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Immunology and Infection

आकार मामलों: कैप्सूल व्यास का माप Cryptococcus neoformans में

Published: February 27, 2018 doi: 10.3791/57171
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, *1, *1
1Department of Biology, Middle Tennessee State University, 2DRVision Technologies
* These authors contributed equally

Summary

polysaccharide कैप्सूल Cryptococcus neoformans में प्राथमिक डाह कारक है और इसका आकार तनाव डाह के साथ संबद्ध है । कैप्सूल व्यास माप phenotypic परीक्षण में उपयोग किया जाता है और चिकित्सीय प्रभावकारिता गेज करने के लिए. यहां कैप्सूल प्रेरण की एक मानक विधि प्रस्तुत की है, और धुंधला और माप व्यास के दो तरीकों की तुलना कर रहे हैं ।

Abstract

Cryptococcus neoformans के polysaccharide कैप्सूल प्राथमिक डाह कारक और इस रोगजनक खमीर के सबसे अधिक अध्ययन किया पहलुओं में से एक है । कैप्सूल आकार उपभेदों के बीच व्यापक रूप से भिंन हो सकते हैं, तेजी से विकसित करने की क्षमता है जब तनावपूर्ण या कम पोषक तत्वों की स्थिति के लिए शुरू की है, और सकारात्मक तनाव डाह के साथ संबद्ध किया गया है । इन कारणों से, कैप्सूल का आकार C. neoformans शोधकर्ताओं के लिए बहुत रुचि का है । सी. neoformans कैप्सूल की वृद्धि phenotypic परीक्षण के दौरान प्रेरित खमीर या तनाव के बीच अंतर आकार पर विभिंन उपचार के प्रभाव को समझने में मदद करता है । यहाँ हम कैप्सूल प्रेरण के मानक तरीकों में से एक का वर्णन और दाग और माप कैप्सूल व्यास के दो स्वीकृत तरीकों की तुलना: (i) भारत स्याही, एक नकारात्मक दाग, पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया और (ii) सह के साथ धुंधला दोनों सेल दीवार और कैप्सूल फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा पीछा की फ्लोरोसेंट रंजक । अंत में, हम भारत स्याही से कैप्सूल व्यास की माप कैसे दिखाते हैं-सना हुआ नमूनों गणनात्मक छवि विश्लेषण का उपयोग कर स्वचालित किया जा सकता है.

Introduction

एक चौथाई लाख लोगों को हर साल प्रभावित और अधिक से अधिक १८०,००० मौतों में जिसके परिणामस्वरूप, Cryptococcus neoformans एक रोगजनक, intracellular खमीर और प्रेरणा का एजेंट है cryptococcosis1,2, 3. सबसे मुश्किल हिट गरीब देशों में एचआईवी पॉजिटिव रोगियों जो एंटीरेट्रोवाइरल चिकित्सा के लिए तैयार पहुंच नहीं है, उंहें तीव्रता से बीमारी4,5,6के लिए अतिसंवेदनशील बना रहे हैं । सीडीसी से डेटा संकेत मिलता है कि उप में सहारा अफ्रीका, सी neoformans प्रतिवर्ष और अधिक क्षय रोग से अधिक लोगों को मारता है और हर महीने रिकॉर्ड1पर किसी भी Ebola प्रकोप से । जोखिम का सबसे आम मार्ग शुष्क बीजाणुओं कि पर्यावरण में आम है7श्वास से होता है । फेफड़ों में प्रवेश करने पर, वहां कई डाह कारकों है कि संक्रमित व्यक्तियों के भीतर सी. neoformans की सफलता के लिए योगदान कर रहे हैं । polysaccharide कैप्सूल सूक्ष्म जीव के प्राथमिक डाह कारक माना जाता है, के रूप में acapsular उपभेदों विषमय 8 नहीं हैं ।

cryptococcal कैप्सूल तीन सिद्धांत घटकों से बना है: glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM), और mannoproteins (एमपीएस)9. जबकि सांसद एक अपेक्षाकृत छोटे सेल दीवार कैप्सूल के घटक जुड़े हैं, वे immunogenic है और एक ज्यादातर समर्थक भड़काऊ प्रतिक्रिया9,10को बढ़ावा कर सकते हैं । इसके विपरीत, GXM और GalXM कैप्सूल के थोक बनाने के लिए (> 90% वजन से) और immunosuppressive प्रभाव है11. इसके इम्यूनोमॉड्यूलेटरी प्रभाव के अलावा, vivo में कैप्सूल की तेजी से वृद्धि मेजबान phagocytic कोशिकाओं (यानी, न्यूट्रोफिल और मैक्रोफेज)12द्वारा घूस के लिए एक यांत्रिक बाधा पैदा करता है । सी. neoformans कैप्सूल और इसके संश्लेषण जटिल हैं, लेकिन कुल मिलाकर, वृद्धि हुई कैप्सूल व्यास वृद्धि हुई डाह6,13,14के साथ संबंधित है । इसे देखते हुए, यह C. neoformans शोधकर्ताओं के लिए महत्वपूर्ण है करने के लिए जल्दी और सही ढंग से कैप्सूल माप कर सकता है ।

C. neoformans सेल और इसके polysaccharide कैप्सूल गतिशील संरचनाओं और समय15के साथ परिवर्तन दिखा रहे हैं । कैप्सूल घनत्व, आकार, और विधानसभा में मेजबान पर्यावरण16,17,18में परिवर्तन के जवाब में बदल सकते हैं । कम लौह या पोषक तत्व का स्तर, सीरम के लिए जोखिम, मानव शारीरिक पीएच, और वृद्धि की सह2 कैप्सूल विकास शुरू करने के लिए जाना जाता है16,18,19,20. इसके अलावा, शोधकर्ताओं ने एक संक्रमण के दौरान immunoreactivity में महत्वपूर्ण मतभेदों में जिसके परिणामस्वरूप संरचनात्मक परिवर्तन दिखाया है, अपने मेजबान21,22से अधिक C. neoformans के लिए एक लाभ उधार । यह इसलिए जाना जाता है क्योंकि सी. neoformans कैप्सूल की वास्तुकला का कई तरह से विश्लेषण किया गया है । इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, उदाहरण के लिए, पता चला है कि कैप्सूल एक भीतरी इलेक्ट्रॉन के साथ एक विषम मैट्रिक्स है एक बाहरी, अधिक पारगंय परत23के नीचे घने परत. लाइट कैटरिंग और ऑप्टिकल चिमटी के उपयोग ने शोधकर्ताओं को इसके macromolecular गुण24को आगे स्पष्ट करने की अनुमति दी है । दोनों स्थिर और गतिशील प्रकाश बिखरने माप से परिणामों का विश्लेषण, हम जानते हैं कि polysaccharide कैप्सूल एक जटिल बंटी संरचना है23. ऑप्टिकल चिमटी संरचना की कठोरता का परीक्षण करने के साथ ही अपनी एंटीबॉडी जेट24का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । हालांकि, सी. neoformans कैप्सूल का अब तक का सबसे अक्सर कार्यरत विश्लेषण इसके आकार का माप है ।

