporteren naar een spreadsheet-software van keuze voor verdere analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ter illustratie van de capsule inductie, cel kleuring, imaging en meettechnieken, gebruikten we drie stammen van C. neoformans: het gemeenschappelijk, goed gekarakteriseerd laboratorium stam, H99S30, en twee klinisch geïsoleerde stammen van eerder onbekende capsule diameter, B18 en B5231.
De workflow van de capsule inductie, kleuring en beeldacquisitie met Oost-Indische inkt wordt weergegeven in figuur 1A. Beelden uit alle drie stammen worden weergegeven in figuur 1B zowel pre- en post inductie. De onderzoeker zal weten of de capsule inductie een succes was door het vergelijken van de cellen die capsule inductie hebben ondergaan die volstaat om die van dezelfde cultuur die niet hebben. Een verhoging van de grootte van de duidelijk blijkt over het algemeen in de meeste stammen na inductie, hoewel sommige spanningen natuurlijk kleine capsules zelfs na inductie vertonen zullen (zie beelden van B18 in figuur 1B). Opgemerkt moet worden dat de capsule inductie mislukken zal als residuele rijke media wordt niet verwijderd vóór inductie of als CO2 niet aanwezig is. In deze gevallen zal slechts bescheiden (indien aanwezig) stijgingen van de capsule grootte worden waargenomen. Diameters van alle drie stammen werden handmatig gemeten en de resultaten worden weergegeven in Figuur 1 c. In twee van de drie experimenten was er geen verschil in grootte tussen H99S en B18. Echter, een significant verschil in grootte consequent werd waargenomen tussen de grootste stam, de B52, en de H99S en de B18 (p < 0.001 en p < 0.001, respectievelijk, standaard ten minste pleinen testen met eenvoudige contrasten, steekproefgrootte = 50 cellen/stam ).
Figuur 2A toont de workflow van de capsule inductie, kleuring en beeldacquisitie met behulp van twee fluorescente kleurstoffen, één voor de capsule (18B7-AF488) en één voor de celwand (Calcofluor White). Beelden werden gevangen als z-stacks voor alle drie stammen na inductie, ervoor te zorgen dat de maximale diameter van de capsule en cel lichaam werd gevangen genomen voor elke cel te meten (figuur 2B). Elke z-stack werd verwerkt tot maximale intensiteit projecties, de 3-dimensionale stack comprimeren in een 2D-afbeelding vóór de analyse (figuur 2C). Deze werden vervolgens handmatig gemeten (figuur 2D). In tegenstelling tot de metingen voor de Oost-Indische inkt cellen gekleurd, herhaalt de fluorescerende vlekken ingeschakelde ons om te discrimineren tussen alle drie stammen op basis van hun capsule diameter in alle drie van het experiment. Hier bleek dat B18 de kleinste capsule diameter en de B52 de grootste (p < 0.001 voor alle vergelijkingen, standaard kleinste kwadraten test met eenvoudige effecten, monstergrootte = 50 cellen/stam).
Verdere beoordeling van de twee methoden voor C. neoformans capsule kleuring, werden metingen van alle drie stammen vergeleken. Er was geen significant verschil tussen de capsule grootte bepaald met behulp van de twee methoden voor de kleuring (figuur 3A) (multivariate ANOVA met eenvoudige effecten, monstergrootte = 50 cellen/stam). Deze conclusie stemde overeen met de bevindingen van een afzonderlijk experiment waar de lab-stam, H99S, was mede gekleurd met Oost-Indische inkt en fluorescente kleurstoffen (figuur 3B-C). Er was echter grotere variabiliteit tussen experimenten met behulp van de Oost-Indische inkt, zoals blijkt uit het feit dat slechts één van de drie experimenten bleek een significant verschil in capsule grootte tussen H99S en B18, in vergelijking met het belangrijke verschil waargenomen tussen deze stammen in alle drie TL experimenten (figuur3D-E) (multivariate ANOVA met eenvoudige effecten, monstergrootte = 50 cellen/stam).
