Summary
Die Polysaccharid-Kapsel ist die primäre Virulenzfaktor in Cryptococcus Neoformans, und seine Größe korreliert mit Stamm Virulenz. Kapseldurchmesser Messungen dienen phänotypische Tests und therapeutische Wirksamkeit abzuschätzen. Hier ist eine Standardmethode zur Kapsel Induktion vorgestellt, und zwei Methoden der Färbung und Messung Durchmesser verglichen.
Abstract
Die Polysaccharid-Kapsel von Cryptococcus Neoformans ist die primäre Virulenzfaktor und eines der wichtigsten Aspekte dieser Pathogene Hefe allgemein untersucht. Kapsel Größe kann sehr unterschiedlich zwischen den Stämmen, hat die Fähigkeit, schnell zu wachsen, wenn Stress oder niedrigen Nährstoffverhältnisse eingeführt und wurde positiv korreliert mit Stamm Virulenz. Aus diesen Gründen ist die Größe der Kapsel von großem Interesse für C. Neoformans Forscher. Das Wachstum der C. Neoformans Kapsel induziert wird während der phänotypischen Tests, um die Auswirkungen der verschiedenen Behandlungen auf der Hefe oder Größe Unterschiede zwischen Stämmen zu verstehen. Hier beschreiben wir eine der Standardmethoden der Kapsel Induktion und vergleichen zwei anerkannten Methoden der Färbung und Messung Kapseldurchmesser: (i) Tusche, einen negativen Fleck, verwendet in Verbindung mit konventionellen Lichtmikroskopie und Färbung (Ii) zusammen mit fluoreszierende Farbstoffe der Zellwand und Kapsel gefolgt von konfokalen Mikroskopie. Endlich, wir zeigen, wie Messung der Kapseldurchmesser aus Indien blau gefärbten Proben mittels computergestützten Bildanalyse automatisiert.
Introduction
Jedes Jahr eine Viertel Million Menschen betroffen, und was mehr als 180.000 Todesfälle jährlich, ist Cryptococcus Neoformans , Pathogene, intrazelluläre Hefe und dem Erreger der Kryptokokkose1,2, 3. am stärksten betroffen sind HIV-infizierte Patienten in armen Ländern, die nicht Zugang zu antiretroviralen Therapie, so dass sie sehr anfällig für die Krankheit4,5,6. Daten aus der CDC zeigen, dass in Subsahara-Afrika, C. Neoformans mehr Menschen als durch Tuberkulose jährlich und mehr pro Monat als jede Ebola-Ausbruch auf Rekord1tötet. Der häufigste Weg der Exposition erfolgt durch das Einatmen von ausgetrockneten Sporen, die in der Umwelt7Gang und gäbe sind. Beim Betreten der Lunge, gibt es mehrere Virulenzfaktoren, die zum Erfolg von C. Neoformans innerhalb von infizierten Personen beitragen. Die Polysaccharid-Kapsel ist die Mikrobe primäre Virulenzfaktor, als Acapsular Stämme nicht virulente8sind.
Die Cryptococcus Kapsel besteht der drei Hauptkomponenten: Glucuronoxylomannan (GXM), Galactoxylomannan (GalXM) und Mannoproteins (MPs)9. Während MPs eine relativ geringe Zellwand-assoziierte Komponente der Kapsel sind, sie sind immunogen und vor allem Pro-inflammatorische Reaktion9,10fördern können. Im Gegensatz dazu GXM und GalXM machen den größten Teil der Kapsel (> 90 % nach Gewicht) und immunsuppressive Effekte11haben. Neben seiner immunmodulatorische Effekte schafft die rasche Erweiterung der Kapsel in Vivo eine mechanische Barriere zur Einnahme von Host phagocytic Zellen (d.h., neutrophilen Granulozyten und Makrophagen)12. C. Neoformans Kapsel und seine Synthese sind komplex, aber insgesamt, erhöhte Kapseldurchmesser korreliert mit erhöhter Virulenz6,13,14. Angesichts dieser Tatsache ist es wichtig für C. Neoformans Forscher in der Lage sein, schnell und präzise Kapsel Messungen zu quantifizieren.
C. Neoformans Zelle und seine Polysaccharid-Kapsel sind dynamische Strukturen und Veränderungen über Zeit15zeigen. Die Kapsel kann in Dichte, Größe und Montage als Reaktion auf Änderungen in der Host-Umgebung16,17,18ändern. Eisenarme oder Nährstoffgehalt, Exposition gegenüber Serum, die menschlichen physiologischen pH-Wert und erhöhte CO2 sind bekannt, Kapsel Wachstum16,18,19,20zu initiieren. Darüber hinaus haben Forscher gezeigt, strukturelle Veränderungen zu erheblichen Unterschieden bei der Immunoreactivity während einer Infektion, Kreditvergabe einen Vorteil zu C. Neoformans gegenüber seinen Wirt21,22. Dies ist bekannt, weil die Architektur der C. Neoformans Kapsel in eine Vielzahl von Möglichkeiten analysiert wurde. Elektronenmikroskopie, hat beispielsweise ergeben, dass die Kapsel eine heterogene Matrix mit einer inneren Elektron-dichte Schicht unter einer äußeren, durchlässiger Schicht23 hat. Lichtstreuung und die Verwendung von optischen Pinzette konnten Forscher der makromolekularen Eigenschaften24weiter aufzuklären. Analyse der Ergebnisse aus beiden Messungen statische und dynamische Lichtstreuung, wissen wir, dass die Polysaccharid-Kapsel einen komplexen verzweigten Struktur23 hat. Optische Pinzette wurden zur Testen der Steifigkeit der Struktur sowie die Bewertung ihrer Antikörper Reaktivität24. Allerdings ist bei weitem die am häufigsten eingesetzten Analyse der C. Neoformans Kapsel die Messung seiner Größe.