कैप्सूल आकार के लिए, शोधकर्ताओं का उपयोग क्या एक सरल माप होना चाहिए: कैप्सूल के रैखिक व्यास. डिजिटल सूक्ष्मदर्शी एकाधिक सी. neoformans कोशिकाओं (आम तौर पर सैकड़ों) या तो भारत स्याही या फ्लोरोसेंट रंगों के साथ दाग की छवियों पर कब्जा करने के लिए उपयोग किया जाता है । प्रत्येक कोशिका शरीर और आसपास के कैप्सूल का आकार मापा जाता है । डेटा संकलित कर रहे हैं, और कैप्सूल का औसत व्यास पूरे सेल व्यास (कोशिका शरीर + कैप्सूल) से कोशिका शरीर व्यास घटाकर द्वारा गणना की है. इस बिंदु तक, इन माप मैंयुअल रूप से किया गया है । जबकि आम तौर पर सटीक, इस विधि शोधकर्ताओं के लिए कमियां है । बड़े डेटा सेट दिन या सप्ताह भी हाथ से विश्लेषण करने के लिए ले जा सकते हैं । और क्योंकि इन माप मैंयुअल रूप से किया जाता है, मनोवाद और मानव त्रुटि परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं ।

स्वचालित अभिकलनी छवि विश्लेषण आणविक कोशिका जीवविज्ञान के कई क्षेत्रों में शोधकर्ताओं के लिए एक अपरिहार्य उपकरण बन गया है, जैविक छवियों के तेजी से और अधिक विश्वसनीय विश्लेषण को सक्षम करने 25,26,27. सटीक छवि विश्लेषण तकनीक क्या अक्सर जटिल और विशाल डेटा सेट कर रहे है से मात्रात्मक जानकारी खदान के लिए आवश्यक हैं । हालांकि, कुछ माप, विशेष रूप से C. neoformans कैप्सूल की माप, को स्वचालित करने के लिए कठिन हो गया है । सही ढंग से सेल दीवार और कैप्सूल है, जो आम तौर पर एक काले अंगूठी के रूप में प्रकट होता है जब चरण के विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा छवि के बीच इंटरफेस की पहचान, एक साधारण सीमा का उपयोग कर हल करने के लिए परेशानी हो सकती है । इसके अलावा, संस्कृति में C. neoformans कोशिकाओं का झुरमुट एक साथ करते हैं और कोशिकाओं के सटीक विभाजन सटीक माप के लिए आवश्यक है ।

इस परियोजना का उद्देश्य था (i) C. neoformans में कैप्सूल प्रेरण के लिए मानक प्रोटोकॉल में से एक को दर्शाना, (ii) तुलना और कंट्रास्ट भारत स्याही और प्रतिदीप्ति धुंधला के रूप में वे कैप्सूल व्यास माप से संबंधित, (iii) सरल विकसित, गणना करने के तरीके कैप्सूल व्यास भारत स्याही की छवियों का उपयोग करने के लिए उपाय एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, और, (iv) कैप्सूल व्यास को मैन्युअल रूप से मापने और सॉफ्टवेयर स्वचालन का उपयोग करने के लाभों और सीमाओं का आकलन. हम पाते है कि दो धुंधला तरीके, सेल दीवार और कैप्सूल के फ्लोरोसेंट लेबलिंग, जबकि अधिक समय लेने वाली, प्रयोगों के बीच सबसे सुसंगत परिणाम प्रदान की है । हालांकि, दोनों तरीकों हमें सफलतापूर्वक अलग कैप्सूल आकार का प्रदर्शन लैब और नैदानिक सी. neoformans उपभेदों के बीच भेद करने के लिए सक्षम होना चाहिए । इसके अलावा, हम भारत स्याही सना हुआ छवियों से कैप्सूल व्यास के माप को स्वचालित करने में सक्षम थे और पाया कि इस कैप्सूल के मैनुअल माप के लिए एक व्यवहार्य विकल्प था ।

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Protocol

नोट: C. neoformans एक सुरक्षा स्तर 2 (बीएसएल-2) रोगज़नक़ और इसके साथ काम कर रहे शोधकर्ताओं को उचित एहतियात बरतना चाहिए । कैसे सुरक्षित बीएसएल के साथ काम करने के लिए पर विस्तृत प्रक्रिया-2 रोगजनकों रोग नियंत्रण के लिए केंद्र पर पाया जा सकता है (सीडीसी) वेबसाइट है, लेकिन यह ध्यान रखें कि सभी व्यक्तियों के साथ संपर्क में आने के लिए महत्वपूर्ण है C. neoformans ठीक से निपटने में प्रशिक्षित किया जाना चाहिए रोगजनक एजेंटों और हमेशा उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण (पीपीई), आम तौर पर लेटेक्स या nitrile दस्ताने पहनना चाहिए । इसके अलावा, केंद्रापसारक पर रोटर के नमूनों की aerosolization को रोकने और किसी भी फैल तुरंत एक 10% ब्लीच समाधान28का उपयोग कर साफ बंद कर दिया जाना चाहिए ।

1. कैप्सूल प्रेरण

नोट: सभी कदम कमरे के तापमान पर किया जाना चाहिए जब तक अंयथा उल्लेख किया ।

  1. संस्कृति C. neoformans में खमीर peptone डेक्सट्रोज (YPD) शोरबा (pH ६.५ +/-०.२) और जब तक वे लॉग चरण (लगभग 18-36 ज) में है मिलाते हुए के साथ ३७ ° c पर मशीन ।
  2. 5 मिनट के लिए 21 डिग्री सेल्सियस पर ८७० एक्स जी में कोशिकाओं केंद्रापसारक और फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के साथ तीन बार धो लो ।
  3. एक hemocytometer का प्रयोग करें (या एक स्वचालित सेल काउंटर) के लिए कोशिकाओं की गणना और 2 x 105 कोशिकाओं में reसस्पैंड/Dulbecco के ंयूनतम आवश्यक मीडिया (DMEM) में 2 मिलीलीटर ।
  4. कैप्सूल प्रेरित करने के लिए, ३७ ° c और 5% सह2 पर मशीन 18 एच के लिए ।
    नोट: मीडिया में पोषक तत्वों के अभाव और सह2 की उपस्थिति के संयोजन सी. neoformans कैप्सूल विकास को उत्तेजित करता है ।
  5. बाद की मशीन, कटाई के द्वारा कोशिकाओं (ऊपर के रूप में) और सभी को हटाने लेकिन 5-10 µ l supernatant । एक ही समय में, प्रत्येक तनाव मापा जा करने के लिए एक इसी संयुक्त राष्ट्र प्रेरित सेल नमूना फसल । नकारात्मक नियंत्रणों के रूप में इन का उपयोग करें ।
    नोट: सेल छर्रों बहुत छोटा हो जाएगा और देखने के लिए मुश्किल हो सकता है. aspirating supernatant करते समय सावधानी बरतें ।
  6. या तो भारत स्याही (धारा २.१) या फ्लोरोसेंट रंजक (धारा २.२) के साथ दाग ।

