Summary
我们描述了一个协议, 以检测在膜蛋白之间的洗涤剂敏感的相互作用, 使用结合的排序受体, sortilin, 到第一个腔内循环的葡萄糖转运蛋白, GLUT4, 作为一个例子。
Abstract
我们探索蛋白质与蛋白质相互作用的能力是理解细胞中调控连接的关键。然而, 在许多情况下, 检测蛋白质与蛋白质之间的相互作用与重大的实验挑战有关。特别地, 排序感受器与他们的蛋白质货物在膜隔间的腔内相互作用经常以洗涤剂敏感的方式, 使这些蛋白质的共同免疫沉淀不可用。分类受体 sortilin 对葡萄糖转运体 GLUT4 的结合可以作为膜蛋白间弱腔相互作用的一个例子。在这里, 我们描述了一个快速, 简单, 廉价的检测, 以验证 sortilin 和 GLUT4 之间的相互作用。为此, 我们设计和化学合成了与 GLUT4 内腔部分的潜在 sortilin 结合表位对应的 c-myc 标记肽。Sortilin 标记六 histidines 的哺乳动物细胞, 并从细胞裂解物使用钴珠分离。在不同 pH 值下, 用多肽溶液在珠上固定 Sortilin, 用洗脱材料进行了分析。这种检测可以很容易地适应研究其他洗涤剂敏感的蛋白质-蛋白质相互作用。
Introduction
GLUT4 是一种葡萄糖转运蛋白, 主要表现在脂肪和骨骼肌细胞中, 它介导胰岛素对膳食后血糖清除的影响1。GLUT4 是一种非常稳定的蛋白质, 它是在平移后的水平上调节的。在没有胰岛素的情况下, GLUT4 在很大程度上被排除在血浆膜上 (因此葡萄糖的基底通透性较低), 主要在小胰岛素应答性囊泡 (IRVs) 和反式高尔基网络 (TGN) 的细胞内进行定位, 这可能代表IRV 捐赠舱在胰岛素的管理, IRVs 保险丝与等离子膜, 并提供 GLUT4 到其功能的地方。这增加了血浆膜的渗透率为葡萄糖, 因此葡萄糖吸收从血液入脂肪细胞和骨骼肌肌细胞膜上升10到40倍。胰岛素退出后, GLUT4 被内化成早期/排序内涵体, 然后检索到 TGN 的 IRVs 重新形成。GLUT4 路径中的两个排序步骤,即从外围早期内涵体到核周 TGN 的检索, 以及 IRVs 捐赠膜 TGN 的形成是由 Vps10p 家庭成员 sortilin 启用的, 它表示类型 i跨膜蛋白和分选受体。根据一个模型, sortilin 工作作为跨膜支架蛋白: 它结合 GLUT4 在内涵体和 TGN 的流明, 并招募 retromer 或网格蛋白适配器的细胞质侧的供体膜通过其C总站2 ,3. 这促进了 GLUT4 在胞内隔间植物常常将 GLUT4 的水泡载体的分布。
sortilin 的细胞质尾部与 retromer 和各种适配器蛋白的相互作用得到了很好的证明。然而, sortilin 对 GLUT4 (及其它的其他一些蛋白质配体) 的约束是难以证明的。特别是, 试图共同 immunoprecipitate sortilin 和 GLUT4 是没有成功的可能是由于洗涤剂敏感的性质的相互作用的这两种蛋白质。此外, 作为一种典型的转运蛋白, GLUT4 有12个跨膜域和6个腔圈, 任何组合可能代表一个 sortilin 绑定站点。同时, 大量的间接证据, 如细胞内的大量联合定位, 与膜透性 DSP 的交联, 以及酵母两种杂交系统的相互作用, 表明 sortilin 可以绑定到 GLUT4。此外, 使用后一种方法结合丙氨酸扫描诱变, 我们以前确定, Vps10p 领域的 sortilin 主要绑定到第一个腔内循环的 GLUT4。然而, 哺乳动物细胞中这种相互作用的证据却不见了。在这里, 我们已经分离了他标记的 sortilin 从转染的 3T3-L1 细胞使用钴树脂, 并证明它可以与化学合成肽相对应的第一腔内循环的 GLUT4 在 ph 值6和 ph 值 8, 类似酸性环境在TGN 膜腔内细胞膜腔和中性环境。在控制实验中, 未发现从非转染细胞中提取的萃取物在同一珠子上加载的肽结合。
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Protocol
1. 肽的处理
- 肽的设计与排序