Oost-Indische inkt gekleurd beelden die voldoen aan de criteria vermeld in het protocol (sectie 5) kan worden gemeten met behulp van een geautomatiseerd systeem. De werkstroom weergegeven in figuur 4A gidsen de gebruiker door de stappen moet gebruik maken van de recepten is bedoeld voor het meten van de C. neoformans capsule. Na het ontwikkelen van de werkstroom, werd het gevalideerd door het meten van een cache van bestaande beelden van C. neoformans cellen door drie onderzoekers met behulp van zowel manuele als geautomatiseerde methoden. Er waren geen significante verschillen tussen de onderzoeker van metingen wanneer handmatig gemaakt, en dit was ook het geval wanneer de metingen zijn verricht met behulp van geautomatiseerde beeld analysesoftware (figuur 4B) (ANOVA, steekproefgrootte = 50 cellen/onderzoeker). Er was een klein maar significant verschil in de capsule grootte gemeld tussen de twee methoden (figuur 4C) ANOVA, steekproefgrootte = 150/groep cellen. De diameter van de capsule was consequent iets kleiner wanneer gemeten via automatisering dan handmatige metingen (0,3 µm, p < 0,001). Bovendien, als men vergelijkt tussen capsule grootte metingen die worden uitgevoerd door afzonderlijke onderzoekers uit de dezelfde afbeelding sets, was de standaardfout kleiner toen de software van de analyse van de afbeelding werd gebruikt voor kwantificering in plaats van handmatige methoden, die is suggestief voor meer nauwkeurige en reproduceerbare metingen met behulp van de automatische methode. Voor succesvolle geautomatiseerde meten, cellen moeten worden in focus, hebben een medium tot grote capsule, en niet overdreven geclusterd (Figuur 4 d). We vonden dat slecht gerichte beelden van geclusterde cellen met kleine capsules niet automatisch worden in de software gemeten kon. We beweren echter dat dit ook kunnen zijn uitdagend om te meten nauwkeurig met behulp van handmatige methoden.
Figuur 1 : Oost-Indische inkt vlekken om te meten C. neoformans capsule. (A) Schematische weergave van de capsule meting C. neoformans door Oost-Indische inkt vlekken. Kortom, capsule expressie wordt geïnduceerd met behulp van nutriënten ontbering en blootstelling aan CO2, de cellen geresuspendeerde in Oost-Indische inkt en gemonteerd op glas dia's. Beelden van gekleurde cellen zijn overgenomen door de lichte microscopie, velden of selecteren door de gebruiker of door het tegel-scannen met behulp van een computergestuurde stadium. Afbeeldingen kunnen worden geanalyseerd handmatig of verwerkt voor geautomatiseerde beeldsegmentatie en analyse. (B) beelden van de gemeenschappelijke lab-stam, de H99S en de twee klinische spanningen, B18 en B52, zowel pre- en post capsule inductie. Schaal staven 10 µm (C) grafiek van een vertegenwoordiger experimenteren weergegeven: capsule diameter van alle drie stammen gekleurd met Oost-Indische inkt en handmatig gemeten (de fout wordt weergegeven als de standaardfout (SE)). Statistische significantie is aangegeven als volgt: *, p < 0,05; **, p < 0,01; en ***, p < 0,001. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Fluorescerende vlekken om te meten C. neoformans capsule. (A) Schematische weergave van de capsule meting C. neoformans door Calcofluor wit (CFW) en 18B7-AF488 mede kleuring. Na de capsule inductie en kleuring, zijn de cellen gemonteerd en beeld door laser scanning confocal microscopie. Als cellen in verschillende focal vlakken worden kunnen, worden z-stacks verworven op elke positie. Deze zijn verwerkt tot maximale intensiteit projecties die kunnen worden gebruikt voor het nauwkeurig meten