2. धुंधला

  1. केवल भारत स्याही के साथ धुंधला
    1. भारत स्याही के साथ खमीर दाग, शेष supernatant में गोली reसस्पेंड और 4μL (लगभग आधे) सेल निलंबन और भारत स्याही के 4μL के एक गिलास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर जोड़ने के लिए । धीरे मिश्रण और फोम से बचने के ।
    2. एक 13 मिमी ग्लास coverslip (#1 .5 मोटाई) लागू करें और एक गैर विषैले सीलेंट (साफ नेल पॉलिश) के साथ सील किनारों के नमूने बाहर सुखाने से रोकने के लिए ।
  2. केवल फ्लोरोसेंट रंजक के साथ धुंधला
    1. एक फ्लोरोसेंट डाई के साथ खमीर दाग, ५० µ l पंजाब में 1% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) के साथ सेल गोली reसस्पेंड ।
    2. Calcofluor सफेद (CFW) की एक समान मात्रा के साथ संस्कृति की मशीन (1 µ g/एमएल) और कैप्सूल मॉब 18B7 ( सामग्री की तालिकादेखें) संयुग्मित करने के लिए AlexaFluor488 (AF488) (10 µ g/एमएल) 30 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर ।
    3. 5 मिनट के लिए 21 डिग्री सेल्सियस के बाद-मशीन और महाप्राण supernatant पर ८७० x जी में कोशिकाओं केंद्रापसारक ।
    4. 1% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) के साथ 10 µ l पंजाब में सेल गोली reसस्पेंड ।
    5. पिपेट एक ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर सेल निलंबन के 8 µ एल ।
    6. एक 13 मिमी ग्लास coverslip (#1 .5 मोटाई) लागू करें और एक गैर विषैले सीलेंट (साफ नेल पॉलिश) के साथ सील किनारों के नमूने बाहर सुखाने से रोकने के लिए ।
  3. दोनों भारत स्याही और फ्लोरोसेंट रंजक के साथ धुंधला
    1. के लिए और अधिक सीधे भारत स्याही की प्रभावकारिता कि फ्लोरोसेंट रंजक के दाग की तुलना, सह दाग के दोनों प्रकार के साथ ही सेल जनसंख्या दाग । ऐसा करने के लिए, पहले दोनों एक फ्लोरोसेंट कैप्सूल और सेल दीवार के दाग के साथ गर्मी की कोशिकाओं, 2.2.1-2.2.3 कदम के अनुसार ।
    2. अगले, पिपेट बराबर मात्रा (4 µ एल) एक गिलास स्लाइड पर फ्लोरोसेंट दाग सेल निलंबन और भारत स्याही की । लिएर मिक्स गर्ने ।
    3. एक 13 मिमी ग्लास coverslip (#1 .5 मोटाई) लागू करें और एक गैर विषैले सीलेंट (साफ नेल पॉलिश) के साथ किनारों सील बाहर सुखाने से नमूने को रोकने के लिए ।

3. छवि अधिग्रहण/

  1. इमेजिंग कोशिकाओं भारत स्याही के साथ दाग ।
    1. एक मानक प्रकाश माइक्रोस्कोप (100X आवर्धन) का उपयोग कर छवियों का अधिग्रहण ।
    2. छवि शर्त प्रति ५० कोशिकाओं की एक ंयूनतम ।
      नोट: प्रति फ़ील्ड कक्षों की संख्या भिंन होगी, और यह स्वीकार्य है । यह महत्वपूर्ण है, तथापि, कि अतिव्यापी कोशिकाओं को कम से कम रखा जा, के रूप में इन को मापने के लिए मुश्किल है (दोनों मैंयुअल रूप से और स्वचालित सॉफ्टवेयर के साथ) । इन प्रयोगों के लिए, छवियों के साथ 16 बिट्स की गहराई पर अधिग्रहीत किया गया था जोखिम बार छवि कंट्रास्ट को अधिकतम करने के लिए अनुकूलित जबकि कम कोशिकाओं के छोटे आंदोलनों के कारण धुंधला.
  2. इमेजिंग कोशिकाओं फ्लोरोसेंट रंजक के साथ सना हुआ
    1. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा कोशिकाओं की छवि के लिए, माइक्रोस्कोप इमेजिंग सॉफ्टवेयर खोलने के लिए और उपयुक्त उत्तेजना और fluorophores इस्तेमाल के लिए उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य का चयन करें (CFW और AF488 405nm और ४८८ एनएम रोशनी, क्रमशः का उपयोग कर उत्साहित हैं) । एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवियों का अधिग्रहण ।
    2. छवि शर्त प्रति ५० कोशिकाओं की एक ंयूनतम ।
      नोट: प्रति फ़ील्ड कक्षों की संख्या भिंन होगी, और यह स्वीकार्य है । यह महत्वपूर्ण है, तथापि, कि अतिव्यापी कोशिकाओं को कम से कम के रूप में इन को मापने के लिए मुश्किल है (दोनों मैंयुअल रूप से और स्वचालित सॉफ्टवेयर के साथ) रखा जाएगा ।
    3. सुनिश्चित करें कि किसी दिए गए फ़ील्ड में प्रत्येक कक्ष के लिए अधिकतम कैप्सूल व्यास प्राप्त किया है करने के लिए कक्षों की एक z-स्टैक छवि श्रृंखला प्राप्त करें ।
      1. माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ्टवेयर में, "जेड-ढेर" पट्टी को खोलने के लिए "z-स्टैक" नियंत्रण कक्ष पर क्लिक करें, फिर पैनल के शीर्ष बाएँ कोने में "प्रथम/अंतिम" विकल्प का चयन.
      2. एक स्तर है कि एक एकल खमीर सेल और देखने के वर्तमान क्षेत्र के भीतर सभी के लिए कैप्सूल के व्यापक बिंदु से नीचे है पर ध्यान केंद्रित करने के लिए और "पहले सेट" पर क्लिक करें माइक्रोस्कोप पर ठीक से ध्यान केंद्रित नियंत्रण का उपयोग ।
      3. दृश्य के वर्तमान फ़ील्ड के भीतर सभी कक्षों के लिए और कैप्सूल के समान कक्ष के कक्ष मुख्य भाग के विस्तृत बिंदु के ऊपर फ़ोकस करने के लिए ठीक-फ़ोकस नियंत्रण का उपयोग करें और "अंतिम सेट" क्लिक करे ।
      4. उसके बाद, वर्तमान स्थिति के लिए z-स्टैक प्राप्त करने के लिए "प्राप्ति" टैब पर "प्रयोग प्रारंभ करें" क्लिक करे । एक से अधिक स्थानों पर प्रक्रिया को दोहराएँ जब तक z-स्टैक छवियों की एक न्यूनतम ५० कक्षों का अधिग्रहण किया गया है ।
        नोट: इन प्रयोगों के लिए, फोकल pinhole के लिए सेट किया गया था १.० AU और एक अतिव्यापी z-श्रृंखला के 10-20 स्लाइस को कवर ०.७ µ मीटर प्रत्येक चयनित पदों पर अधिग्रहीत किया गया था । AU = हवादार इकाई ।
    4. अगला, प्रत्येक z-स्टैक श्रृंखला अधिकतम तीव्रता अनुमानों (MIP) में उपयुक्त छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर कनवर्ट करें ।
      नोट: MIPs परियोजना खड़ी छवि के हर विमान में सबसे बड़ी तीव्रता29। MIPs बनाना एक के लिए छवियों का एक 2-डी प्रतिनिधित्व है कि कब्जा कर लिया 3 डी ढेर के भीतर अधिकतम सेल और कैप्सूल व्यास के अनुरूप उत्पादन करने की अनुमति देता है ।
  3. इमेजिंग कोशिकाओं भारत स्याही और फ्लोरोसेंट रंजक दोनों के साथ दाग
    1. या तो एक widefield (40X इज़ाफ़ा) या फोकल माइक्रोस्कोप (63X या 100X इज़ाफ़ा) का उपयोग कर छवियों को प्राप्त । दोनों भारत स्याही और फ्लोरोसेंट रंगों से सना हुआ कोशिकाओं के लिए, एक कंप्यूटर नियंत्रित मंच और तेल विसर्जन उद्देश्य से सुसज्जित एक widefield माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवियों पर कब्जा ।
      नोट: उपयोग में माइक्रोस्कोप एक इमेजिंग सॉफ्टवेयर CFW का उपयोग कर नियंत्रित किया जाना चाहिए । प्रतिदीप्ति कि एक 340-380 एनएम उत्तेजना फिल्टर के माध्यम से उत्साहित है, और उत्सर्जित प्रकाश एक 435-485 एनएम बैरियर एक ४०० एनएम dichroic दर्पण से प्रतिबिंबित फिल्टर के माध्यम से पता लगाया जाना चाहिए । AF488 प्रतिदीप्ति एक 465-495 एनएम उत्तेजना फिल्टर के माध्यम से उत्साहित किया जा सकता है, और उत्सर्जित प्रकाश एक 515-555 एनएम बैरियर एक ५०५ एनएम dichroic मिरर से प्रतिबिंबित फिल्टर के माध्यम से पता लगाया जा सकता है ।
    2. छवि प्रत्येक धुंधला विधि के लिए शर्त प्रति ५० कोशिकाओं की एक ंयूनतम ।

