Summary
多糖類のカプセルはクリプトコッカス ・ ネオフォルマンスの主な病原性因子とそのサイズが株の病原性と相関します。カプセル径測定は、表現型のテストと治療効果を測定するために使用されます。カプセル誘導の標準的な方法の紹介、染色し、直径を測定の 2 つの方法が比較されます。
Abstract
クリプトコッカス ・ ネオフォルマンスの多糖類のカプセルが主な病原性因子と最もよくこの病原性酵母の側面を検討しました。カプセル サイズ系統によって大きく異なります、ストレスや低栄養状態に導入されたとき、急速に成長する能力を持って、積極的に株の病原性と相関しています。これらの理由から、カプセルのサイズは、クリプトコッカスの研究者の関心です。クリプトコッカスカプセルの成長が表現型のテスト中に系統の酵母やサイズ違いのさまざまな治療法の効果を理解するために誘導されます。ここで述べるカプセル誘導と比較 2 つの受け入れられた方法の染色とカプセルの直径を測定の標準的な方法の 1 つ: (i) インドのインクと、従来の光学顕微鏡と組み合わせて・ (ii) 共同で染色、ネガティブ染色細胞壁と共焦点顕微鏡によるカプセルの両方の蛍光染料。最後に、どのようにインドのインク染色サンプルからカプセルの直径の測定をすることができますを示す計算イメージ分析を使用して自動化します。
Introduction
毎年 25万人に影響を与えると年間 180,000 以上の死の結果、クリプトコッカスは、細胞内病原性酵母やクリプトコッカス症1,2,の病原3。 直撃鋭く病気4,5,6に受けやすく抗レトロ ウイルス療法に準備ができてアクセスを持っていない貧しい国の HIV 陽性患者であります。CDC からのデータは、サハラ以南のアフリカで、クリプトコッカスを殺すこと結核より多くの人々 毎年、レコード1に任意のエボラ出血熱流行より以上の毎月を示します。露出の最も一般的なルートは、7環境で一般的とされている乾燥の胞子を吸い込むから発生します。肺に入ると、クリプトコッカスの感染した個人内の成功に寄与するいくつかの病原因子があります。多糖類のカプセルは、acapsular 系統ではない病原性8と微生物の主な病原性因子と見なされます。
クリプトコッカスのカプセルは、3 つの主要なコンポーネントの成っている: glucuronoxylomannan (GXM)、galactoxylomannan (GalXM) とマンノタンパク質の利用 (MPs)9。MPs はカプセルの比較的マイナーな細胞壁関連コンポーネント、それらは免疫原性、ほとんどプロ炎症性応答9,10を促進することができます。対照的に、GXM と GalXM カプセルの大部分を構成する (> 重量 90%)11免疫抑制作用を持っていると。その免疫調節効果に加えて体内のカプセルの急速な拡大はホスト貪食細胞 (すなわち、好中球、マクロファージ)12で摂取する機械的な障壁を作成します。クリプトコッカスカプセルとその合成は、複雑ですが、全体的に、高められたカプセル直径増加病原性6,13,14と相関しています。これを考えると、迅速かつ正確に定量化カプセル測定できなければクリプトコッカス研究者にとって重要です。
クリプトコッカスセルとその多糖類カプセル動的構造し、時間15間の変更を表示します。カプセルは、密度、サイズ、およびホスト環境16,17,18の変化に対応したアセンブリに変更できます。低鉄または栄養レベル、血清、人間の生理学的 pH および増加の CO2の露出は、カプセルの成長16,18,19,20を開始する知られています。さらに、研究者は、21,22クリプトコッカスにそのホスト上の優位性を融資感染中陽性で有意差で生じる構造変化を示しています。これは、クリプトコッカスカプセルのアーキテクチャは、さまざまな方法で分析されているために知られています。電子顕微鏡は、たとえば、外部より透過性層23下内側の電子密度の高い層を持つ異種行列をカプセルには明らかにしました。光散乱と光ピンセットの使用は、その高分子プロパティ24をさらに解明する研究者を許可しています。我々 は、多糖類のカプセルは、複雑な分岐構造23知っている両方の静的および動的光散乱測定から結果を分析した。光ピンセットは、構造体の剛性をテストだけでなく、その抗体の反応性の24の評価に使用されています。ただし、クリプトコッカスカプセルのこれまでで最もよく使われる分析のサイズの測定であります。
カプセル サイズを定量化する研究者は、単純な測定をする必要がありますどのようなを使用: カプセルの線径。デジタル マイクロ スコープは、インドのインクまたは蛍光染料で染色複数のクリプトコッカスセル (通常数百) の画像をキャプチャする使用されます。それぞれの細胞体と周囲のカプセルのサイズが測定されます。データがコンパイルされ、カプセルの平均粒径は、セル全体の直径 (セル本体 + カプセル) から細胞体直径を差し引いて計算されます。この時点まで、これらの測定は手動で行われています。一般的に正確にしながら、研究者の欠点があるこの方法。数日かかるまたは手で分析する数週間を大きなデータ セット。主観とヒューマン エラーが結果に影響を与えるこれらの測定は手動で行われるため。