Quantifizierung der Kapsel Größe Forscher nutzen, was eine einfache Messung sein sollte: die lineare Durchmesser der Kapsel. Digitale Mikroskope werden verwendet, um Bilder von mehreren Zellen in C. Neoformans (in der Regel Hunderte) mit Tusche oder Fluoreszenz-Farbstoffen gefärbt zu erfassen. Die Größe der einzelnen Zelle Körper und umgebenden Kapsel wird gemessen. Die Daten werden zusammengestellt, und der mittlere Durchmesser der Kapsel wird durch Subtrahieren des Zellkörper Durchmesser aus der ganzen Zelle Durchmesser (Zellkörper + Kapsel) berechnet. Bis zu diesem Zeitpunkt wurden diese Messungen manuell durchgeführt. Obwohl in der Regel genau, hat diese Methode Nachteile für Forscher. Großer Datenmengen können Tage oder sogar Wochen, von hand zu analysieren. Und da diese Messungen manuell erfolgen, Subjektivität und menschliches Versagen das Ergebnis beeinflussen können.
Automatisierte, computergestützte Bildanalyse ist ein unverzichtbares Werkzeug für Wissenschaftler in vielen Bereichen der molekularen Zellbiologie, ermöglicht schnellere und zuverlässigere Analyse von biologischen Bilder 25,26,27geworden. Genaues Bild-Analyse-Techniken sind notwendig, um quantitative Informationen aus was oft komplex und immense Datenmengen sind von mir. Allerdings wurden einige Messungen, insbesondere die Messung der C. Neoformans Kapsel, schwer zu automatisieren. Genaue Identifizierung der Schnittstelle zwischen der Zellwand und der Kapsel, die in der Regel als einen dunklen Ring, wenn Phasenkontrast-Mikroskopie abgebildet angezeigt wird, kann zur Lösung mit einem einfachen Schwellenwert lästig sein. Weitere, C. Neoformans Zellen in Kultur tendenziell verklumpen und genaue Segmentierung der Zellen ist notwendig für genaue Messungen.
Das Ziel dieses Projektes war es, (i) eines der Standardprotokolle für Kapsel Induktion in C. Neoformans (Ii) vergleichen und Tusche zu veranschaulichen und Fluoreszenz Färbung wie sie betreffen um Durchmesser Messungen, Kapsel (Iii) entwickeln einfache, Berechnungsmethoden Kapseldurchmesser mit Bildern von Tusche gefärbten Zellen mit einer Bildanalyse-Software und (iv) messen bewerten die vor- und Nachteile Kapseldurchmesser manuell messen und mithilfe der Automatisierung von Software. Wir finden, dass die beiden Färbung Methoden, fluoreszierende Kennzeichnung der Zellwand und Kapsel, während mehr Zeit in Anspruch, die konstantesten Ergebnisse zwischen Experimente. Aber beide Methoden konnten wir erfolgreich zu unterscheiden zwischen Labor und klinische C. Neoformans Kapsel Stämme mit verschiedenen Größen. Darüber hinaus konnten wir die Messung der Kapseldurchmesser von Tusche gefärbten Bilder zu automatisieren und fand, dass dies eine echte Alternative zur manuellen Messung der Kapsel.
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Protocol
Hinweis: C. Neoformans ist ein Biosafety Level 2 (BSL-2) Erreger und Forscher arbeiten müssen angemessene Vorsichtsmaßnahmen ergreifen. Verfahren detailliert auf wie zu sicher Arbeit mit BSL-2 Krankheitserreger auf das Center for Disease Control (CDC) gefunden werden kann Website, aber es ist wichtig zu beachten, dass alle Personen, die Kontakt mit C. Neoformans im Umgang geschult werden sollte Krankheitserreger und sollte immer tragen geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA), in der Regel Latex oder Nitril-Handschuhe. Darüber hinaus sollten Rotoren auf Zentrifugen versiegelt sein, um Aerosolization von Proben und Leckagen sofort mit einem 10 % Bleichmittel-Lösung-28aufgeräumt zu verhindern.
(1) Kapsel Induktion
Hinweis: Alle Schritte sollte bei Raumtemperatur durchgeführt werden, sofern nicht anders angegeben.
- C. Neoformans in Hefe Pepton Traubenzucker (YPD) Brühe (pH 6,5 +/-0,2) Kultur und Inkubation bei 37 ° C mit schütteln, bis sie im Log-Phase (ca. 18-36 h) sind.
- Zentrifugieren Sie Zellen bei 870 X g für 5 min bei 21 ° C und waschen Sie dreimal mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
- Verwenden Sie ein Hemocytometer (oder eine automatisierte Zelle-Zähler), um die Zellen zu zählen und bei 2 x 105 Zellen/2 mL in Dulbeccos minimalen wesentlichen Medien (DMEM) Aufschwemmen.
- Um die Kapsel zu induzieren, Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2 für 18 h.
Hinweis: Die Kombination aus fehlender Nährstoffe in den Medien und die Anwesenheit von CO2 stimuliert C. Neoformans Kapsel Wachstum. - Nach Inkubation der Zellen durch Zentrifugieren (wie oben) und entfernen alle, aber 5-10 µL überstand zu ernten. Zum gleichen Zeitpunkt ernten Sie einen entsprechenden UN-induzierte Zellprobe für jede Belastung gemessen werden. Verwenden Sie diese als Negativkontrollen.
Hinweis: Die Zelle-Pellets werden sehr klein sein und möglicherweise schwer zu erkennen. Seien Sie vorsichtig beim Absaugen von überstand. - Färben Sie mit Tusche (Abschnitt 2.1) oder fluoreszierende Farbstoffe (Abschnitt 2.2).
2. Färbung
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Färbung mit nur Tusche
- Um die Hefe mit Tusche Flecken, Aufschwemmen der Pellets im restlichen überstand und fügen 4μL (etwa die Hälfte) der Zellsuspension und 4μL der Tusche auf einen Glas-Objektträger. Vorsichtig mischen und Schaumbildung zu vermeiden.