- 选择所需的肽序列, 并添加一个标记, 如 c-myc 表位 (EQKLISEED) 在其 N 或 C 终点。
- 用肽溶解度计算器 http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php 检查水中肽的预测溶解度。如果溶解度低, 尝试添加另一个水溶性标签, 以改变电荷平衡。
注意: 我们使用了与第一个腔圈 (fll) 相对应的肽, 在 N 总站 (Myc-fll-GLUT4) 上标记了 GLUT4 的 c-myc 表位 (粗体): EQKLISEEDLNAPQKVIEQSYNATWLGRQGPGGPSSIPPGTLTTLWA 具有 "良好" 预测水中溶解度. - 订购具有至少75% 纯度的自定义肽, 这是足够的化验, 并要求提供者的溶解度测试。将该顺序分成至少两个整除数, 以防在溶解肽时出现意外问题。
注: Myc-fll-GLUT4 在两个整除数中被订购。其报告的溶解度在超纯水是≤10毫克/毫升。
- 溶解肽
注: 超纯水是最好的溶剂。如果肽似乎不是水溶性的, 请参考 http://www.genscript.com/peptide_solubility_and_stablity.html 的说明。- 在超纯水或选择缓冲器中制备100x 的肽溶液, 浓度为100微克/毫升。
- 将解决方案分成 50-100 µL 整除数, 并将其存储在-20 摄氏度。
2. 细胞的处理
- 细胞培养
- 使用野生型 (histidines) 细胞作为阴性对照, 并表达靶蛋白标记为六 (HisP) 的细胞。
注: 我们使用的 3T3 L1 前脂肪细胞稳定转染 Sortilin-c-myc/他的5。 - 生长在 Dulbecco 的改良鹰培养基 (DMEM) 高糖的细胞, 补充10% 小牛牛血清, 谷氨酰胺 (2 毫米) 和青霉素/链霉素 (5 微克/毫升) 在37°c 在 10% CO2。
- 坐四10厘米的细胞, 染两个与 HisP 和染其他两个与控制质粒 (野生)。48小时后转染, 细胞应达到 80-90% 融合。
- 使用野生型 (histidines) 细胞作为阴性对照, 并表达靶蛋白标记为六 (HisP) 的细胞。
- 细胞裂解物的制备
- 准备溶解缓冲 (10 毫米 Hepes, 30 毫米氯化钠, 5% 甘油, 10 毫米咪唑, 0.5% 海卫 X-100 和蛋白酶抑制剂鸡尾酒没有 EDTA 为他标记的蛋白质的隔离, pH 7.4) 并且保持它在4°c:
- 用10毫升1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 在4摄氏度洗涤细胞三次。
- 把盘子放在冰上, 在每道菜里加500µL 的溶解缓冲液。用细胞刮刀裂解物细胞。
- 将细胞裂解液从每道菜放入不同的1.5 毫升管中。将管子标记为 WT-pH6、WT-pH8、HisP-pH6、HisP-pH8。
- 将细胞裂解物通过注射器, 用26G 针向上和向下五次, 以完成裂解。
- 离心细胞裂解物在 1.6万 x g 10 分钟在4°c。
- 将上清液转移到新的标签相同的管。
- 用蛋白质检测试剂盒或其他试剂盒分析蛋白质浓度。
- 利用裂解缓冲液, 平衡所有四裂解物的蛋白质浓度。
- 分离每个裂解液的小 (ca 20 µL) 整除, 并将其保持在-20 摄氏度, 以进行可能的控制实验和/或故障排除。
3. 他标记的蛋白质对 HisPur 钴珠的捆绑
- 使用商用的洗涤缓冲器或准备一个 (50 毫米 Na2HPO4/NaH2PO4, 300 毫米氯化钠, 20 毫米咪唑, pH 8) 和保持它在4°c。
- 用 tittering 洗涤缓冲液 ph 值为 8, 用 HCl 制备6的洗涤缓冲器. 保持在4摄氏度。
- 轻轻地旋转钴珠的瓶子, 使其均匀悬浮。
- 将40µL 的钴珠悬浮液放入四1.5 毫升管中, 标记为上述 (步骤 2.2.4)。
- 在每管上加1毫升溶解缓冲液, 并将管子离心在 1000 x g 处, 5 秒. 吸入上清, 并添加 40 ul 的溶解缓冲液沉淀到固定的珠子上。
- 将单元格裂解物添加到相应的管中。
- 在 20 rpm 时, 在4摄氏度的管转子上孵育90分钟的管子。