自動計算画像解析生体画像25,26,27のより速くより信頼性の高い分析を有効にする分子細胞生物学の多くの分野の研究者の必要不可欠なツールとなっています。精密な画像解析手法は、私のものは、複雑で膨大なデータ セットから定量的情報に必要です。しかし、いくつかの測定、特にクリプトコッカスカプセルの測定は、自動化が困難されています。正確に細胞壁とカプセルは、一般的に暗いリングの時に位相差顕微鏡を用いたイメージングとして表示されます、インターフェイスを識別することができますシンプルなしきい値を使用して解決するは面倒。さらに、クリプトコッカス培養細胞は一緒に群生する傾向があるし、細胞の正確な分割が正確な測定に必要です。
このプロジェクトの目的は、(i) カプセル誘導クリプトコッカス、 (ii) 比較とコントラスト墨標準プロトコルの 1 つを説明するためにだったし、蛍光染色直径計測をカプセルに関連する (iii) シンプルでインドのインク、画像解析ソフトウェア、(iv) を使用してセルをステンド グラスのイメージを使用してカプセルの直径を測定するための計算方法は、利点と手動でカプセルの直径を計測の自動化ソフトウェアを使用して制限を評価します。2 つの染色法、蛍光細胞壁とカプセルの標識のそれを見つけるより時間がかかる中、実験間の最も一貫した結果を提供します。ただし、両方のメソッドは、正常に区別するために私たちを有効に研究室と臨床クリプトコッカスの系統別展示カプセル サイズ。さらに、インドのインク染色画像からカプセルの直径の測定を自動化し、これはカプセルの手動計測を実行可能な代替であることがわかったことができました。
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Protocol
注: は、クリプトコッカスがバイオ セーフティ レベル 2 (BSL-2) 病原体とそれを扱う研究者は適切な予防措置を取る必要があります。手続きの詳細な方法に安全に BSL 2 病原体で仕事見つけることができますセンター疾病管理 (CDC) のウェブサイトでは、それは処理のクリプトコッカスと接触しているすべての人はきちんと訓練されることに注意してくださいすることが重要病原体、適切な個人用保護具 (PPE) は、一般的にラテックスやニトリル手袋を常に着用する必要があります。さらに、遠心分離機のロータは、サンプルとすぐに 10% の漂白剤の解決策28を使用してクリーンアップこぼれのエアロゾル化を防ぐために密封する必要があります。
1. カプセル誘導
注: すべての手順は特に断らない限り、室温で実行必要があります。
- 酵母ペプトン ブドウ糖 (YPD) 液 (pH 6.5 ± 0.2) におけるクリプトコッカスを文化し、ログ段階 (約 18-36 時間) になるまでの揺れで 37 ° C で孵化させなさい。
- 870 x g 21 ° C で 5 分間で細胞を遠心し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) にて 3 回洗浄します。
- セルをカウントし、ダルベッコ最小限不可欠なメディア (DMEM) 2 x 105セル/2 mL で再懸濁します診断 (または自動化された細胞カウンター) を使用します。
- カプセルを誘導して、18 h の CO2を 37 ° C、5% で孵化させなさい。
注: メディアの栄養素の欠如と CO2の存在の組み合わせは、クリプトコッカスカプセルの成長を刺激します。 - 後の培養 (上記参照) 遠心、上清のすべてが 5-10 μ L を削除してセルを収穫します。同時に測定される各緊張に対応する非誘導細胞サンプルを収穫します。これらネガティブ コントロールとして使用します。
注: 細胞ペレットが非常に小さくなるし、見づらい場合があります。上清を吸引するときは注意してください。 - インドのインク (セクション 2.1) または蛍光染料 (セクション 2.2) を汚します。
2. 染色
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インドのインクのみ染色
- インドのインクと酵母を染色する残りの上清でペレットを再懸濁し、4μL を追加 (約半分) の細胞懸濁液およびインドのインクをガラス顕微鏡スライドの 4μL。ゆっくり混ぜるし、泡を避けるため。
- 13 mm ガラス基板 (#1.5 厚) を適用し、サンプルが乾くを防ぐために非毒性シーラント (明確なマニキュア) 端を密封します。
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蛍光染料のみで染色
- 蛍光色素と酵母を染色するには、1% ウシ血清アルブミン (BSA) で 50 μ L の PBS で細胞ペレットを再懸濁します。
- カルコフ ホワイト (CFW) の等量と文化を孵化させなさい (1 μ g/mL) カプセル モノクローナル抗体 18B7 は AlexaFluor488 に共役 (材料の表を参照)、(AF488) (10 μ G/ml) 37 ° C で 30 分間
- 870 x g後の培養を 21 ° C で 5 分間で細胞を遠心し、上清を吸引します。
- 1% ウシ血清アルブミン (BSA) を 10 μ L の PBS で細胞ペレットを再懸濁します。
- ガラス顕微鏡スライド上に細胞を懸濁液 8 μ L をピペットします。