- Wenden Sie ein 13-mm-Glas-Deckglas (#1.5 Dicke) und versiegeln Sie der Kanten mit einem ungiftigen Dichtstoff (klarer Nagellack) die Probe vor dem Austrocknen zu verhindern.
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Färbung mit Fluoreszenz-Farbstoffen
- Um die Hefe mit einem fluoreszierenden Farbstoff Fleck, Aufschwemmen der Zelle Pellet in 50 µL PBS mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA).
- Die Kultur mit ein gleiches Volumen von Calcofluor White (CFW) inkubieren (1 µg/mL) und Kapsel mAb 18B7 (siehe Tabelle der Materialien) konjugiert, AlexaFluor488 (AF488) (10 µg/mL) für 30 min bei 37 ° C.
- Zentrifugieren Sie Zellen bei 870 X g für 5 min bei 21 ° C nach Inkubation und aspirieren Sie überstand.
- Aufschwemmen Sie Zelle Pellet in 10 µL PBS mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA).
- Pipette 8 µL Zellsuspension auf einen Glas-Objektträger.
- Wenden Sie ein 13-mm-Glas-Deckglas (#1.5 Dicke) und versiegeln Sie der Kanten mit einem ungiftigen Dichtstoff (klarer Nagellack) die Probe vor dem Austrocknen zu verhindern.
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Färbung mit Tusche und fluoreszierende Farbstoffe
- Um die Wirksamkeit der Tusche Färbung mit der Fluoreszenz-Farbstoffen mehr direkt zu vergleichen, Co Flecken der gleichen Zellpopulation mit beiden Arten von Flecken. Dazu zuerst inkubieren Sie Zellen mit einem fluoreszierenden Kapsel und die Zellwand Fleck nach Schritte 2.2.1 - 2.2.3.
- Als nächstes pipette gleiche Volumina (4 µL) der Fluoreszent gefärbt Zellsuspension und Tusche auf einen Objektträger. Mischen Sie vorsichtig.
- Wenden Sie ein 13-mm-Glas-Deckglas (#1.5 Dicke) und seal die Ränder mit einem ungiftigen Dichtstoff (klarer Nagellack) die Probe vor dem Austrocknen zu verhindern.
3. Image Acquisition/Mikroskopie
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Imaging-Zellen befleckt mit Tusche.
- Bilder mit einem standard Lichtmikroskop (100 X Vergrößerung) zu erwerben.
- Bild ein Minimum von 50 Zellen pro Zustand.
Hinweis: Die Anzahl der Zellen pro Feld variiert, und dies ist akzeptabel. Wichtig ist jedoch, dass überlappende Zellen auf ein Minimum gehalten werden, da diese schwer zu messen (sowohl manuell als auch mit automatisierten Software) sind. Für diese Experimente wurden Bilder in einer Tiefe von 16 Bits mit Belichtungszeiten um Bildkontrast zu maximieren bei gleichzeitiger Minimierung der Bewegungsunschärfe durch kleine Bewegungen der Zellen optimiert erworben.
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Imaging-Zellen mit Fluoreszenz-Farbstoffen gefärbt
- Um die Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie Bild, öffnen Sie das Mikroskop imaging-Software und wählen Sie die entsprechende Anregung und Emission Wellenlängen für die Fluorophore verwendet (CFW und AF488 sind begeistert mit dem 405nm und 488 nm Lichter bzw.). Abrufen von Bildern mit einem Fluoreszenzmikroskop.
- Bild ein Minimum von 50 Zellen pro Zustand.
Hinweis: Die Anzahl der Zellen pro Feld variiert, und dies ist akzeptabel. Wichtig ist jedoch, dass überlappende Zellen auf einem Minimum gehalten werden, da diese schwer zu messen (sowohl manuell als auch mit automatisierten Software) sind. - Erwerben Sie ein Z-Stapel-Bildserien der Zellen, um sicherzustellen, dass die maximale Kapseldurchmesser für jede Zelle in einem bestimmten Bereich erreicht wird.
- Klicken Sie in der Mikroskop-Steuerungssoftware auf die "Z-Stack", öffnen Sie das Bedienfeld "Z-Stack", dann wählen die Option "Erste/letzte" in der oberen linken Ecke des Fensters.
- Verwenden Sie die Geldbuße Fokuskontrolle am Mikroskop zu konzentrieren, auf einem Niveau, das unter dem breitesten Punkt einer einzigen Hefezelle und die Kapseln für alle in der aktuellen Blickfeld und klicken Sie auf "First Set".
- Die Geldbuße Fokuskontrolle sich oberhalb der breitesten Stelle der Zellkörper der gleichen Zelle und der Kapsel für alle Zellen in der aktuellen Blickfeld und klicken Sie auf "Letzte gesetzt".
- Klicken Sie "Start-Experiment" im Register "Übernahme" den Z-Stack für die aktuelle Position zu erwerben. Wiederholen Sie den Vorgang an mehreren Positionen bis Z-Stapel Bilder von mindestens 50 Zellen erworben wurden.
Hinweis: Für diese Experimente die konfokale Lochblende wurde gegründet um 1.0 AU und eine überlappende Z-Serie von 10-20 Scheiben für 0,7 µM wurden an ausgewählten Positionen übernommen. AU = luftig-Einheit.
- Als nächstes wandeln Sie jede Z-Stapel-Serie in höchster Intensität Projektionen (MIP) mit entsprechenden Bildanalyse-Software.
Hinweis: MIPs Projekt die größte Intensität auf jeder Ebene der gestapelten Bild29. Erstellen von MIPs ermöglicht eine 2-D-Darstellung der Bilder zu produzieren, die die maximale Zell- und Kapseldurchmesser innerhalb des aufgenommene 3-d-Stapels entsprechen.