- 离心管在 1000 x g 5 s 和收集上清。将上清液保持在摄氏4摄氏度。
- 添加500µL 的 ph 值8或 ph 6 洗涤缓冲器到相应的管, 并重新暂停珠轻轻。
- 离心管在 1000 x g 5 s, 并丢弃上清液。
- 重复步骤3.9 和 3.10, 四次。
4. 肽对固定在珠子上的标记蛋白的约束
- 使用100x 工作溶液的肽 (步骤 1.2.1), 准备1x 工作解决方案, 无论是 ph 值6或 ph 8 洗涤缓冲器 (两个100µL 整除数为每个, 1 µg/毫升)。
- 添加 100 ul 的1x 肽溶液的洗涤珠与相应的 pH 值。
- 在 20 rpm 的管转子上孵化30分钟4摄氏度的珠子。
- 离心管在 1000 x g 5 s, 收集上清, 并保持在-20 摄氏度。
- 重复步骤3.9 和 3.10, 四次。
注意: 为了减少可能的背景, 以下步骤可以取代步骤 4.4 & 4.5。 - 采取四微柱与30微米毛孔, 标签他们作为在步骤 2.2.4, 并把列在收集管。
- 步骤4.3 完成后, 将孵化混合物转移到柱中, 允许溶液通过重力。保持在-20 摄氏度的流量。
- 通过重力将500µL 的洗涤缓冲器与 ph 值6或 ph 8 通过相应的柱。丢弃流。
- 重复步骤4.8 四次。
- 在最后洗涤以后, 离心机列在 1000 x g 在十五年代。
5. 钴珠洗脱
- 使用商业 Tricine 样品缓冲 (200 毫米三盐酸, 40% 甘油, 2% SDS, 0.04% 考马斯蓝色, pH 6.8) 和增加β巯基乙醇到最后浓度2%。
- 添加40µL 的 Tricine 样品缓冲 (与β-巯基乙醇) 到洗涤珠和漩涡的样品。
- 加热样品10分钟在100°c, 再漩涡样品, 并且离心机管子在 1000 x g 为 5 s。
注: 为了减少洗脱中可能的非特异性结合, 以下步骤可取代步骤 5.1-5.3。 - 添加 40 ul 的洗脱咪唑缓冲器 (50 毫米 Na2HPO4/NaH2PO4, 300 毫米氯化钠, 0.25 米咪唑) 到洗涤珠, 漩涡和孵化管在室温为20分钟。
- 离心管在 3000 x g 三十年代, 收集上清 (洗脱样品) 和转移到新的标签管。
- 添加 40 ul 的 Tricine 样品缓冲区到每管, 加热样品10分钟在100°c, 漩涡和离心机管在 1000 x g 为 5 s。
注: 如果使用微柱, 将洗脱缓冲液添加到洗涤过的珠子上, 孵育20分钟, 并通过离心 8000 x g 进行2分钟的洗脱。
注: 样品可保持在-20 摄氏度, 直到电泳进行。
6. 电泳和印迹
注: 样品已准备好, 由 SDS 页和随后的西方印迹分离。遵循凝胶电泳 (https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot) 协议, 并进行以下修改。
- 使用商业上可用的 10-20% Tricine 梯度凝胶。
- 在凝胶上, 载入洗脱样品的20µL 和裂解物的20µL (步骤 2.2.10)。对于故障排除, 建议加载20µL 的未绑定材料 (步骤 3.8) 和 10 ng 的肽;在加载之前, 将相等数量的 Tricine 示例缓冲区添加到这些示例中。
- 在商用三/Tricine/sds 运行缓冲器 (100 毫米三, 100 毫米 Tricine, 0.1% SDS, pH 8.3) 进行电泳。
- 将材料从凝胶转移到0.45 µm 硝化膜上使用转移缓冲 (25 毫米三基, 192 毫米甘氨酸, pH 8.4) 补充20% 甲醇。
- 室温下用3% 牛血清白蛋白 (BSA) 阻断膜, 1 小时。使用预先染色的分子量标记作为参考, 在水平上切开膜, 将顶部与 HisP 抗体杂交, 并用抗体对 c-myc 表位进行印迹, 以识别 c-myc 标记的肽。
注意: 在我们的特殊情况下, 不需要切割膜, 因为 HisP 和 Myc-fll-GLUT4 都可以用抗 c-myc 抗体检测到。
7. 结果分析
- 使用图像站或 ImageJ 程序量化所有西方印迹信号的强度。