- 13 mm ガラス基板 (#1.5 厚) を適用し、サンプルが乾くを防ぐために非毒性シーラント (明確なマニキュア) 端を密封します。
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インドのインクと蛍光染料染色
- 直接インドのインク蛍光染料の染色の有効性を比較するため汚れの両方の種類で同じセル人口を共同染色します。これを行うには、まず蛍光カプセルと 2.2.1 - 2.2.3 の手順に従って、細胞壁の汚れの両方で細胞を孵化させなさい。
- 次に、蛍光染色細胞懸濁液およびインドのインクをガラス スライドの平等なボリューム (4 μ L) のピペットします。優しく混ぜます。
- 13 mm ガラス基板 (#1.5 厚) を適用し、サンプルが乾くを防ぐために非毒性シーラント (明確なマニキュア) エッジをシールします。
3. 画像集録/顕微鏡
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インドのインクで染まってイメージ投射セル。
- 標準的な光学顕微鏡 (100 倍) を使用してイメージを取得します。
- 条件ごとの 50 のセルの最小値をイメージします。
注: フィールドあたりのセル数は異なります、これは許容されます。重要です、しかし、その重複細胞 (手動で、および自動化されたソフトウェア両方) を測定する困難なので最低限、保持します。これらの実験の画像は露出時間のセルの小さな動きによって引き起こされるぼかしを最小限に抑えながら画像のコントラストを最大にする最適化と 16 ビットの深さでに買収されました。
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蛍光色素で染色細胞イメージング
- 蛍光顕微鏡による細胞をイメージする顕微鏡イメージング ソフトウェアを開き、使用 fluorophores の適切な励起と発光波長を選択 (CFW と AF488 興奮しているそれぞれ、405 nm と 488 nm ライトを使用して)。蛍光顕微鏡を用いて画像を取得します。
- 条件ごとの 50 のセルの最小値をイメージします。
注: フィールドあたりのセル数は異なります、これは許容されます。重要です、しかし、その重複細胞 (手動で、および自動化されたソフトウェア両方) を測定する困難なので最小に保たれます。 - 特定のフィールド内の各セルの最大のカプセル径が得られることを確認するために細胞の z スタックのイメージのシリーズを取得します。
- 顕微鏡制御ソフトウエア"z"コントロール パネルを開き、パネルの左上隅で「姓」オプションを選択する"z"バーをクリックします。
- 単一酵母細胞とビューの現在のフィールド内のすべてのカプセルの最も広いポイントの下は、「最初に設定」をクリックしてレベルで集中する顕微鏡の罰金フォーカス コントロールを使用します。
- 現在の表示領域内のセルのすべてのカプセルの同じ細胞の細胞体の最も広いポイントの上の集中する微小焦点コントロールを使用し、「過去の設定」をクリックします。
- 「実験を開始」をクリック現在位置の z スタックを取得するを取得する」タブ。複数の位置でプロセスを繰り返して 50 セルの最小の z スタック画像が取得されています。
注: これらの実験では、1.0 に設定された共焦点ピンホール AU と 10-20 スライス各 0.7 μ M をカバーの重複する z シリーズは、選択された位置に買収されました。AU = 風通しの良いユニット。
- 次に、それぞれの z シリーズを最大強度投影法 (MIP) 適切なイメージ解析ソフトウェアを使用してに変換します。
注: MIPs プロジェクト積み上げ画像29のすべての面で最大の強度です。MIPs の作成セルの最大とキャプチャされた 3-D スタック内でカプセルの直径に対応するイメージの 2 D 表現を生成することができます。
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インドのインクと蛍光染色細胞イメージング
- 広視野 (40 倍) または共焦点の顕微鏡を使用して画像を取得 (63 倍または 100 倍)。インドのインクと蛍光染色細胞のコンピューター制御ステージと油浸対物レンズを搭載した広視野顕微鏡を使用してイメージをキャプチャします。
注記: 使用の顕微鏡は、イメージング ソフトウェアの CFW を使用して制御する必要があります。340-380 nm の励起フィルターを介して励起と光を放って蛍光 400 nm ダイクロイック ミラーから反映 435-485 nm バリア フィルターを介して検出されます。AF488 蛍光を 465 495 nm の励起フィルターを励起できることし、505 nm のダイクロイック ミラーで反射バリア フィルターの 515-555 nm から放出される光を検出できます。 - イメージごとの染色法の条件ごとの 50 のセルの最小値。
- 広視野 (40 倍) または共焦点の顕微鏡を使用して画像を取得 (63 倍または 100 倍)。インドのインクと蛍光染色細胞のコンピューター制御ステージと油浸対物レンズを搭載した広視野顕微鏡を使用してイメージをキャプチャします。
4 カプセルの手動測定