4. कैप्सूल के मैनुअल माप

  1. भारत स्याही या फ्लोरोसेंट दाग के साथ दाग कोशिकाओं के लिए, मैंयुअल रूप से कैप्सूल और सेल व्यास मापने के लिए एक सेल माप सॉफ्टवेयर का उपयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें) । ऐसा करने के लिए, "फ़ाइल" > "ओपन इमेज" > "उपाय" पर जाएं और कर्सर का उपयोग पूरे सेल (कुल व्यास) के व्यापक बिंदु के माध्यम से एक सीधी रेखा खींचने के लिए करें ।
  2. अगले, क्लिक करें "उपाय" फिर से और सेल शरीर (कोशिका शरीर व्यास) के माध्यम से एक सीधी रेखा आकर्षित ।
    नोट: माप कोशिकाओं पर ऑटो-सहेजा जाता है.
  3. सभी कक्षों के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं (ंयूनतम 50/समूह) ।
  4. छवियों को बचाने के लिए एक बार वे मापा जाता है, क्लिक करें "फ़ाइल" > "के रूप में सहेजें" और छवियों का नाम उचित ।
  5. एक स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर के लिए नए मापा फ़ाइलों और निर्यात डेटा का चयन करें ।
  6. समीकरण का उपयोग करके औसत कैप्सूल व्यास की गणना: ([कुल व्यास]-[कोशिका शरीर व्यास]).

5. कैप्सूल की स्वचालित माप

नोट: सफल स्वचालित माप के लिए, कंट्रास्ट के उच्च स्तर के साथ 16-बिट छवियों का उपयोग करें और जो उचित छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर के साथ ठीक से ध्यान केंद्रित कर रहे है ( सामग्री की तालिकादेखें) । जब इमेजिंग C. neoformans कैप्सूल माप के लिए, यह सेल वॉल और कैप्सूल के बीच सीमा पर डार्क रिंग पर ध्यान केंद्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है । इससे सॉफ्टवेयर को सही ढंग से सेल और कैप्सूल चित्रित है ।

  1. पलटना और एक उपयुक्त छवि संपादन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर अखिल भारतीय स्याही सना हुआ सेल छवियों की एक प्रतिलिपि बनाएँ ( सामग्री की तालिकादेखें). यह करने के लिए, क्लिक करें "फ़ाइल" > "खुला" भारत स्याही सना हुआ छवियों को खोलने के लिए और फिर "नियंत्रण" + "मैं" छवि पलटना करने के लिए । उल्टे छवि को बचाने के लिए "फ़ाइल" > "इस रूप में सहेजें" पर क्लिक करें ।
  2. दोनों के लिए सॉफ्टवेयर में मूल और औंधा छवियों को आयात क्लिक करें "फ़ाइल" > "आयात अनुक्रम" > "लोड छवि" > "अनुक्रम को परिभाषित (मैंयुअल रूप से)" > "आयाम (चैनल)" > "आयात" > "लागू करें" ।
    नोट: C. neoformans सेल निकायों और कैप्सूल की पहचान की जा सकती है और विशिष्ट एल्गोरिदम का उपयोग कर नकाबपोश-' के रूप में व्यंजनों ' कहा जाता है-सॉफ्टवेयर में शामिल थे ।
  3. का पता लगाने और सेल शरीर मुखौटा करने के लिए उल्टे छवि पर ' कॉलोनी विश्लेषक (प्रतिदीप्ति) ' नुस्खा का प्रयोग करें, तो "लागू" क्लिक. उल्टे छवि में, डार्क रिंग C. neoformans कक्ष की सीमा को परिभाषित करने आसपास के कैप्सूल से उज्जवल हो जाता है ।
  4. उल्टे छवि पर ' कॉलोनी विश्लेषक (प्रतिदीप्ति) ' नुस्खा का प्रयोग करें उनके कैप्सूल से सी. neoformans सेल निकायों खंड, तो क्लिक करें "लागू" । यह एक गणना मास्क बनाता है । "गणना मास्क" लेबल वाले टैब पर राइट-क्लिक करके इस गणना मास्क "सेल बॉडी" का नाम बदलें ।
    नोट: नुस्खा एकाधिक छवि प्रसंस्करण कदम के होते हैं: पृष्ठभूमि हटाने, वस्तु का पता लगाने, वस्तु जुदाई, और सबसेट फ़िल्टरिंग ।
  5. अगला, कैप्सूल का पता लगाने और मास्क करने के लिए मूल छवि पर ' सेल प्रसार ' नुस्खा का उपयोग करें, और क्लिक करें "लागू". यह एक गणना मास्क बनाता है । "गणना मास्क" लेबल टैब पर राइट-क्लिक करके इस गणना मास्क "कैप्सूल" का नाम बदलें ।
  6. नुस्खा का उपयोग करना, ' कैप्सूल विभाजन ', एक दूसरे से विभाजन आसंन कैप्सूल के लिए मूल छवि पर एक नया मुखौटा बनाने । ऐसा करने के लिए, नुस्खा ड्रॉपडाउन मेनू से "कैप्सूल विभाजन" पर क्लिक करें. कैप्सूल विभाजन बॉक्स में, कैप्सूल क्षेत्र के लिए अब नाम बदला गया गणना मास्क "कैप्सूल" (५.५) चुनें. क्रिप्टो कोशिकाओं (५.४) के लिए अब नाम बदल गणना मास्क "सेल शरीर" चुनें । इनपुट चैनल के लिए "मूल" चुनें, और "विभाजित कैप्सूल के लिए मास्क बनाएँ. "लागू करें
    ध्यान दें: नुस्खा कोशिका और कैप्सूल व्यास, सबसे लंबे और कम से सेल और कैप्सूल के केंद्र पार कुल्हाड़ियों के औसत के रूप में परिभाषित उत्पंन करता है, और पता लगाने मास्क से क्षेत्र माप । इस सॉफ़्टवेयर में स्प्रेडशीट टैब के अंतर्गत स्थित है जो आउटपुट ढूँढें । सभी छवियों के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ (न्यूनतम ५० कक्ष/ नुस्खा के मापदंडों को व्यक्तिगत छवियों का पता लगाने का अनुकूलन या एकाधिक छवियों के बैच का पता लगाने के लिए अनुकूलित करने के लिए देखते हो सकता है । अतिरिक्त माप सेल और कैप्सूल की आकृति विज्ञान के व्यापक लक्षण वर्णन के लिए नुस्खा द्वारा गणना की जा सकती है ।
  7. आगे के विश्लेषण के लिए पसंद के एक स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर के लिए डेटा निर्यात करें ।