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Imaging-Zellen mit Tusche und Fluoreszenz-Farbstoffen gefärbt
- Abrufen von Bildern mit einer Weitfeld (40 X Vergrößerung) oder confocal Mikroskop (63 X oder 100 X Vergrößerung). Für Zellen mit Tusche und Fluoreszenz-Farbstoffen gefärbt die Aufnahmen Sie mit einem Weitfeld-Mikroskop mit computergesteuerten Bühne und Öl eintauchen Ziel ausgestattet.
Hinweis: Das Mikroskop im Einsatz sollte über eine imaging-Software CFW gesteuert werden. Fluoreszenz, die freut sich über einen 340-380 nm Anregung Filter und emittiert Licht sollten durch einen 435 485 nm Barriere Filter von 400 nm dichroitischen Spiegel reflektiert erkannt werden. AF488 Fluoreszenz kann durch einen 465-495 nm Anregung Filter begeistert sein, und durch einen 515-555 nm Barriere Filter von 505 nm dichroitischen Spiegel reflektiert abgestrahlten Lichts detektiert werden. - Bild ein Minimum von 50 Zellen pro Bedingung für jede Färbung Methode.
- Abrufen von Bildern mit einer Weitfeld (40 X Vergrößerung) oder confocal Mikroskop (63 X oder 100 X Vergrößerung). Für Zellen mit Tusche und Fluoreszenz-Farbstoffen gefärbt die Aufnahmen Sie mit einem Weitfeld-Mikroskop mit computergesteuerten Bühne und Öl eintauchen Ziel ausgestattet.
4. manuelle Messung der Kapsel
- Für Zellen befleckt mit Tusche oder fluoreszierende Flecken, verwenden Sie eine Zelle Messsoftware, manuell Kapsel und Zelle Durchmesser messen (siehe Tabelle der Materialien). Um dies zu tun, gehen Sie auf "Datei" > "Bild öffnen" > "Messen" und Verwendung der Cursor zum Zeichnen einer geraden Linie durch den breitesten Punkt der ganzen Zelle (Durchmesser).
- Als nächstes klicken Sie erneut auf "Messen" und zeichnen Sie eine gerade Linie durch die Zellkörper (Zellkörper Durchmesser).
Hinweis: Messungen sind auf die Zellen automatisch gespeichert. - Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Zellen (mindestens 50/Gruppe).
- Um Bilder zu speichern wenn sie gemessen werden, klicken Sie auf "Datei" > "Speichern unter" und benennen Sie die Bilder entsprechend.
- Wählen Sie die neu gemessenen Dateien und exportieren Sie Daten in eine Tabellenkalkulation.
- Die durchschnittliche Kapseldurchmesser mithilfe der Gleichung zu berechnen: ([Durchmesser] - [Zellkörper Durchmesser]).
5. automatische Messung der Kapsel
Hinweis: Verwenden Sie für erfolgreiche automatisierte Messung, 16-Bit-Bilder mit hohem Kontrast und die sind richtig scharf zusammen mit einer entsprechenden Bildanalyse-Software (siehe Tabelle der Materialien). Beim C. Neoformans für Kapsel Messung abbilden, ist es wichtig, im Mittelpunkt der dunkle Ring an der Grenze zwischen der Zellwand und der Kapsel. Dies ermöglicht die Software, die Zelle und die Kapsel richtig abzugrenzen.
- Umkehren und erstellen Sie eine Kopie aller Tusche gefärbten Zelle Bilder mit einem geeigneten Bildbearbeitungs-Software (siehe Tabelle der Materialien). Um dies zu tun, klicken Sie auf "Datei" > "Öffnen" Tusche gefärbten Bilder öffnen und dann "Control" + "I", um das Bild invertieren. Klicken Sie auf "Datei" > "Speichern unter" um das umgekehrte Bild zu speichern.
- Importieren Sie die ursprüngliche und invertierte Bilder in die Software klicken Sie auf "Datei" > "Sequenz importieren" > "Load Image" > "Definieren Sequence (manuell)" > "Dimensionen (Kanal)" > "Importieren" > "Übernehmen".
Hinweis: Die C. Neoformans Zellkörpern und Kapseln identifiziert werden können und maskiert, mit speziellen Algorithmen - bezeichnet als "Rezepte" - in der Software enthalten. - Verwenden Sie das Rezept "Kolonie Analyzer (Fluoreszenz)" auf das umgekehrte Bild zu erkennen und zu maskieren Zellkörper, dann klicken Sie auf "anwenden". Der dunkle Ring definieren die Grenze der C. Neoformans Zelle wird in das umgekehrte Bild heller als die umgebende Kapsel.
- Verwenden Sie das 'Kolonie Analyzer (Fluoreszenz)' Rezept auf das umgekehrte Bild segmentieren die C. Neoformans Zellkörpern aus ihren Kapseln, dann klicken Sie auf "anwenden". Dadurch entsteht eine Graf-Maske. Benennen Sie diese Anzahl Maske "Zellkörper" durch Rechtsklick auf die Karteikarte "Graf Maske".
Hinweis: Das Rezept besteht aus mehreren Verarbeitungsschritten Bild: Hintergrund entfernen, Objekterkennung, Objekt-Trennung und Teilmenge zu filtern. - Als Nächstes verwenden Sie das Rezept "Zellproliferation" auf das ursprüngliche Bild zu erkennen und die Kapsel zu maskieren, und klicken Sie auf "anwenden". Dadurch entsteht eine Graf-Maske. Benennen Sie diese Anzahl Maske "Kapsel" durch Rechtsklick auf die Karteikarte "Graf Maske".