- インドのインクまたは蛍光汚れに染まったセル、カプセルとセル径を手動で測定するセル測定ソフトウェアを使用 (材料の表を参照してください)。これを行うには、"File"へ行く >「画像を開く」>「測定」とカーソルの使用全体のセル (径) の最も広いポイントを通る直線を描画します。
- 次に、「測定」をもう一度クリックし、細胞体 (細胞体径) を通る直線を描画します。
注: 測定、セルに自動的に保存されます。 - (最低 50/グループ) のすべてのセルについてこのプロセスを繰り返します。
- 彼らを測定したら、画像を保存するクリックして「ファイル」>「名前を付けて保存」、画像を適切な名前します。
- 新しく測定ファイルを選択し、表計算ソフトへデータをエクスポートします。
- 式を使用してカプセルの直径の平均を計算する: ([合計直径] - [細胞体直径])。
5 カプセルの自動測定
注: 自動測定に成功のコントラストの高い 16 ビット画像を使用し、するは正しく適切なイメージ解析ソフトウェアと一緒に焦点を当てた (材料の表を参照してください)。クリプトコッカスは、カプセル測定用イメージング、細胞壁とカプセルの間の境界で暗いリングに焦点を当てることが重要です。これによりセルとカプセルを正しく記述するソフトウェアです。
- 反転し、染色細胞像が適切なイメージ編集ソフトウェアを使用してすべてのインドのインクのコピーを作成 (材料の表を参照してください)。これを行うには、「ファイル」をクリックして > 墨染色画像を開き、「コントロール」では、「オープン」+"I"イメージを反転しますします。クリックして「ファイル」>「名前を付けて保存」反転イメージを保存します。
- オリジナルと逆の両方をインポートするソフトウェアに画像クリックして「ファイル」>「インポート シーケンス」>「読み込み画像」>「を定義するシーケンス (手動)」>「寸法 (チャネル)」>「インポート」>「適用」。
注:クリプトコッカス細胞体とカプセル識別でき、ソフトウェアに含まれている - 'レシピ' と呼ばれる - 特定のアルゴリズムを使用してマスクします。 - 倒立像に ' 植民地アナライザー (蛍光)' のレシピを使用して検出し、細胞体をマスクし、「適用」をクリックします。反転イメージクリプトコッカスセルの境界を定義する暗いリングは周囲のカプセルよりも明るくなります。
- 彼らのカプセルからクリプトコッカス細胞体のセグメントをクリックして「適用」を反転した画像を ' 植民地アナライザー (蛍光)' レシピを使用します。これは、カウントのマスクを作成します。このカウント マスク「体細胞」の名前を変更するには、"カウント マスク"というラベルの付いたタブを右クリックして。
メモ: レシピは、複数の画像処理手順ので構成されます: 背景除去、オブジェクトの検出、オブジェクトの分離とサブセット フィルタ リングします。 - 次に、元の画像の '細胞増殖' レシピを使用して検出し、カプセルをマスクし、「適用」をクリックします。これは、カウントのマスクを作成します。このカウント マスク「カプセル」の名前を変更するには、「カウント マスク」というラベルの付いたタブを右クリックします。
- 互いに隣接するカプセルを分割する元のイメージの上に新しいマスクを作成レシピ、' カプセル パーティション ' を使用しています。これを行うには、レシピのドロップ ダウン メニューから「パーティションのカプセル」をクリックします。カプセル パーティション ボックスでカプセル領域の今名前を変更したカウント マスク「カプセル」(5.5) を選択します。暗号のセル (5.4) 今名前を変更したカウント マスク「体細胞」を選択します。「オリジナル」を選択入力チャネル、および"パーティションに分割されたカプセルの作成マスク。"適用をクリックします。
注: セルと検出マスクからセル ・ カプセル、エリア測定の中心を通る最長と最短の軸の平均値として定義されているカプセルの直径にレシピが生成されます。このソフトウェアのスプレッドシート タブの下にある出力を見つけます。すべての画像 (最低 50 セル/グループ) には、このプロセスを繰り返します。レシピのパラメーターは、個々 の画像の検出を最適化するためにチューニングまたは複数画像のバッチ検出用に最適化できませんでした。セルとカプセルの形態の包括的な評価のためのレシピでは、追加の計測を計算できます。 - さらに分析に最適な表計算ソフトへデータをエクスポートします。
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Representative Results
3 系統を用いてカプセル誘導、細胞染色、イメージング、および計測技術を示すためには、クリプトコッカス:共通、よ特徴付けられた実験室株、H99S30、および 2 つの臨床分離株の以前不明なカプセルの直径、B18 と B5231。