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Representative Results

कैप्सूल प्रेरण, सेल धुंधला, इमेजिंग, और मापने तकनीकों का वर्णन करने के लिए, हम सी. neoformans के तीन उपभेदों का इस्तेमाल किया: आम, अच्छी तरह से विशेषता प्रयोगशाला तनाव, H99S30, और दो चिकित्सकीय पहले से अलग उपभेदों अज्ञात कैप्सूल व्यास, B18 और B5231.

भारत इंक का उपयोग करके कैप्सूल प्रेरण, धुंधला, और छवि अधिग्रहण का कार्यप्रवाह चित्र 1aमें दिखाया गया है । सभी तीन उपभेदों से लिया छवियों चित्रा 1b दोनों पूर्व और बाद प्रेरण में दिखाया जाता है । शोधकर्ता अगर कैप्सूल प्रेरण कोशिकाओं है कि एक ही संस्कृति है कि नहीं है से उन लोगों के लिए कैप्सूल प्रेरण आया है तुलना द्वारा एक सफलता थी पता चल जाएगा । एक स्पष्ट आकार में वृद्धि आमतौर पर सबसे उपभेदों के बाद प्रेरण में स्पष्ट है, हालांकि कुछ उपभेदों भी प्रेरण के बाद स्वाभाविक रूप से छोटे कैप्सूल प्रदर्शन करेंगे ( चित्र 1bमें B18 के चित्र देखें) । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कैप्सूल प्रेरण असफल हो जाएगा अगर अवशिष्ट अमीर मीडिया प्रेरण से पहले हटा नहीं है या अगर सह2 मौजूद नहीं है । इन मामलों में, केवल मामूली (यदि कोई है) कैप्सूल आकार में वृद्धि मनाया जाएगा । सभी तीन उपभेदों से व्यास मैंयुअल रूप से मापा गया और परिणाम चित्रा 1Cमें दिखाए जाते हैं । तीन में से दो प्रयोगों में H99S और B18 के बीच आकार में कोई अंतर नहीं था । हालांकि, आकार में एक महत्वपूर्ण अंतर लगातार सबसे बड़ा तनाव, B52, और H99S और B18 (p < 0.001 और p < 0.001, क्रमशः, मानक ंयूनतम वर्ग सरल विरोधाभासों के साथ परीक्षण, नमूना आकार = ५० कक्षों/ ).

चित्र 2a कैप्सूल प्रेरण, धुंधला, और छवि अधिग्रहण के कार्यप्रवाह दो फ्लोरोसेंट रंजक का उपयोग कर, कैप्सूल के लिए एक (18B7-AF488) और सेल दीवार (Calcofluor सफेद) के लिए एक को दर्शाया गया है । छवियां जेड के रूप में सभी तीन उपभेदों के लिए ढेर के रूप में कब्जा कर लिया गया है, यह सुनिश्चित करना है कि अधिकतम कैप्सूल और सेल शरीर व्यास प्रत्येक कोशिका के लिए कब्जा कर लिया गया था मापा (चित्रा बी) । प्रत्येक z-स्टैक अधिकतम तीव्रता अनुमानों का उत्पादन करने के लिए संसाधित किया गया था, विश्लेषण करने से पहले एक 2d छवि में 3-आयामी स्टैक को संपीड़ित (चित्र 2c) । ये तो मैंयुअल रूप से मापा गया (चित्र 2d) । भारत स्याही सना हुआ कोशिकाओं के लिए माप के विपरीत, फ्लोरोसेंट धुंधला हमें प्रयोग के सभी तीन दोहराने में उनके कैप्सूल व्यास के आधार पर सभी तीन उपभेदों के बीच भेदभाव करने के लिए सक्षम होना चाहिए । यहां, हमने पाया है कि B18 सबसे छोटी कैप्सूल व्यास था और B52 सबसे बड़ा (p < 0.001 सभी तुलना के लिए, सरल प्रभाव के साथ मानक ंयूनतम चौकोर परीक्षण, नमूना आकार = ५० कक्ष/

C. neoformans कैप्सूल धुंधला के दो तरीकों का आकलन करने के लिए, सभी तीन उपभेदों से माप की तुलना में किया गया । इस कैप्सूल के आकार के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था (चित्र 3) धुंधला के दो तरीकों का उपयोग कर निर्धारित (सरल प्रभाव के साथ बहुभिंनरूपी ANOVA, नमूना आकार = ५० कोशिकाओं/ यह निष्कर्ष एक अलग प्रयोग के निष्कर्षों के अनुरूप था जहां लैब तनाव, H99S, भारत स्याही और फ्लोरोसेंट रंजक (चित्र बी-सी) के साथ सह-दाग था । हालांकि, भारत स्याही का उपयोग प्रयोगों के बीच अधिक से अधिक परिवर्तनशीलता था, के रूप में तथ्य यह है कि केवल एक तीन प्रयोगों से बाहर H99S और B18 के बीच कैप्सूल आकार में एक महत्वपूर्ण अंतर दिखाई दिया द्वारा सबूत, महत्वपूर्ण अंतर की तुलना में मनाया सभी तीन फ्लोरोसेंट प्रयोगों में इन उपभेदों के बीच (चित्रा3 डी-ई) (सरल प्रभाव के साथ बहुभिंनरूपी ANOVA, नमूना आकार = ५० कोशिकाओं/