van de maximale capsule diameter voor elke cel. (B) Beelden van de gemeenschappelijke lab-stam, de H99S en de twee klinische spanningen, B18 en B52, capsule na inductie. Opmerking: Schaal staven 10 µm voor alle afbeeldingen. (C) maximale intensiteit projecties van fluorescently label C. neoformans cellen. (D) Grafiek van een representatieve experiment tonen handmatig gemeten capsule diameter van alle drie stammen gekleurd met CFW en 18B7-AF488 (de fout wordt weergegeven als de standaardfout (SE)). Statistische significantie wordt als volgt aangegeven: *, p < 0,05; **, p < 0,01; en ***, p < 0,001. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Vergelijking van de resultaten tussen de Oost-Indische inkt en fluorescerende vlekken. (A) analyse van de drie stammen van C. neoformans gekleurd met Oost-Indische inkt of fluorescente kleurstoffen, n = 3 (de fout wordt weergegeven als de standaardfout (SE)). (B) beelden van een honkslag C. neoformans cel gekleurd met Oost-Indische inkt en beide fluorescente kleurstoffen (schaal staaf vertegenwoordigt 13 µm). Horizontale lijnen bakenen de randen van de capsule en verticale lijnen bakenen de randen van de cel lichaam. (C) kwantificering van een representatieve experiment van H99S is mede van gekleurd met zowel Oost-Indische inkt en fluorescente kleurstoffen (de fout wordt weergegeven als de standaardfout (SE)). (D, E) Voorstelling van de diameter van de capsule variabiliteit tussen de Oost-Indische inkt experimenten (D) en fluorescerende experimenten (E). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Computational analyse van C. neoformans capsule diameter van beelden van de Oost-Indische inkt gekleurd cellen. (A) Schematische weergave van beeldsegmentatie en C. neoformans capsule meting met behulp van een geautomatiseerde meting techniek (Zie Tabel van materialen). (B) vergelijking van capsule metingen uitgevoerd door 3 afzonderlijke onderzoekers met behulp van de handleiding (Manual 1-3) en geautomatiseerde methoden (Automated 1-3). Elke onderzoeker gebruikt een identieke cache van C. neoformans beelden door beide methoden (de fout wordt weergegeven als StDev). (C) gecombineerd gemiddelde van handmatige metingen en geautomatiseerde metingen (de fout wordt weergegeven als de standaardfout (SE)). Voorbeelden van beide ideaal (D) en (E) niet-ideale beelden van C. neoformans. Niet-ideale beelden kunnen niet met succes worden gemeten in de software. Statistische significantie is aangegeven als volgt: *, p < 0,05; **, p < 0,01; en ***, p < 0,001. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De capsule is al decennia een belangrijk aandachtspunt van het onderzoek voor zowel mycologen en clinici geïnteresseerd in C. neoformans en cryptococcosis vanwege zijn rol als een belangrijke virulentiefactor voor het pathogene agens oplevert. Met behulp van microscopie te meten van verschillen in capsule grootte tussen stammen en onder verschillende groei kunnen voorwaarden bieden belangrijke informatie over het pathogene agens en de reacties op verschillende stimuli (d.w.z., verschillende milieu-omstandigheden, potentiële drug behandelingen, enz.) hier, we hebben een methode om de groei van de capsule in C. neoformansgeschetst, en ten opzichte van twee verschillende capsule kleuring protocollen. Tot slot toonden we hoe de software van de analyse van de afbeelding kan worden gebruikt voor het automatiseren van de meting van de diameter van de capsule van beelden van de Oost-Indische inkt gekleurd cellen produceren resultaten die vergelijkbaar met handmatige meetmethoden waren.