カプセル誘導、染色、およびインドのインクを使用して画像集録のワークフローは、図 1 aに表示されます。前と後の誘導、図 1 bのすべての 3 つの系統から撮影した画像が表示されます。研究者は、カプセルの誘導はしていない同じ文化からのそれらにカプセルの誘導を受けている細胞を比較することによって成功をだったかどうか知っています。明確なサイズの増加いくつかの系統は誘導後も当然のことながら小さなカプセルを展示がほとんど系統後誘導、一般的に感じ取ることが (図 1 bの中 B18 の画像参照)。残留のリッチ メディアが誘導する前に削除されていない場合、または CO2が存在しない場合、カプセル誘導は失敗することに留意。これらのケースでカプセル サイズの (もしあれば) のみ適度な増加が観察されます。すべての 3 系統から直径手動で測定し、結果を図 1に示します。3 つの実験の 2 つの H99S と B18 のサイズの差はありませんでした。ただし、サイズの差は、最大ひずみ、B52 と H99S B18 と一貫して観察されました (p < 0.001 とp < 0.001、それぞれ、標準的な最小二乗テスト単純なコントラスト、サンプル サイズ = 50 セル/ひずみ).
図 2 aは、カプセルの誘導、染色、およびカプセル (18B7 AF488) と細胞壁 (カルコフ ホワイト) 用の 2 つの蛍光染料を使用して画像入力のワークフローを示しています。画像は、すべて 3 系統後誘導、カプセルと細胞体の径が測定するセルごとにキャプチャされたことを確認 (図 2 b) z スタックとして捕獲されました。各 z スタックは最大輝度投影相関、分析 (図 2) の前に 2 D 画像を 3 次元のスタックを圧縮を生成する処理でした。これらは、手動で採取し (図 2 D)。細胞を染色墨の測定とは異なり実験の私たちすべての 3 つのカプセルの直径に基づいてすべての 3 系統を区別するための有効な汚損蛍光の繰り返し。ここでは、我々 あったことが分った B18 最小カプセル径と B52 最大 (p < 0.001 のすべての比較は、単純な効果は、標準的な最小二乗テスト サンプル サイズ 50 セル/ひずみを =)。
クリプトコッカスカプセル染色の 2 つの方法を評価するさらに、すべての 3 つの系統からの測定値を比較しました。染色 (図 3 a) の 2 つの方法を用いてカプセルのサイズ間に有意差はありませんでした (単純な効果、多変量分散分析サンプル サイズ 50 セル/ひずみを =)。この結論は、別の実験の結果と一致してラボの歪み、H99S、だったインドのインクと蛍光染料 (図 3B-C) 共同染色。しかし、唯一の 3 つのうち 1 つの実験は H99S と B18、観測差と比較してのカプセル サイズの大幅な違いを示したという事実によって証明されるようにインドのインクを用いた実験の間に大きく変動があったすべて 3 つの蛍光実験 (図3 D 電子) でこれらの系統 (単純な効果、多変量分散分析サンプル サイズ 50 セル/ひずみを =)。
墨染色プロトコル (セクション 5) に記載されている条件を満たす画像は、自動システムを使用して測定できます。図 4 aガイドでレシピを利用するために必要な手順をユーザーを示すワークフロークリプトコッカスカプセルを測定するように設計。ワークフローを開発した後、それは手動と自動の両方のメソッドを使用して 3 つの研究者によるクリプトコッカス細胞の既存画像のキャッシュを測定することによって検証されました。手動で行う際の研究者の測定間に有意差がないと測定は、自動画像解析ソフトウェア (図 4 b) を使用して行われたときもそうでした (ANOVA、サンプル サイズ = 50 セル/研究員)。しかし、小さいがあったが、カプセルのサイズに大きな違い報告 2 つの方法 (図 4) 分散分析、サンプル サイズ = 150 セル/グループ。カプセル径が小さかった一貫して少し手動測定よりもオートメーションを介して測定した場合 (0.3 μ m、 p < 0.001)。さらに、カプセル サイズ測定の同じイメージのセットから別の研究者によって行われたと比較すると、標準エラーは小さいより多くのマニュアルの方法ではなく定量化のため画像解析ソフトを使用した場合正確で再現性のある測定が自動化された方法を使用して。成功した自動測定セルする必要がありますフォーカスされて媒体大きなカプセルに、過度にはできません (図 4) をクラスター化します。小さなカプセルでクラスター化された細胞の焦点が合わないイメージに自動的に測定できなかったソフトウェアがわかった。しかし、我々 はこれらがマニュアルの方法を使用して正確に測定するは困難はありますアサートします。
図 1: インドのインクを測定する染色クリプトコッカスカプセルします。(A)クリプトコッカス墨汁染色によるカプセル測定の模式図。簡単に言うと、栄養素の欠乏では、CO2の露出を使用してカプセル式が誘導される、インドのインクで再停止されるセルはスライド ガラスにマウントされています。陽性細胞の画像は、タイル スキャン コンピューター制御ステージを使用して、ユーザーが選択するいずれかのフィールドを持つ、光学顕微鏡検査によって取得されます。画像は手動で解析したり、自動セグメンテーションと分析のために処理することができます。(B) 画像の一般的なラボひずみ, H99S および 2 つの臨床株、B18、B52、誘導前およびポスト カプセル。スケール バーを表す代表の(C)グラフ実験インドのインクで染色し、手動測定すべての 3 系統の表示カプセル直径 10 μ m (エラー、標準誤差 (SE) として表されます)。