भारत स्याही सना हुआ छवियां जो प्रोटोकॉल (खंड 5) में सूचीबद्ध मानदंडों को पूरा एक स्वचालित प्रणाली का उपयोग कर मापा जा सकता है । कार्यप्रवाह चित्रा 4a में दिखाया गया है कि सी. neoformans कैप्सूल को मापने के लिए डिज़ाइन किए गए व्यंजनों का उपयोग करने के लिए आवश्यक कदम के माध्यम से उपयोगकर्ता गाइड । कार्यप्रवाह विकसित करने के बाद, यह मैनुअल और स्वचालित दोनों तरीकों का उपयोग कर तीन शोधकर्ताओं द्वारा C. neoformans कोशिकाओं की मौजूदा छवियों का एक कैश को मापने के द्वारा मान्य किया गया था । वहां शोधकर्ता माप के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर जब मैंयुअल रूप से किया गया है, और यह भी सच है जब माप स्वचालित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (चित्रा 4B) (ANOVA, नमूना आकार = ५० कोशिकाओं का उपयोग कर बनाया गया था/ हालांकि, दो विधियों (चित्र 4c) ANOVA, नमूना आकार = १५० कक्षों/समूह के बीच रिपोर्ट की गई कैप्सूल आकार में एक छोटा लेकिन महत्वपूर्ण अंतर था. कैप्सूल व्यास लगातार थोड़ा छोटा था जब मैनुअल माप (०.३ µm, p < 0.001) से स्वचालन के माध्यम से मापा । इसके अतिरिक्त, जब एक ही छवि सेट से अलग शोधकर्ताओं द्वारा किए गए कैप्सूल आकार माप के बीच तुलना, मानक त्रुटि जब छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर ठहराव के लिए मैनुअल तरीके, जो अधिक के सुझाव के बजाय इस्तेमाल किया गया था छोटे था सटीक, reproducible माप स्वचालित विधि का उपयोग कर । सफल स्वचालित मापने के लिए, कोशिकाओं को ध्यान में होना चाहिए, बड़े कैप्सूल के लिए एक माध्यम है, और नहीं पीढ़ी संकुल (चित्रा 4d) । हमने पाया है कि खराब छोटे कैप्सूल के साथ संकुल कोशिकाओं का ध्यान केंद्रित छवियों को स्वचालित रूप से सॉफ्टवेयर में मापा नहीं जा सकता. हालांकि, हम यह भी सही मैनुअल तरीकों का उपयोग कर मापने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है कि जोर ।

Figure 1
चित्र 1 : भारत केे दाग लगाने के उपाय ग. neoformans कैप्सूल । (क) C. neoformans कैप्सूल माप के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व भारत स्याही धुंधला । संक्षेप में, कैप्सूल अभिव्यक्ति पोषक तत्वों से वंचित है और2के लिए जोखिम का उपयोग कर प्रेरित है, कोशिकाओं भारत स्याही में reसस्पैंड और ग्लास स्लाइड पर घुड़सवार हैं । दाग कोशिकाओं की छवियों को या तो उपयोगकर्ता द्वारा या टाइल स्कैनिंग एक कंप्यूटर नियंत्रित मंच का उपयोग करके चयनित क्षेत्रों के साथ प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा अधिग्रहीत कर रहे हैं । छवियां या तो मैंयुअल रूप से विश्लेषण किया जा सकता है या स्वचालित छवि विभाजन और विश्लेषण के लिए संसाधित । (ख) आम लैब तनाव, H99S और दो नैदानिक उपभेदों, B18 और B52, दोनों पूर्व और बाद कैप्सूल प्रेरण की छवियां । स्केल सलाखों के 10 µm (सी) एक प्रतिनिधि प्रयोग के ग्राफ सभी तीन भारत स्याही के साथ सना हुआ उपभेदों और मैंयुअल रूप से मापा के कैप्सूल व्यास का प्रतिनिधित्व (त्रुटि मानक त्रुटि (एसई) के रूप में प्रतिनिधित्व किया है) । सांख्यिकीय महत्व निम्नानुसार दर्शाया गया है: *, p < 0.05; * *, p < 0.01; और * * *, p < 0.001 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : फ्लोरोसेंट धुंधला करने के लिए उपाय ग. neoformans कैप्सूल । (क) Calcofluor व्हाइट (CFW) और 18B7-AF488 सह धुंधला द्वारा सी. neoformans कैप्सूल माप का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. कैप्सूल प्रेरण और धुंधला के बाद, कोशिकाओं घुड़सवार और लेजर द्वारा फोकल माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग की छवि है । के रूप में कोशिकाओं को अलग फोकल विमानों में हो सकता है, जेड-ढेर प्रत्येक स्थिति में अधिग्रहीत कर रहे हैं । इन अधिकतम तीव्रता अनुमानों है कि सही प्रत्येक कोशिका के लिए अधिकतम कैप्सूल व्यास को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता उत्पादन करने के लिए संसाधित कर रहे हैं । (B) आम लैब तनाव, H99S और दो नैदानिक उपभेदों, B18 और B52, पोस्ट-कैप्सूल प्रेरण की छवियां । नोट: स्केल बार्स सभी छवियों के लिए 10 µm का प्रतिनिधित्व करती हैं । (ग) फ्लोरोसेंट लेबल सी. neoformans कोशिकाओं की अधिकतम तीव्रता अनुमानों. (D) एक प्रतिनिधि प्रयोग का ग्राफ मैंयुअल रूप से दिखा सभी तीन CFW और 18B7-AF488 (त्रुटि मानक त्रुटि (एसई) के रूप में प्रतिनिधित्व किया है उपभेदों के कैप्सूल व्यास मापा) । सांख्यिकीय महत्व निम्नानुसार दर्शाया गया है: *, p < 0.05; * *, p < 0.01; और * * *, p < 0.001 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : भारत इंक और फ्लोरोसेंट धुंधला के बीच परिणामों की तुलना । (क) तीन सी. neoformans उपभेदों भारत स्याही या फ्लोरोसेंट रंजक के साथ दाग का विश्लेषण, n = 3 (त्रुटि मानक त्रुटि (एसई) के रूप में प्रतिनिधित्व किया है) । (ख) एक एकल सी. neoformans सेल भारत स्याही और दोनों फ्लोरोसेंट रंजक (स्केल बार 13 µm का प्रतिनिधित्व करता है) के साथ दाग की छवियां । क्षैतिज रेखाएं demarcate कैप्सूल के किनारों और अनुलंब रेखाओं को demarcate कक्ष के किनारों को खींचती हैं । (C) दोनों भारत इंक और फ्लोरोसेंट रंगों के साथ सना हुआ H99S के एक प्रतिनिधि प्रयोग के ठहराव (त्रुटि मानक त्रुटि (SE) के रूप में प्रस्तुत किया जाता है) । (D, E) भारत इंक प्रयोगों (D) और फ्लोरोसेंट प्रयोगों (ई) के बीच कैप्सूल व्यास परिवर्तनशीलता का चित्रण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : गणना का विश्लेषण भारत इंक सना हुआ कोशिकाओं की छवियों से neoformans कैप्सूल व्यास । (क) छवि विभाजन और सी. neoformans कैप्सूल माप के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व एक स्वचालित माप तकनीक का उपयोग ( सामग्री की तालिकादेखें). (ख) कैप्सूल माप की तुलना मैनुअल (मैनुअल 1-3) और स्वचालित तरीकों (स्वचालित 1-3) का उपयोग करके 3 अलग जांचकर्ताओं द्वारा निष्पादित । प्रत्येक जांचकर्ता दोनों विधियों (त्रुटि StDev के रूप में प्रस्तुत किया जाता है) द्वारा एक समान कैश C. neoformans छवियों का उपयोग । (C) मैंयुअल माप और स्वचालित माप का संयुक्त औसत (त्रुटि मानक त्रुटि (SE) के रूप में प्रस्तुत किया जाता है) । दोनों (D) आदर्श और ( E) गैर-आदर्श छवियां C. neoformans के उदाहरण । गैर-आदर्श छवियों को सॉफ़्टवेयर में सफलतापूर्वक मापा नहीं जा सकता । सांख्यिकीय महत्व निम्नानुसार दर्शाया गया है: *, p < 0.05; * *, p < 0.01; और * * *, p < 0.001 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