In onze experimenten vergeleken we twee klinische stammen, B18 en B52, met H99S, een stam van de standaard lab van bekende capsule grootte18. Beide kleuring methoden is gebleken dat de klinische stam, B52, had de grootste diameter van de capsule van de drie soorten getest. Resultaten van fluorescerende metingen konden echter een verschil tussen de twee stammen met capsule kleiner waar Oost-Indische inkt metingen niet werden onderscheiden. De resultaten van beide methoden van kleuring waren consistent, suggereren dat beide geldig zijn, maar dat met behulp van beelden van fluorescently gekleurd C. neoformans kan toestaan voor verhoogde gevoeligheid in het meten van spanningen met de kleine capsule. Met behulp van maximale projecties gegenereerd op basis van z-stack beelden van fluorescently gekleurde cellen kunt onderzoekers om ervoor te zorgen dat nauwkeurige capsule diameter metingen kunnen worden gemaakt, zelfs wanneer de verbeelde cellen in verschillende focal vlakken. Deze metingen zijn moeilijker voor C. neoformans beeld met behulp van de Oost-Indische inkt en de lichte microscopie van standaard. In een bepaalde afbeelding, kunnen aangrenzende cellen zitten in iets verschillende focal vlakken, waardoor het moeilijk is om op te lossen nauwkeurig de grens van de cel lichaam-capsule voor alle cellen. Dit kan eventueel het vermogen van onderzoekers om het detecteren van kleine veranderingen in de capsule grootte of kleine verschillen tussen stammen beschamen.
Elke methode heeft zijn eigen inherente voordelen. Oost-Indische inkt is het meest gebruikt door onderzoekers vanwege zijn betaalbaarheid, gebruiksgemak, en stabiliteit (het niet degraderen na verloop van tijd als sommige fluorescerende vlekken). Aangezien Oost-Indische inkt een eenvoudige, negatieve vlek is kan het worden gebruikt in combinatie met standaard lichte microscopen, die gemakkelijker beschikbaar dan fluorescente microscopen. Echter, als niet in de juiste verhoudingen (India inkt: buffer) gebruikt, de vlek kunt maken een "vederlicht" achtergrond als beeld, die automatische beeldanalyse kan bemoeilijken. Terwijl de dure en meer tijd in beslag om te gebruiken, fluorescente kleurstoffen kunnen nuttig zijn voor hun flexibiliteit, en als we laten zien, hun gevoeligheid. Ze zijn vooral nuttig voor het meten van de capsule grootte en cel lasten in experimenten waarbij C. neoformans die hebben al phagocytosed door immune cellen en nodig zijn voor het histopathologisch onderzoek van C. neoformans capsule in weefselmonsters (een techniek die niet in dit artikel worden beschreven)32. Als kleuring met fluorescente kleurstoffen, zoals calcofluor witte of fluorescently tagged anti-GXM antilichamen, problematisch is (bijvoorbeeldonvoldoende kleuring), dit in het algemeen kan worden overwonnen door het optimaliseren van de kleuring protocol (vergroten/verkleinen de concentratie en/of incubatie tijd met de kleurstof).
Ongeacht de kleuring methodologie, vinden wij dat zowel capsule inductie en juiste Fotolader kritische stappen in het protocol zijn. Het protocol beschreven in dit document behoort tot verschillende standaardmethoden voor capsule inductie in C. neoformans en heeft met succes gebruikt in gist labs voor vele jaren23. C. neoformans capsule inductie is CO2-afhankelijk en alleen optreedt onder stressvolle omstandigheden23,33. Het is daarom essentieel dat het voorkomt in een 5% CO2 incubator met behulp van een passende voedingsstoffen tekort groeimedium. Als het vermoeden bestaat dat capsule heeft niet zijn geïnduceerd na een standaard incubatietijd (over het algemeen 18-24 h), moeten de cellen worden vergeleken met een uninduced een cultuur die niet werd blootgesteld aan stresserende omstandigheden. Vergelijken van de twee zal bepalen of de inductie effectief was. Een succesvolle inductie is een waarin de meerderheid van de cellen een grotere capsule maken, in vergelijking met de uninduced controle. Omdat niet alle cellen veroorzaken zal, moeten de cellen die moeten worden gemeten een heterogene vertegenwoordiging van de beschikbare cellen.