統計的有意性は次のように示されている: *、 p < 0.05;* *、 p < 0.01;* * *、 p < 0.001。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 測定する蛍光染色クリプトコッカスカプセルします。(A) で白 (CFW) と 18B7 AF488 染色によるクリプトコッカスカプセル測定の模式図。カプセル誘導と染色の後、細胞がマウントされ、共焦点レーザー顕微鏡を用いた。セル可能性があります異なる焦点面の z スタックは各位置で取得されます。各セルの最大のカプセルの直径を正確に測定する使用ことができます最大強度突起を生成する処理されます。(B)の一般的なラボひずみ, H99S および 2 つの臨床株、B18、B52、画像ポスト カプセル誘導。注: スケール バーは、すべてのイメージの 10 μ m を表します。(C) 最大強度突起の蛍光標識クリプトコッカス細胞。(D)手動でを示す代表的な実験のグラフは CFW と 18B7 AF488 染色すべての 3 系統のカプセルの直径を測定した (エラー、標準誤差 (SE) として表されます)。統計的有意性は次のように示されます: *、 p < 0.05;* *、 p < 0.01;* * *、 p < 0.001。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: インドのインクと蛍光染色の結果を比較します。(A) 解析 3クリプトコッカス菌の染色インドのインクまたは蛍光染料、n = 3 (エラー、標準誤差 (SE) として表されます)。(B) 単一の画像クリプトコッカス細胞染色墨と両方の蛍光染料 (スケール バーは 13 μ m を表します)。水平線を画定カプセルのエッジと垂直線が細胞体の端を区切る。(C) H99S の代表的な実験の定量化は、インドのインクと蛍光染料 (エラーは標準誤差 (SE) として表される) 共同ステンド グラス。(D, E)インドのインク実験 (D) と (E) 蛍光実験カプセル径変動の描写です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: の計算解析クリプトコッカスインドのインクの画像からカプセル直径染色細胞。(A) 画像の領域分割とクリプトコッカスカプセルを用いた自動計測の模式図 (材料の表を参照してください)。マニュアル (マニュアル 1-3) および自動化された方法 (自動 1-3) を使用して 3 の独立した調査官によってカプセル測定 (B) を比較します。調査員は、両方のメソッドは、(エラー、StDev として表されます) によってクリプトコッカス画像の同じキャッシュを使用しました。(C) 平均手動測定と自動測定 (エラーは標準誤差 (SE) として表される) を組み合わせます。両方 (D) 理想の例と(E) 非理想的な画像のクリプトコッカス。非理想的なイメージは、ソフトウェアで正常に測定できません。統計的有意性は次のように示されている: *、 p < 0.05;* *、 p < 0.01;* * *、 p < 0.001。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
何十年も、カプセルは mycologists および臨床医クリプトコッカスとクリプトコッカス症病原体の主要な病原因子としての役割のために興味があるための研究の主要な焦点をされています。カプセル サイズの系統間の違いを測定する顕微鏡を用いたと異なる成長の下で条件は、病原体と様々 な刺激 (すなわち、異なった環境条件に対する応答に関する重要な情報を提供できます。潜在的な薬物治療など) ここでは、クリプトコッカスカプセルの成長を誘導する方法を概説したし、比較された 2 つの異なるカプセル プロトコルを汚す。最後に、画像解析ソフトを使用して画像から手動測定法に匹敵する結果を生産細胞を染色墨のカプセルの直径の測定を自動化する方法を紹介しました。
実験では、2 つの臨床株、B18、B52、H99S、知られているカプセル サイズ18の標準ラボひずみとを比較しました。両方の染色 3 菌株の最大のカプセルの直径があった臨床ひずみ、B52、ことがわかった。ただし、蛍光測定から結果墨測定がなかった小さいカプセル サイズの 2 つの系統の違いを見分けることができた。染色の両方のメソッドからの結果は、示唆して両方が有効ですが、小さなカプセルを持つ株の測定感度の向上は、可能性があります、クリプトコッカスを染色蛍光画像を用いた一定であった。蛍光の z スタック画像から生成される最大の投影を使用して染色細胞はイメージ化された細胞が異なる焦点面の場合でも正確なカプセルの直径の測定を行うことができますを確保するための研究者をことができます。これらの測定はもっと困難にクリプトコッカスインドのインクと標準的な光学顕微鏡を使用してイメージを作成します。任意の画像で隣接するセル可能性がありますすべての細胞の細胞体カプセル境界を正確に解決するが難しく、わずかに異なる焦点面に座っています。これはおそらくカプセル サイズや系統間の小さい相違の小さな変化を検出する研究者の能力を混同でした。