- Mit dem Rezept "Kapsel Partition", erstellen Sie eine neue Maske auf das Originalbild, angrenzende Kapseln voneinander zu partitionieren. Um dies zu tun, klicken Sie auf "Kapsel Partition" aus dem Dropdown-Menü Rezept. Wählen Sie im Feld Kapsel Partition die nun umbenannte Graf Maske "Kapsel" (5,5) für Kapsel Region. Wählen Sie die nun umbenannte Graf Maske "Zellkörper" Crypto-Zellen (5.4). Wählen Sie "Original" für den Eingangskanal und "Create Mask für Partitioned Kapsel. Klicken Sie auf "anwenden
Hinweis: Das Rezept erzeugt Zelle und Kapseldurchmesser, definiert als der Mittelwert über die längste und kürzesten Achsen über der Mitte der Zelle und Kapsel und Flächenmaße vom Erkennung Masken. Finden Sie die Ausgabe, die unter der Registerkarte "Tabelle" in dieser Software befindet. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Bilder (mindestens 50 Zellen/Gruppe). Das Rezept Parameter konnte optimiert, um die Erkennung einzelner Bilder zu optimieren oder für Batch-Erkennung von mehreren Bildern optimiert. Weitere Messungen können durch das Rezept für umfassende Charakterisierung der Zelle und die Kapsel Morphologie berechnet werden. - Exportieren Sie Daten in einem Tabellenkalkulations-Software der Wahl für die weitere Analyse.
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Representative Results
Zur Veranschaulichung der Kapsel Induktion, Zelle Färbung, Bildverarbeitung und Messtechnik verwendet wir drei Stämme von C. Neoformans: das gemeinsame, gut charakterisierte Labor Stamm, H99S30und zwei klinisch isolierten Stämme der zuvor unbekannte Kapseldurchmesser, B18 und B5231.
Abbildung 1Azeigt der Workflow der Kapsel Induktion, Färbung und Bildaufnahme mit Tusche. Bilder aus allen drei Sorten sind in Abbildung 1 b Pre- und Post-Induktion gezeigt. Die Forscher werden wissen, ob die Kapsel Induktion ein Erfolg war durch die Zellen, die Kapsel Induktion unterzogen wurden, mit denen aus der gleichen Kultur, die nicht zu vergleichen. Eine deutliche Vergrößerung ergibt sich in der Regel in den meisten Stämmen nach Induktion, obwohl einige Stämme natürlich kleine Kapseln auch nach Induktion ausstellen (siehe Bilder der B18 in Abbildung 1 b). Es sei darauf hingewiesen, dass Kapsel Induktion fehl, wenn verbleibende rich-Media vor Induktion nicht entfernt wird oder wenn CO2 nicht vorhanden ist. In diesen Fällen werden nur ein geringes (falls vorhanden) Erhöhungen der Kapsel Größe beobachtet werden. Durchmessern von alle drei Stämme wurden manuell gemessen und die Ergebnisse sind in Abbildung 1dargestellt. In zwei der drei Versuche gab es keinen Unterschied in der Größe zwischen H99S und B18. Ein signifikanter Unterschied in der Größe wurde allerdings konsequent zwischen der größten Belastung, B52, und H99S und B18 beobachtet (p < 0,001 und p < 0,001, bzw. testen standard zumindest Plätze mit einfachen Kontrasten, Stichprobengröße = 50 Zellen/Stamm ).
Abbildung 2A zeigt den Workflow der Kapsel Induktion, Färbung und Bildaufnahme mit zwei fluoreszierende Farbstoffe für die Kapsel (18B7-AF488) und der Zellwand (Calcofluor White). Die Bilder wurden als Z-Stapel für alle drei Stämme nach Induktion, um sicherzustellen, dass die Kapsel und Zellkörper Höchstdurchmesser für jede Zelle zu messenden gefangen genommen wurde (Abb. 2 b) aufgenommen. Jedes Z-Stapel verarbeitet wurde, um maximale Intensität Projektionen, komprimieren die 3-dimensionale Stack in ein 2D Bild vor der Analyse (Abbildung 2) zu produzieren. Diese wurden dann manuell gemessen (Abb. 2D). Im Gegensatz zu den Messungen für Tusche gefärbten Zellen wiederholt die fluoreszierenden Färbung aktiviert uns, um die Unterscheidung zwischen allen drei Sorten auf der Grundlage ihrer Kapseldurchmesser in allen drei des Experiments. Hier, wir fanden, dass B18 die kleinste Kapseldurchmesser und B52 die größte (p < 0,001 für alle Vergleiche, standard kleinste-Quadrate-Test mit einfachen Effekten Stichprobengröße = 50 Zellen/Stamm).
Um die beiden Methoden der C. Neoformans Kapsel Färbung weiter zu beurteilen, wurden Messungen von allen drei Sorten verglichen. Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen der Kapselgrößen bestimmt mit den zwei Methoden der Färbung (Abb. 3A) (multivariate ANOVA mit einfachen Effekten Stichprobengröße = 50 Zellen/Stamm). Diese Schlussfolgerung war konsistent mit den Ergebnissen eines separaten Experiments die Lab-Belastung, H99S, Co gebeizt mit Tusche und fluoreszierende Farbstoffe (Abb. 3 b-C). Allerdings gab es größere Variabilität zwischen Experimente mit Tusche, wie durch die Tatsache belegt, die nur einer von drei Experimente einen signifikanten Unterschied in der Kapsel Größe zwischen H99S und B18 zeigten, im Vergleich zu den signifikanten Unterschied beobachtet zwischen diesen Stämmen in allen drei fluoreszierende versuchen (Abbildung3D-E) (multivariate ANOVA mit einfachen Effekten Stichprobengröße = 50 Zellen/Stamm).