Het belang van consistente Beeldacquisitie kan niet worden overschat, vooral als geautomatiseerde meting het doel is. Focus, contrast, achtergrond fluorescentie, evenals de bitdiepte en beeld compressie van de bestanden zijn allemaal belangrijke overwegingen. Indien mogelijk, de grote clusters van cellen die niet in een enkele brandvlak zit moeten worden vermeden, hoewel sommige budding en aanraken van de cellen aanvaardbaar zijn en kan onvermijdelijk (deze regel moet worden gevolgd voor het meten van zowel manuele als geautomatiseerde). Dit probleem kan worden omzeild tot op zekere hoogte wanneer cellen met behulp van confocal imaging van fluorescently gekleurd. Het gebruik van z-stacks tot maximale intensiteit projecties kunnen nauwkeurige meting van cellen in verschillende focal vlakken van een enkel beeld-29. Bovendien moeten beelden snel worden verworven na de voorbereiding van het monster. Dit kan met name belangrijk voor Oost-Indische inkt monsters zoals wanneer ze beginnen te drogen, het contrast tussen de achtergrond en voorgrond elementen (de cellen) verminderen kan en ongewenste achtergrond functies kunnen worden verbeterd, wat leidt tot verminderde geautomatiseerde gekleurd segmentatie nauwkeurigheid.
Hoewel de diameter van de capsule metingen gemeengoed in de Gemeenschap van C. neoformans zijn , tot dit punt zijn ze meestal uitgevoerd handmatig, waarvoor aanzienlijke tijd en mankracht. Echter, handmatige metingen in het veld worden geaccepteerd en resultaten kunnen bekomen worden bij weinig kosten. Vooruitgang in de software van de analyse van de afbeelding hebben gezorgd dat de eerste stappen richting het automatiseren van deze metingen te nemen. De eenvoudige aard van C. neoformans cel lichaam en capsule - verschijnen als een cirkel binnen een cirkel - in 2D-afbeeldingen maakt het meten van hun maten relatief eenvoudig voor geautomatiseerde beeld segmentatie softwarepakketten, zonder de noodzaak om het ontwikkelen van de roman algoritmen. In plaats daarvan, door de koppeling van bestaande algoritmen, C. neoformans cellen en capsules kunnen worden gedetecteerd, gesegmenteerd, en gemeten. Met behulp van deze aanpak, hebben we de metingen van de capsule diameter van C. neoformans geautomatiseerde voor cellen gekleurd met het meest gebruikte capsule kleurstof, Oost-Indische inkt, en ten van deze handmatige metingen voor de dezelfde gegevens opzichte hebben. Deze methode biedt het voordeel van de reproduceerbaarheid en veel van de menselijke fout verwijderen die is gekoppeld aan handmatige meting tijdens het opslaan van de tijd van de onderzoeker. Bovendien kunnen aanvullende metingen worden opgenomen met een minimale inspanning in de workflow van de geautomatiseerde analyse. Wij vinden dat automatische beeldanalyse een veelbelovende aanpak waarmee onderzoekers is voor het meten van grote aantallen C. neoformans capsule met een hoge mate van nauwkeurigheid en efficiëntie.
Globaal, hebben wij laten zien hoe succesvol induceren capsule groei in C. neoformansvlek van de monsters met Oost-Indische inkt of fluorescente kleurstoffen en meten van de diameter van de capsule met behulp van zowel handmatige en automatische metingen in een beeldanalyse software. Onze resultaten suggereren dat beide methoden van kleuring levensvatbaar zijn en in het algemeen consistente resultaten produceren (hoewel er meer variabiliteit met Oost-Indische inkt metingen). Verder, zowel manuele als geautomatiseerde methoden voor meting hebben het vermogen om te onderscheiden verschillende capsule maten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteur, Hoyin Lai, is de productmanager bij DRVision die door de software van de analyse van geautomatiseerde beeld, Moondragon worden gepubliceerd.