各メソッドには、固有の利点があります。インドのインクは、その手頃な価格、使いやすさ、安定性 (それがいくつかの蛍光汚れのような時間をかけて低下しない) ため研究者によって最もよく使用されます。インドのインクは、単純な否定的な汚れのため蛍光顕微鏡よりもより容易に利用可能な標準的な光顕微鏡と組み合わせて使用できます。ただし、正しい縦横比 (インド インク: バッファー) で使用しない場合汚れは自動画像解析を複雑にする「斑紋」背景イメージされたときを作成できます。蛍光染料をその柔軟性のために有利にすることができますを使用するより時間のかかる、高価な我々 は、その感度を示します。クリプトコッカスを含む免疫細胞によって貪食されて、クリプトコッカスカプセルの病理に必要な実験でカプセルのサイズとセルの負担の計測のために特に有用であります。組織サンプル (この資料に記載がない技術)32。白や蛍光タグ アンチ GXM 抗体などの蛍光染料と染色は問題がある場合 (例えば、不十分な染色)、これを一般的に汚損のプロトコルを最適化することで克服する (増加/減少、濃度やインキュベーション時間染付)。
方法論を染色に関係なく我々 はカプセルの誘導と適切な画像キャプチャの両方がプロトコルで重要な手順を見つけます。本稿に記載されているプロトコルは、クリプトコッカスカプセル誘導のいくつかの標準的な方法の一つで、多くの年23の酵母研究所で正常に使用されています。クリプトコッカスカプセル誘導は CO2-依存し、緊張に満ちた条件23,33でのみ発生します。したがって、適切な栄養欠乏成長媒体を使用して 5% CO2インキュベーターで発生することが重要です。そのカプセルが潜伏 (通常 18-24 h) の標準的な期間後誘導されていない疑いがある場合、ストレスの多い状況にさらされたない未誘導制御文化とセルを比較します。2 つの比較は誘導が有効であったかどうかを決定します。成功した誘導は細胞の大半が未誘導制御と比較して、大きなカプセルをことであります。いないすべてのセルが誘発されるため測定するセルは使用可能な細胞の異種表現をする必要があります。
自動計測目的である場合は特に一貫性のあるイメージの獲得の重要性を誇張することはできません。ファイルのビット深度とイメージの圧縮と同様、フォーカス、コントラスト、背景の蛍光性は、すべての重要な考慮事項です。可能な場合、単一の焦点面に座っていない細胞の大規模なクラスター、避けるべきいくつか出芽し細胞に触れることが許容されると避けられないことができますが (手動と自動の両方を測定するこのルールを従う必要があります)。細胞を染色する蛍光の共焦点イメージング技術を用いた場合、この問題をある程度回避できます。最大輝度投影相関を生成する z スタックの使用は、単一のイメージ29から別の焦点面の細胞の正確な測定を有効にできます。さらに、サンプルを準備した後すぐに、画像を取得する必要があります。これはインドのインク サンプルを彼らは完全に乾き始める、背景と前景の素子 (セル) の間のコントラストを減少させることができます望ましくない背景の機能を高めることができる、減少につながる自動染色にとって特に重要なします。精度。
カプセル径測定がクリプトコッカスコミュニティで当たり前、この時点まで彼ら通常行われている手動で、相当な時間と人手が必要です。ただし、手動測定の分野で受け入れられる、少ない経費で結果が得られます。画像解析ソフトウェアの進歩は、これらの測定の自動化に向けた最初のステップを取ること可能にしました。自動画像セグメンテーション ソフトウェア パッケージ、小説の開発を必要とせず比較的単純なクリプトコッカス細胞体とカプセル - の簡単な性質 - 2D 画像の円内の円として表示によりそのサイズの測定アルゴリズム。代わりに、既存のアルゴリズムをリンクすることによりクリプトコッカス細胞とカプセルを検出、分割、測定します。このアプローチを使用して、我々 はセル使用カプセル色素、墨、最も一般的で染色し、同じデータ セットの手動測定にこれらを比較しているクリプトコッカスカプセル直径の測定を自動化しました。このメソッドは、再現性の利点を提供し、研究者の時間を節約しながら手動測定と関連付けられる人間のエラーの多くを取り除きます。さらに、自動解析のワークフローには、追加の計測を最小限の労力で組み込むことができます。自動画像解析が研究者が精度と効率の高い、クリプトコッカスカプセルの大規模な数を測定することができる有望なアプローチであると考えています。
全体的に、我々 は正常にクリプトコッカスのカプセルの成長を誘発する、インドのインクまたは蛍光染料のいずれかのサンプルを汚し、画像解析で手動と自動の両方の測定を使用してカプセルの直径を測る方法を示しています。ソフトウェア。染色の両方の方法が実行可能で、(インドのインクの測定と変動より多くがある) が一般に一貫した結果を生成ことが示唆されました。さらに、手動および自動測定方法は、カプセルのサイズが異なるを識別する能力を持っています。
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Disclosures
著者は、Hoyin ライ、自動画像解析ソフトウェア、Aivia を発行して DRVision で製品マネージャーです。
Acknowledgments