Tusche gefärbten Bilder, die im Protokoll (Abschnitt 5) aufgeführten Kriterien kann mit einem automatisierten System gemessen werden. Der Workflow, dargestellt in Abbildung 4A Führer den Benutzer durch die einzelnen Schritte notwendig, die Rezepte zu nutzen soll um C. Neoformans Kapsel zu messen. Nach der Entwicklung des Workflows, wurde es durch die Messung eines Caches von vorhandenen Bildern von C. Neoformans Zellen durch drei Forscher, die mit manuellen und automatisierten Methoden validiert. Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen der Forscher Messungen bei manuell vorgenommen, und das gilt auch, wenn die Messungen erfolgten mit Hilfe automatisierter Bildanalyse-Software (Abbildung 4 b) (ANOVA, Stichprobengröße = 50 Zellen/Forscher). Allerdings gab es eine kleine aber signifikanten Unterschied in der Kapsel Größe berichtet zwischen den beiden Methoden (Abbildung 4) ANOVA, Stichprobengröße = 150 Zellen/Gruppe. Kapseldurchmesser war durchweg etwas kleiner gemessen durch Automation als manuelle Messungen (0,3 µm, p < 0,001). Darüber hinaus war im Vergleich zwischen Kapsel Größenmessungen separate Forscher vom gleichen Bild setzt den Standardfehler kleiner Verwendung Bildanalyse-Software wurde zur Quantifizierung anstelle von manuellen Methoden, die suggestiv von mehr präzise, reproduzierbare Messungen mit der automatisierten Methode. Für die erfolgreiche automatisierte Messung Zellen müssen in den Mittelpunkt rücken, haben ein Medium zu großen Kapsel und nicht übermäßig sein (Abbildung 4) gruppiert. Wir fanden, dass schlecht fokussierte Aufnahmen von gruppierten Zellen mit kleinen Kapseln in der Software nicht automatisch gemessen werden konnte. Aber behaupten wir, dass diese möglicherweise auch eine Herausforderung, genau mit manuellen Methoden zu messen.
Abbildung 1 : Tusche Färbung zur Messung der C. Neoformans Kapsel. (A) Schematische Darstellung des C. Neoformans Kapsel Messung mittels Tusche Färbung. In Kürze Kapsel Ausdruck wird induziert mit Nährstoff Deprivation und Einwirkung von CO2, die Zellen sind Nukleinsäuretablette in Tusche und auf Objektträger montiert. Bilder von gefärbten Zellen werden von Lichtmikroskopie mit Feldern erworben, die entweder durch den Benutzer oder Kachel-Scannen mit einer computergesteuerten Phase ausgewählt. Bilder können entweder manuell analysiert oder für automatisierte Bild Segmentierung und Analyse aufbereitet. (B) Bilder von der gemeinsamen Labor-Stamm, H99S und zwei klinische Stämme, B18 und B52, Pre- und Post-Kapsel Induktion. Maßstabsleisten repräsentieren 10 µm (C) Diagramm eines Vertreters experimentieren zeigt Kapseldurchmesser aller drei Sorten mit Tusche befleckt und manuell gemessen (Fehler wird als Standardfehler (SE) dargestellt). Statistischer Signifikanz ist wie folgt angegeben: *, p < 0,05; **, p < 0,01; und ***, p < 0,001. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Fluoreszierende Färbung zur Messung der C. Neoformans Kapsel. (A) schematische Darstellung der C. Neoformans Kapsel Messung mit Calcofluor White (CFW) und Co 18B7-AF488 Färbung. Nach Kapsel Induktion und Färbung sind die Zellen montiert und durch Laser-scanning-konfokalen Mikroskopie abgebildet. Zellen in verschiedenen fokalen Ebenen sein mögen, sind Z-Stacks in jeder Position erworben. Diese werden verarbeitet, um maximale Intensität Projektionen zu produzieren, die verwendet werden, um die maximale Kapseldurchmesser für jede Zelle genau zu messen. (B) Bilder von der gemeinsamen Labor-Stamm, H99S und zwei klinische Stämme, B18 und B52, Post-Kapsel Induktion. Hinweis: Maßstabsleisten repräsentieren 10 µm für alle Bilder. (C) maximale Intensität Projektionen von Eindringmittel C. Neoformans Zellen bezeichnet. (D) Diagramm eines repräsentativen Experiment zeigt manuell gemessen Kapseldurchmesser aller drei Sorten gebeizt mit CFW und 18B7-AF488 (Fehler wird als Standardfehler (SE) dargestellt). Statistischer Signifikanz ist wie folgt angegeben: *, p < 0,05; **, p < 0,01; und ***, p < 0,001. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Vergleich der Ergebnisse zwischen Tusche und fluoreszierende Färbung. (A) Analyse von drei C. Neoformans Stämmen gebeizt mit Tusche oder Fluoreszenzfarbstoffen, n = 3 (Fehler wird als Standardfehler (SE) dargestellt). (B) Bilder von einer einzigen Zelle C. Neoformans gebeizt mit Tusche und beide Fluoreszenzfarbstoffe (Maßstabsleiste steht für 13 µm). Horizontale Linien markieren die Kanten der Kapsel und vertikale Linien markieren die Kanten der Zellkörper. (C) Quantifizierung eines repräsentativen Experiments H99S Co gebeizt mit Tusche und fluoreszierende Farbstoffe (Fehler wird als Standardfehler (SE) dargestellt). (D, E) Darstellung der Kapseldurchmesser Variabilität zwischen Tusche Experimenten (D) und fluoreszierende Experimente (E). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Computergestützte Analyse von C. Neoformans Kapseldurchmesser von den Bildern der Tusche gefärbten Zellen. (A) schematische Darstellung des Bildes Segmentierung und C. Neoformans Kapsel Messung über eine automatisierte Messtechnik (siehe Tabelle der Materialien). (B) Vergleich der Kapsel Messungen durch 3 separate Ermittler mit Handbuch (Manual 1-3) und automatisierte Methoden (Automated 1-3). Jeder Prüfer verwendet einen identischen Cache von C. Neoformans Bilder von beiden Methoden (Fehler wird als Standardabweichung dargestellt). (C) kombiniert Durchschnitt von manuellen Messungen und automatisierte Messungen (Fehler wird als Standardfehler (SE) dargestellt). Beispiele für beide (D) Ideal und (E) nicht-ideale Bilder von C. Neoformans. Non-Ideal-Bildern können nicht erfolgreich in der Software gemessen werden. Statistischer Signifikanz ist wie folgt angegeben: *, p < 0,05; **, p < 0,01; und ***, p < 0,001. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Die Kapsel ist seit Jahrzehnten ein wichtiger Schwerpunkt der Forschung für Mykologen und Kliniker C. Neoformans und Kryptokokkose wegen seiner Rolle als Virulenzfaktor der großen der Erreger interessiert. Mit Mikroskopie zu können messen Kapsel Größenunterschiede zwischen den Stämmen und unter verschiedenen Wachstum Bedingungen wichtigen Informationen über den Erreger und seine Reaktionen auf verschiedene Reize (z.B. unterschiedliche Umweltbedingungen mögliche medikamentöse Behandlungen, etc.) hier haben wir eine Methode, um das Wachstum der Kapsel in C. Neoformansinduzieren skizziert und gegenüber zwei verschiedenen Kapsel Färbung Protokolle. Zu guter Letzt haben wir gezeigt, wie Bildanalyse-Software verwendet werden kann, um die Messung von Kapseldurchmesser von den Bildern der Tusche gefärbten Zellen, Resultate, die vergleichbar mit manuellen Messmethoden wurden zu automatisieren.