दशकों के लिए, कैप्सूल दोनों mycologists और चिकित्सकों में रुचि के लिए अनुसंधान का एक बड़ा ध्यान केंद्रित किया गया है C. neoformans और रोगज़नक़ के लिए एक प्रमुख डाह कारक के रूप में अपनी भूमिका के कारण cryptococcosis । उपभेदों के बीच कैप्सूल के आकार में अंतर को मापने के लिए माइक्रोस्कोपी का प्रयोग और विभिन्न विकास की स्थिति के तहत रोगज़नक़ और विभिंन उत्तेजनाओं के लिए अपनी प्रतिक्रियाओं के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकते हैं (यानी, विभिन्न पर्यावरणीय स्थितियों, संभावित दवा उपचार, आदि) यहाँ, हम सी. neoformansमें कैप्सूल के विकास के लिए प्रेरित करने के लिए एक विधि रेखांकित किया है, और दो अलग कैप्सूल दाग प्रोटोकॉल की तुलना में. अंत में, हमने दिखाया कि कैसे छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के लिए भारत स्याही सना हुआ कोशिकाओं की छवियों से कैप्सूल व्यास के माप को स्वचालित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, परिणाम है कि मैनुअल माप तरीकों के लिए तुलनीय थे उत्पादन.

हमारे प्रयोगों में, हम दो नैदानिक उपभेदों की तुलना में, B18 और B52, H99S के साथ, ज्ञात कैप्सूल आकार का एक मानक प्रयोगशाला तनाव18. दोनों धुंधला तरीके से पता चला कि नैदानिक तनाव, B52, परीक्षण तीन उपभेदों के सबसे बड़े कैप्सूल व्यास था । हालांकि, फ्लोरोसेंट माप से परिणाम छोटे कैप्सूल आकार जहां भारत स्याही माप नहीं थे के साथ दो उपभेदों के बीच एक अंतर विचार करने में सक्षम थे । धुंधला के दोनों तरीकों से परिणाम अनुरूप थे, सुझाव है कि दोनों मांय हैं, लेकिन है कि फ्लोरोसेंट दाग सी. neoformans की छवियों का उपयोग छोटे कैप्सूल के साथ उपभेदों को मापने में वृद्धि की संवेदनशीलता के लिए अनुमति दे सकता है । फ्लोरोसेंट दाग कोशिकाओं की जेड-ढेर छवियों से उत्पंन अधिकतम अनुमानों का उपयोग कर शोधकर्ताओं ने सुनिश्चित करने के लिए कि सटीक कैप्सूल व्यास माप बनाया जा सकता है जब भी छवि बनाई कोशिकाओं अलग फोकल विमानों में हैं । इन माप के लिए और अधिक कठिन है C. neoformans भारत स्याही और मानक प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर छवि । किसी भी छवि में, आसन्न कोशिकाओं को थोड़ा अलग फोकल विमानों में बैठ सकते हैं, यह मुश्किल सभी कोशिकाओं के लिए सेल बॉडी-कैप्सूल सीमा को सही ढंग से हल करने के लिए बना रही है । यह संभवतः कैप्सूल आकार या उपभेदों के बीच छोटे मतभेदों में छोटे परिवर्तन का पता लगाने के लिए जांचकर्ताओं की क्षमता को मिल सकता है ।

प्रत्येक विधि अपने निहित लाभ है । भारत स्याही सबसे अधिक है क्योंकि इसकी सामर्थ्य के शोधकर्ताओं द्वारा प्रयोग किया जाता है, उपयोग में आसानी, और स्थिरता (यह कुछ फ्लोरोसेंट दाग की तरह समय पर नीचा नहीं है सकते हैं) । क्योंकि भारत स्याही एक सरल, नकारात्मक दाग यह मानक प्रकाश सूक्ष्मदर्शी, जो फ्लोरोसेंट सूक्ष्मदर्शी से अधिक आसानी से उपलब्ध है के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, अगर सही अनुपात (भारत इंक: बफर) में इस्तेमाल नहीं किया, दाग एक "पंख" पृष्ठभूमि बना सकते है जब imaged, जो स्वचालित छवि विश्लेषण जटिल कर सकते हैं । जबकि महंगी और अधिक समय लेने वाली उपयोग करने के लिए, फ्लोरोसेंट रंजक उनके लचीलेपन के लिए लाभप्रद हो सकता है, और जैसा कि हम दिखाते हैं, उनकी संवेदनशीलता । वे सी. neoformans है कि प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा phagocytosed किया गया है और में सी. neoformans कैप्सूल की ऊतकवैज्ञानिक परीक्षा के लिए आवश्यक हैं शामिल प्रयोगों में कैप्सूल आकार और कोशिका बोझ के माप के लिए विशेष रूप से उपयोगी होते हैं ऊतक नमूने (एक तकनीक इस लेख में उल्लिखित नहीं)३२। इस तरह के calcofluor सफेद या फ्लोरोसेंट टैग विरोधी GXM एंटीबॉडी के रूप में फ्लोरोसेंट रंजक के साथ धुंधला, यदि समस्याग्रस्त है (उदा., अपर्याप्त धुंधला), यह आम तौर पर दाग प्रोटोकॉल के अनुकूलन से दूर किया जा सकता है (बढ़ती/ एकाग्रता और/या डाई के साथ समय गर्मी) ।

धुंधला की परवाह किए बिना पद्धति, हम पाते है कि दोनों कैप्सूल प्रेरण और उचित छवि पर कब्जा प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं । इस पत्र में उल्लिखित प्रोटोकॉल सी. neoformans में कैप्सूल प्रेरण के लिए कई मानक तरीकों में से एक है और कई वर्षों के लिए खमीर प्रयोगशालाओं में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है23. ग. neoformans कैप्सूल प्रेरण सह2-निर्भर है और केवल तनावपूर्ण परिस्थितियोंमें23,३३के तहत होता है । इसलिए, यह महत्वपूर्ण है कि यह एक 5% CO2 मशीन में एक उपयुक्त पोषक तत्व की कमी के विकास के माध्यम का उपयोग होता है । यदि यह शक है कि कैप्सूल मशीन की एक मानक अवधि के बाद प्रेरित नहीं किया गया है (आम तौर पर 18-24 ज), कोशिकाओं एक प्रेरित नियंत्रण संस्कृति है कि तनावपूर्ण परिस्थितियों को उजागर नहीं किया गया था की तुलना में किया जाना चाहिए । दोनों की तुलना यह निर्धारित करेगी कि प्रेरण प्रभावी थी या नहीं । एक सफल प्रेरण एक है जिसमें कोशिकाओं के बहुमत एक बड़ा कैप्सूल बनाने, प्रेरित नियंत्रण की तुलना में है । क्योंकि नहीं सभी कोशिकाओं को प्रेरित करेगा, कोशिकाओं को मापा जा उपलब्ध कोशिकाओं का एक विषम प्रतिनिधित्व होना चाहिए ।