ありがとう分子生命科学 (MOBI) 博士後期課程・生物学部ミドル テネシー州立大学 (MTSU) でこの研究のための資金を提供します。プロジェクトはだった MTSU 財団 D.E.N. に与えられた特別なプロジェクトの補助金によって一部で賄われても。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Capsule Induction | |||
| C. neoformans cells | The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University). The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania). | ||
| Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD) | Fisher Scientific | DF0428-17-5 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O) | ||
| DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | |
| 6-well plates | Falcon | CL5335-5EA | |
| Shaking incubator | Thermo Scientific | MaxQ6000 | |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | Isotemp | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Legend XTR | |
| Staining | |||
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Legend Micro 21R | |
| India ink | Fisher Scientific | 14-910-56 | |
| Calcofluor white | Sigma-Aldrich | 18909-100ML-F | |
| 18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488 | A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University) | ||
| PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA) | PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized. | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Glass coverslips | Corning | 2855-18 | #1.5 thickness |
| Clear nail polish or other non-toxic sealant | |||
| Image Acquisition | |||
| Immersion oil | Cargille | 16484 | |
| Light microscope with immersion oil objective | Zeiss | Zeiss Axio A1 with a Plan - NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective | |
| Light microscope camera | Zeiss | Zeiss Axiocam ErCD camera | |
| Confocal microscope with oil immersion objective | Zeiss | LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective. | |
| Confocal microscope software | Zen 2009 | ||
| Confocal microscope camera | Nikon | Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer. | |
| Widefield imaging software | Nikon Elements (Nikon) | ||
| Capsule Measurement | |||
| Image editing software | Photoshop (Adobe) | ||
| Microscope software for manual measurement | Axiovision (Carl Zeiss) | ||
| Image analysis software for automated meesurement | Aivia (DRVision Technologies) | ||
| Spreadsheet software | Excel (Microsoft) |
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