- 在两个 pH 值的 HisP 上, 将来自 c-myc 标记肽的信号正常化为信号。
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Representative Results
裂解物是由 3T3 L1 细胞稳定转染的 Sortilin-c-myc/他的5和从野生 3T3 L1 细胞, 用作负控制.两个裂解物在 ph 值6或 ph 值8和彻底洗涤的钴珠孵化。然后在 Myc-fll-Glut4 的溶液中孵化出固定蛋白的珠子。经过仔细的洗涤, 与珠子绑定的蛋白质与0.25 米咪唑洗脱。样品被接受了, 连同原始的裂解物, 到 SDS 页在一个 10-20% Tricine 梯度凝胶跟随西部印迹与抗 c-myc 抗体, 允许检测 sortilin-c-myc 或他 (110 kd) 和 Myc-fll-GLUT4 (5 kd) (图1).
Myc-fll-GLUT4 (10 ng) 在凝胶的第一条车道被装载了作为参考。由于肽的纯度只有 75%, 污染物是明显的 (更高的波段)。原始细胞裂解物从 Sortilin 和他的表达细胞包含多波段识别的抗 c-myc 抗体。从 Sortilin 和他的表达细胞分离的材料是非常干净的。除了一些小的非特定的带, 它只有两个包含了 c-myc 的组成部分: Sortilin/他和 Myc-fll-GLUT4。在第一条车道上的污染肽似乎并没有绑定到 Sortilin/他。负控制 (洗脱液) 具有主要的非特定波段。
当 GLUT4 通过细胞内的间隔, 如内涵体和 TGN, 有不同的腔内 pH 值, 我们想评估 GLUT4 与 sortilin 在 ph 值6和 ph 值 8 (图2) 的相互作用。结果的密度测定 (未显示) 未发现 Myc-fll-GLUT4 和 Sortilin/他在不同 pH 值的珠子上保留的比例有任何显著差异。因此, 我们得出结论, GLUT4 具有与 sortilin 在内涵体和 TGN 中进行交互的能力。
图 1.Sortilin/他与 Myc-fll-GLUT4 在钴珠上的相互作用.裂解物 3T3-L1 细胞和 3T3 L1 细胞稳定表达 Sortilin-c-myc/他 (S) 通过钴珠, 洗涤, 孵化与 Myc-fll-Glut4 在 pH 值 8, 再次洗涤, 洗脱与咪唑缓冲。Myc-fll-Glut4 (10 ng) 被装载在第一条车道作为参考。
图 2.Sortilin/他与 Myc-fll-GLUT4 在 ph 值8和 ph 值6之间进行交互.Myc-fll-Glut4 是在 ph 值为6和 ph 8 的珠上固定在珠子上的材料, 用甘氨酸样品缓冲液冲洗和洗脱。该图已从 Pan x ( et al3) 中进行了调整。
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Discussion
Sortilin 是一种进化保守的多配体蛋白受体, 涉及两个信号在等离子膜和细胞内排序事件6,7。然而, 寻找正宗 sortilin 的配体 (其中一些是腔内或整体膜蛋白) 是复杂的, 因为 sortilin 与它的一些结合伙伴的相互作用似乎对洗涤剂敏感。因此, 一种简单而广泛的方法来研究蛋白质-蛋白质相互作用, 共同免疫沉淀, 不能轻易地应用。一些研究组使用免疫沉淀来演示 sortilin 及其潜在配体之间的交互作用 8, 9.然而, 这些实验是在0.1% 海卫一或0.6% 章中进行的, 这对膜增溶的完整性产生怀疑。
其他研究人员通过表面等离子体共振10,11, 研究了 sortilin 及其配体之间的相互作用。虽然表面等离子共振可以说是解决这个问题的最好方法, 但它需要昂贵的设备和大量的纯重组蛋白质, 成本高昂, 耗时。
在这里, 我们描述了一种技术, 结合其他方法, 如交叉链接和酵母两个混合系统, 强烈建议 sortilin 可以绑定到 GLUT4。该检测方法快速、简便, 可方便地适应其他蛋白质和不同大小的肽。