लगातार छवि अधिग्रहण के महत्व को नहीं किया जा सकता है, खासकर यदि स्वचालित माप लक्ष्य है । ध्यान दें, इसके विपरीत, पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति, साथ ही साथ बिट गहराई और फ़ाइलों की छवि संपीड़न सभी महत्वपूर्ण विचार कर रहे हैं । जब संभव हो, कोशिकाओं है कि एक भी फोकल विमान में नहीं बैठते है के बड़े समूहों से बचा जाना चाहिए, हालांकि कुछ नवोदित और छू कोशिकाओं स्वीकार्य है और अपरिहार्य हो सकता है (यह नियम दोनों मैनुअल और स्वचालित मापने के लिए पीछा किया जाना चाहिए) । यह समस्या एक निश्चित डिग्री करने के लिए दरकिनार किया जा सकता है जब फ्लोरोसेंट दाग कोशिकाओं के फोकल इमेजिंग का उपयोग कर । अधिकतम तीव्रता अनुमानों का उत्पादन करने के लिए जेड-स्टैक का उपयोग एक ही छवि29से अलग फोकल विमानों में कोशिकाओं की सही माप सक्षम कर सकते हैं । इसके अतिरिक्त, चित्र नमूना तैयार करने के बाद जल्दी से प्राप्त किया जाना चाहिए । यह भारत स्याही दाग के नमूने के रूप में जब वे शुष्क करने के लिए शुरू करने के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो सकता है, पृष्ठभूमि और अग्रभूमि तत्वों (कोशिकाओं) के बीच विपरीत कम कर सकते है और अवांछनीय पृष्ठभूमि सुविधाओं बढ़ाया जा सकता है, जो कम स्वचालित करने के लिए सुराग फॉल्ट सटीकता ।

हालांकि कैप्सूल व्यास माप सी. neoformans समुदाय में आम हैं, ऊपर इस बात वे आम तौर पर मैंयुअल रूप से किया गया है, जो पर्याप्त समय और जनशक्ति की आवश्यकता है जब तक । हालांकि, मैनुअल माप क्षेत्र में स्वीकार किए जाते है और परिणाम कम कीमत पर प्राप्त किया जा सकता है । छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में प्रगति यह इन माप स्वचालित की ओर पहला कदम उठाने के लिए संभव बना दिया है । C. neoformans कोशिका शरीर और कैप्सूल के सरल स्वभाव-2d छवियों में एक सर्कल के भीतर एक सर्कल के रूप में प्रदर्शित होने के अपने आकार का माप स्वचालित छवि विभाजन सॉफ्टवेयर संकुल के लिए अपेक्षाकृत सरल बनाता है, के लिए उपंयास विकसित करने की आवश्यकता के बिना एल्गोरिदम. इसके बजाय, मौजूदा एल्गोरिदम को जोड़ने के द्वारा, C. neoformans कोशिकाओं और कैप्सूल का पता लगाया जा सकता है, खंड, और मापा । इस दृष्टिकोण का उपयोग करना, हम सबसे अधिक इस्तेमाल किया कैप्सूल डाई, भारत स्याही के साथ सना हुआ कोशिकाओं के लिए C. neoformans कैप्सूल व्यास की माप स्वचालित है, और एक ही डेटा सेट के लिए मैनुअल माप करने के लिए इन की तुलना में है । इस विधि reproducibility का लाभ प्रदान करता है और मानव मैनुअल माप के साथ जुड़े त्रुटि के बहुत दूर है जबकि शोधकर्ता समय की बचत । इसके अलावा, अतिरिक्त माप स्वचालित विश्लेषण कार्यप्रवाह में ंयूनतम प्रयास के साथ शामिल किया जा सकता है । हमें लगता है कि स्वचालित छवि विश्लेषण एक आशाजनक दृष्टिकोण है कि शोधकर्ताओं सटीकता और दक्षता के एक उच्च डिग्री के साथ C. neoformans कैप्सूल की बड़ी संख्या को मापने के लिए अनुमति देता है ।

कुल मिलाकर, हम का प्रदर्शन किया है कैसे सफलतापूर्वक C. neoformansमें कैप्सूल विकास को प्रेरित करने के लिए, या तो भारत स्याही या फ्लोरोसेंट रंगों के साथ नमूने दाग, और माप कैप्सूल व्यास दोनों मैनुअल और एक छवि विश्लेषण में स्वचालित माप का उपयोग सॉफ्टवेयर. हमारे परिणामों का सुझाव है कि धुंधला के दोनों तरीकों व्यवहार्य है और आम तौर पर लगातार परिणाम उत्पादन (हालांकि भारत स्याही माप के साथ और अधिक परिवर्तनशीलता है) । इसके अलावा, दोनों मैनुअल और माप के स्वचालित तरीकों के लिए अलग कैप्सूल आकार विचार करने की क्षमता है ।

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Disclosures

लेखक, Hoyin लाइ, DRVision पर उत्पाद प्रबंधक है कि स्वचालित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर, Aivia प्रकाशित करता है ।

Acknowledgments

हम आणविक जैव विज्ञान (MOBI) डॉक्टरेट कार्यक्रम और मध्य टेनेसी राज्य विश्वविद्यालय (MTSU) में जीवविज्ञान विभाग इस अध्ययन के लिए धन प्रदान करने के लिए धंयवाद । परियोजना भी एक विशेष परियोजनाओं MTSU फाउंडेशन द्वारा D.E.N. को संमानित अनुदान द्वारा भाग में वित्त पोषित किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Capsule Induction
C. neoformans cells The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University).  The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania). 
Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD) Fisher Scientific DF0428-17-5
Phosphate Buffered Saline (PBS) This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O)
DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate GE Life Sciences SH30022.01
6-well plates Falcon CL5335-5EA
Shaking incubator Thermo Scientific  MaxQ6000
CO2 incubator Fisher Scientific Isotemp
Centrifuge Thermo Scientific Legend XTR
Staining
Microcentrifuge Thermo Scientific Legend Micro 21R
India ink Fisher Scientific 14-910-56
Calcofluor white Sigma-Aldrich 18909-100ML-F
18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488 A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University) 
PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA) PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized.
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9418
Superfrost microscope slides Fisher Scientific 12-550-143
Glass coverslips Corning 2855-18 #1.5 thickness
Clear nail polish or other non-toxic sealant
Image Acquisition 
Immersion oil Cargille  16484
Light microscope with immersion oil objective Zeiss Zeiss Axio A1 with a Plan - NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective
Light microscope camera Zeiss Zeiss Axiocam ErCD camera
Confocal microscope with oil immersion objective Zeiss LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective. 
Confocal microscope software Zen 2009
Confocal microscope camera Nikon Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer. 
Widefield imaging software Nikon Elements (Nikon)
Capsule Measurement
Image editing software Photoshop (Adobe)
Microscope software for manual measurement Axiovision (Carl Zeiss)
Image analysis software for automated meesurement Aivia (DRVision Technologies)
Spreadsheet software Excel (Microsoft)

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक १३२ Cryptococcus Neoformans कैप्सूल डाह पैटर्न मांयता छवि विश्लेषण स्वचालित विश्लेषण खमीर
आकार मामलों: कैप्सूल व्यास का माप <em>Cryptococcus neoformans</em> में
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Guess, T., Lai, H., Smith, S. E., Sircy, L., Cunningham, K., Nelson, D. E., McClelland, E. E. Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans. J. Vis. Exp. (132), e57171, doi:10.3791/57171 (2018).

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