In unseren Experimenten verglichen wir zwei klinische Stämme, B18 und B52, mit H99S, ein standard-Lab-Stamm von bekannten Kapsel Größe18. Beide beflecken Methoden haben gezeigt, dass die klinischen Belastung, B52, hatte die größte Kapseldurchmesser der drei Sorten getestet. Ergebnisse von fluoreszierenden Messungen konnten jedoch einen Unterschied zwischen den beiden Stämmen mit kleineren Kapsel Größe erkennen, wo die Tusche Messungen nicht waren. Die Ergebnisse aus beiden Methoden der Färbung entsprachen, was darauf hindeutet, dass beide gültig aber, dass mit Bildern von Eindringmittel C. Neoformans befleckt können für erhöhte Empfindlichkeit bei der Messung der Stämme mit der kleinen Kapsel. Mit maximalen Projektionen erzeugt aus Z-Stapel Bilder von Eindringmittel gefärbte Zellen können die Forscher um sicherzustellen, dass genaue Kapseldurchmesser Messungen vorgenommen werden können, auch wenn die abgebildeten Zellen in verschiedenen fokalen Ebenen sind. Diese Messungen sind schwieriger für C. Neoformans abgebildet, mit Tusche und standard Lichtmikroskopie. In jedem gegebenen Bild können benachbarte Zellen in leicht unterschiedlichen fokalen Ebenen, macht es schwierig, genau die Zellkörper-Kapsel-Grenze für alle Zellen zu beheben sitzen. Dies könnte möglicherweise die Fähigkeit der Ermittler, kleine Änderungen in der Kapsel Größe oder kleine Unterschiede zwischen den Stämmen erkennen verwechseln.
Jede Methode hat seine eigenen Vorteile. Tusche ist die am häufigsten von Forschern aufgrund seiner Erschwinglichkeit, einfache Handhabung und Stabilität (es nicht abgebaut, im Laufe der Zeit wie einige fluoreszierenden Flecken können) verwendet. Da Tusche eine einfache, negative Fleck ist kann es in Verbindung mit standard Lichtmikroskopen verwendet werden die leichter verfügbar als Fluoreszenz Mikroskope sind. Jedoch kann wenn nicht in den richtigen Proportionen (Indien Tinte: Puffer) verwendet, der Fleck einen "gefiederten" Hintergrund abgebildet, erstellen, der automatisierte Bildanalyse erschweren können. Während teuer und aufwändiger zu verwenden, fluoreszierende Farbstoffe für ihre Flexibilität, vorteilhaft sein können und wie wir ihre Sensibilität zeigen. Sie eignen sich besonders für die Messung der Kapsel Größe und Zelle Belastung in Experimente mit C. Neoformans , die haben phagozytiertes wurde von Immunzellen und sind notwendig für die histologische Untersuchung von C. Neoformans Kapsel in Gewebeproben (eine Technik, die nicht in diesem Artikel beschriebenen)32. Wenn Färbung mit Fluoreszenzfarbstoffen wie Calcofluor white oder Gewebekulturen tagged Anti-GXM Antikörper, problematisch ist (z.B.unzureichende Färbung), dies kann in der Regel durch die Optimierung der Färbung Protokolls überwunden werden (Erhöhung/Verringerung der Konzentration und/oder Inkubation Zeit mit dem Farbstoff).
Unabhängig von der Färbung Methodik, finden wir, dass die Kapsel Induktion und ordnungsgemäße Bilderfassung wichtige Schritte im Protokoll sind. Das Protokoll in diesem Dokument beschriebenen ist einer der mehrere Standardmethoden für die Kapsel Induktion in C. Neoformans und hat erfolgreich in Hefe Labors für viele Jahre23eingesetzt. C. Neoformans Kapsel Induktion ist CO2-abhängig und tritt nur unter stressigen Bedingungen23,33. Daher ist es wichtig, dass sie in einem 5 % CO2 Inkubator mit einer entsprechenden Nährstoff mangelhaft Wachstumsmedium auftritt. Wenn der Verdacht besteht, dass Kapsel wurde nicht nach einer Regelstudienzeit Inkubation (in der Regel 18-24 h) induziert, sollten die Zellen eine uninduced Kontrollkultur verglichen werden, die nicht zu stressigen Bedingungen ausgesetzt war. Ein Vergleich der beiden bestimmt, ob die Induktion wirksam war. Eine erfolgreiche Einarbeitung gehört in denen der Großteil der Zellen eine größere Kapsel, im Vergleich zur uninduced Kontrolle machen. Weil nicht alle Zellen induziert wird, sollten die Zellen zu messenden eine heterogene Darstellung der verfügbaren Zellen sein.