这项化验有几个关键步骤。第一种是肽在水中的溶解度。另一种是正确控制的选择。显然, 大量的生物材料可以与钴珠通过内生的他达到序列或非特定。因此, 在我们的案例 Sortilin 中, 必须固定在裂解物细胞和转染感兴趣蛋白质的细胞的珠子上。在这样的实验设计中, 绑定到珠子上的物质只会在一个蛋白质、Sortilin 中不同, 所以一定程度的背景结合的肽来控制珠子是可以容忍的。不过, 通过提高最终洗涤步骤的严格性, 可以减少肽对珠子的背景结合。使用迷你柱来洗涤珠子可能会进一步减少背景约束。
由于 "GLUT4 通路" 的性质, 我们希望以不同的 pH 值来解决 Myc-fll-GLUT4 对 sortilin 的约束。我们认识到, 早期/分拣内涵体的腔内 pH 值可降至6以下。然而, pH 低于6会扰乱他标记的蛋白质与钴珠子的结合, 这可能被认为是方法的限制。
用他的表位分离钴珠子上的靶蛋白, 优于其他亲和纯化步骤, 如免疫沉淀与特定的抗体, 在产量和非特定的约束力方面。然而, 完全有可能的是, 在任何其他树脂 (最好, 磁性珠) 的目标蛋白的分离, 以适当的控制将证明是成功的。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了研究所资助的研究补助金 DK52057 和 DK107498 从 nih 到 K.V.K. x P 得到了来自 nih 的机构培训补助金2T32DK007201 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8849 | for use in purification of histidine tag protein |
| Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-040-CV | PBS |
| 1mL Insulin Syringe U-100 | BD | 329652 | 26G x 1/2 |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23228 | |
| Wash buffer | Boston BioProducts | BP-234 | For His-tag protein purification |
| HisPur Cobalt Resin | Thermo Scientific | 89964 | |
| Tricine sample Buffer | Bio-Rad | 161-0739 | with SDS, bMercaptaethanol should be added |
| Elution Buffer | Boston BioProducts | BP-236 | For His-tag protein purificationwith 250mM Imidazole |
| Mini-Protean Tris-Tricine precast gels 10-20% | Bio-Rad | 456-3115 | For seperation of peptide and small protein |
| Tris/Tricine/SDS running buffer | Bio-Rad | 161-0744 | |
| Transfer Buffer | Boston BioProducts | BP-190 | Add 20% methanol |
| Nitrocellulose membrane 0.45 mm | Bio-Rad | 1620115 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | BSA |
| Anti Myc antibody | Cell Signaling | 2272 | Rabbit |
| Peptide | Genscipt | customize ordering | |
| Precision Plus Protein Dual color Standarts | BioRad | 161-0374 |
References
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