Acknowledgments
Wij danken de moleculaire Biosciences (MOBI) doctorale programma en de biologie-afdeling op Middle Tennessee State University (MTSU) voor het verstrekken van de financiering voor deze studie. Het project werd ook gedeeltelijk gefinancierd door een speciale projecten subsidie toegekend aan D.E.N. door de MTSU Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Capsule Induction | |||
| C. neoformans cells | The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University). The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania). | ||
| Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD) | Fisher Scientific | DF0428-17-5 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O) | ||
| DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | |
| 6-well plates | Falcon | CL5335-5EA | |
| Shaking incubator | Thermo Scientific | MaxQ6000 | |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | Isotemp | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Legend XTR | |
| Staining | |||
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Legend Micro 21R | |
| India ink | Fisher Scientific | 14-910-56 | |
| Calcofluor white | Sigma-Aldrich | 18909-100ML-F | |
| 18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488 | A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University) | ||
| PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA) | PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized. | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Glass coverslips | Corning | 2855-18 | #1.5 thickness |
| Clear nail polish or other non-toxic sealant | |||
| Image Acquisition | |||
| Immersion oil | Cargille | 16484 | |
| Light microscope with immersion oil objective | Zeiss | Zeiss Axio A1 with a Plan - NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective | |
| Light microscope camera | Zeiss | Zeiss Axiocam ErCD camera | |
| Confocal microscope with oil immersion objective | Zeiss | LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective. | |
| Confocal microscope software | Zen 2009 | ||
| Confocal microscope camera | Nikon | Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer. | |
| Widefield imaging software | Nikon Elements (Nikon) | ||
| Capsule Measurement | |||
| Image editing software | Photoshop (Adobe) | ||
| Microscope software for manual measurement | Axiovision (Carl Zeiss) | ||
| Image analysis software for automated meesurement | Aivia (DRVision Technologies) | ||
| Spreadsheet software | Excel (Microsoft) |
References
- Park, B. J., et al. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).
- Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. The intracellular life of Cryptococcus neoformans. Annu Rev Pathol. 9, 219-238 (2014).
- Rajasingham, R., et al. Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis. Lancet Infect Dis. 17 (8), 873-881 (2017).
- Limper, A. H., Adenis, A., Le, T., Harrison, T. S. Fungal infections in HIV/AIDS. Lancet Infect Dis. 17 (11), e334-e343 (2017).
- Casadevall, A. Crisis in Infectious Diseases: 2 Decades Later. Clin Infect Dis. 64 (7), 823-828 (2017).
- McClelland, E. E. C., Eisenmann, A., H, Ch 6. New Insights in Medical Mycology. , Springer. Netherlands. 131-157 (2007).
- Leopold Wager, C. M., Wormley, F. L. Jr Classical versus alternative macrophage activation: the Ying and the Yang in host defense against pulmonary fungal infections. Mucosal Immunol. 7 (5), 1023-1035 (2014).
- Kwon-Chung, K. J., Rhodes, J. C. Encapsulation and melanin formation as indicators of virulence in Cryptococcus neoformans. Infect Immun. 51 (1), 218-223 (1986).
- Vecchiarelli, A., et al. Elucidating the immunological function of the Cryptococcus neoformans capsule. Future Microbiol. 8 (9), 1107-1116 (2013).
- Murphy, J. W. Influence of cryptococcal antigens on cell-mediated immunity. Rev Infect Dis. 10 Suppl 2, S432-S435 (1988).
- Cherniak, R., Morris, L. C., Belay, T., Spitzer, E. D., Casadevall, A. Variation in the structure of glucuronoxylomannan in isolates from patients with recurrent cryptococcal meningitis. Infect Immun. 63 (5), 1899-1905 (1995).
- Collins, H. L., Bancroft, G. J. Encapsulation of Cryptococcus neoformans impairs antigen-specific T-cell responses. Infect Immun. 59 (11), 3883-3888 (1991).