Die Bedeutung der konsequente Bildaufnahme kann nicht überbewertet werden, vor allem, wenn automatisierte Messung das Ziel ist. Fokus, Kontrast, Hintergrundfluoreszenz sowie die Bit-Tiefe und Bild Komprimierung der Dateien sind wichtige Gesichtspunkte. Wenn möglich, sollten große Cluster von Zellen, die nicht in einem einzigen Brennebene sitzen vermieden werden, obwohl einige Knospen, und berühren Zellen akzeptabel sind und unvermeidlich sein können (diese Regel befolgt werden für die manuelle und automatisierte Messung). Dieses Problem kann zu einem gewissen Grad umgangen werden, wenn mit Hilfe von confocal imaging von Eindringmittel Zellen befleckt. Die Verwendung von Z-Stapel, maximale Intensität Projektionen zu produzieren können genaue Messung von Zellen in verschiedenen fokalen Ebenen aus einem einzigen Bild29. Darüber hinaus sollten die Bilder schnell nach Vorbereitung der Probe erworben werden. Dies ist besonders wichtig für Tusche gefärbten Proben wie wenn sie trocknen, der Kontrast zwischen Hintergrund und Vordergrund Elemente (die Zellen) zu vermindern kann und unerwünschten Hintergrund Features verbessert werden können, reduziert, das führt zu automatisierten Segmentierung Genauigkeit.
Obwohl Kapseldurchmesser Messungen an der Tagesordnung in der C. Neoformans Gemeinschaft sind, wurden bis zu diesem Zeitpunkt sie in der Regel manuell durchgeführt, erfordert viel Zeit und Manpower. Jedoch manuelle Messungen werden im Feld akzeptiert und Ergebnisse können mit geringem Aufwand. Fortschritte in der Bildanalyse-Software haben die ersten Schritte in Richtung Automatisierung dieser Messungen ermöglicht. Die einfache Art der C. Neoformans Zellkörper und Kapsel - erscheint als ein Kreis innerhalb eines Kreises - in 2D Bilder macht die Messung ihrer Größe relativ einfach für automatisierte Bild Segmentierung Softwarepakete, ohne die Notwendigkeit zur Entwicklung neuer Algorithmen. Stattdessen durch die Verknüpfung von bestehender Algorithmen, C. Neoformans Zellen und Kapseln können erkannt, segmentiert und gemessen werden. Mit diesem Ansatz haben wir die Messungen der C. Neoformans Kapseldurchmesser automatisiert, für Zellen mit den am häufigsten gebrauchten Kapsel Farbstoff, Tusche befleckt, und haben im Vergleich zu manuellen Messungen für die gleichen Datensätze. Diese Methode bietet den Vorteil der Reproduzierbarkeit und entfernen ein Großteil der menschlichen Fehler im Zusammenhang mit manuellen Messung während der Forscher Zeitersparnis. Darüber hinaus können weitere Messungen mit minimalem Aufwand in der automatisierten Analyse-Workflow integriert werden. Wir fühlen, dass automatisierte Bildanalyse ein vielversprechender Ansatz, der Forscher um große Anzahl von C. Neoformans Kapsel mit ein hohes Maß an Genauigkeit und Effizienz messen können.
Alles in allem haben wir gezeigt, wie man erfolgreich Kapsel Wachstum in C. Neoformanszu induzieren, färben die Proben mit Tusche oder fluoreszierende Farbstoffe und Messen mit Hilfe von manuellen und automatisierten Messungen in einer Bildanalyse Kapseldurchmesser Software. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass beide Methoden der Färbung lebensfähig sind und in der Regel konsistente Ergebnisse zu produzieren, (obwohl es mehr Variabilität mit Tusche Messungen gibt). Weiter, sowohl manuelle als auch automatisierte Methoden der Messung haben die Fähigkeit, unterschiedliche Kapselgrößen zu erkennen.
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Disclosures
Der Autor, Hoyin Lai, ist der Produktmanager bei DRVision, die die automatisierte Bildanalyse-Software Aivia veröffentlicht.
Acknowledgments
Wir danken der molekularen Biowissenschaften (MOBI) Doktorat und die Biologie-Abteilung am Middle Tennessee State University (MTSU) für die Bereitstellung der Mittel für diese Studie. Das Projekt wurde auch teilweise durch eine spezielle Projekte Stipendium, D.E.N. die MTSU Foundation finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Capsule Induction | |||
| C. neoformans cells | The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University). The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania). | ||
| Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD) | Fisher Scientific | DF0428-17-5 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O) | ||
| DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | |
| 6-well plates | Falcon | CL5335-5EA | |
| Shaking incubator | Thermo Scientific | MaxQ6000 | |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | Isotemp | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Legend XTR | |
| Staining | |||
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Legend Micro 21R | |
| India ink | Fisher Scientific | 14-910-56 | |
| Calcofluor white | Sigma-Aldrich | 18909-100ML-F | |
| 18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488 | A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University) | ||
| PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA) | PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized. | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Glass coverslips | Corning | 2855-18 | #1.5 thickness |
| Clear nail polish or other non-toxic sealant | |||
| Image Acquisition | |||
| Immersion oil | Cargille | 16484 | |
| Light microscope with immersion oil objective | Zeiss | Zeiss Axio A1 with a Plan - NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective | |
| Light microscope camera | Zeiss | Zeiss Axiocam ErCD camera | |
| Confocal microscope with oil immersion objective | Zeiss | LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective. | |
| Confocal microscope software | Zen 2009 | ||
| Confocal microscope camera | Nikon | Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer. | |
| Widefield imaging software | Nikon Elements (Nikon) | ||
| Capsule Measurement | |||
| Image editing software | Photoshop (Adobe) | ||
| Microscope software for manual measurement | Axiovision (Carl Zeiss) | ||
| Image analysis software for automated meesurement | Aivia (DRVision Technologies) | ||
| Spreadsheet software | Excel (Microsoft) |
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