- Yasuoka, A., Kohno, S., Yamada, H., Kaku, M., Koga, H. Influence of molecular sizes of Cryptococcus neoformans capsular polysaccharide on phagocytosis. Microbiol Immunol. 38 (11), 851-856 (1994).
- Robertson, E. J., et al. Cryptococcus neoformans ex vivo capsule size is associated with intracranial pressure and host immune response in HIV-associated cryptococcal meningitis. J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).
- Cordero, R. J., Bergman, A., Casadevall, A. Temporal behavior of capsule enlargement by Cryptococcus neoformans. Eukaryot Cell. 12 (10), 1383-1388 (2013).
- O'Meara, T. R., Alspaugh, J. A. The Cryptococcus neoformans capsule: a sword and a shield. Clin Microbiol Rev. 25 (3), 387-408 (2012).
- McClelland, E. E., Smith, J. M. Gender specific differences in the immune response to infection. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis. 59 (3), (2011).
- McClelland, E. E., Perrine, W. T., Potts, W. K., Casadevall, A. Relationship of virulence factor expression to evolved virulence in mouse-passaged Cryptococcus neoformans lines. Infect Immun. 73 (10), 7047-7050 (2005).
- Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. Induction of capsule growth in Cryptococcus neoformans by mammalian serum and CO(2). Infect Immun. 71 (1), 6155-6164 (2003).
- Vartivarian, S. E., et al. Regulation of cryptococcal capsular polysaccharide by iron. J Infect Dis. 167 (1), 186-190 (1993).
- McFadden, D. C., Fries, B. C., Wang, F., Casadevall, A. Capsule structural heterogeneity and antigenic variation in Cryptococcus neoformans. Eukaryot Cell. 6 (8), 1464-1473 (2007).
- Garcia-Hermoso, D., Dromer, F., Janbon, G. Cryptococcus neoformans capsule structure evolution in vitro and during murine infection. Infect Immun. 72 (6), 3359-3365 (2004).
- Gates, M. A., Thorkildson, P., Kozel, T. R. Molecular architecture of the Cryptococcus neoformans capsule. Mol Microbiol. 52 (1), 13-24 (2004).
- Pontes, B., Frases, S. The Cryptococcus neoformans capsule: lessons from the use of optical tweezers and other biophysical tools. Front Microbiol. 6, 640 (2015).
- Shen, H., et al. Automated tracking of gene expression in individual cells and cell compartments. J R Soc Interface. 3 (11), 787-794 (2006).
- Dorn, J. F., Danuser, G., Yang, G. Computational processing and analysis of dynamic fluorescence image data. Methods Cell Biol. 85, 497-538 (2008).
- Nketia, T. A., Sailem, H., Rohde, G., Machiraju, R., Rittscher, J. Analysis of live cell images: Methods, tools and opportunities. Methods. , 65-79 (2017).
- Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , Centers for Disease Control and Prevention, Government Printing Office. Atlanta, GA. 33-38 (2015).
- Kwon, O., Kang, S. T., Kim, S. H., Kim, Y. H., Shin, Y. G. Maximum intensity projection using bidirectional compositing with block skipping. J Xray Sci Technol. 23 (1), 33-44 (2015).
- Janbon, G., et al. Analysis of the genome and transcriptome of Cryptococcus neoformans var. grubii reveals complex RNA expression and microevolution leading to virulence attenuation. PLoS Genet. 10 (4), e1004261 (2014).
- Bisson, G. P., et al. The use of HAART is associated with decreased risk of death during initial treatment of cryptococcal meningitis in adults in Botswana. J Acquir Immune Defic Syndr. 49 (2), 227-229 (2008).
- van Teeffelen, S., Shaevitz, J. W., Gitai, Z. Image analysis in fluorescence microscopy: bacterial dynamics as a case study. Bioessays. 34 (5), 427-436 (2012).
- Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. T. Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide. J Clin Invest. 76 (2), 508-516 (1985).
