Summary
洗剤に敏感な例として並べ替え受容体、ソーティリン、GLUT4 グルコース輸送体タンパク質の最初の内腔のループに結合を用いた膜タンパク質相互作用の検出のためのプロトコルについて述べる。
Abstract
蛋白質蛋白質の相互作用を探索する我々 の能力は、セル内の規制の接続を理解する鍵です。ただし、多くの場合タンパク質-タンパク質相互作用の検出は、重要な実験課題に関連付けられます。特に、並べ替えの受容体は、これらの蛋白質の免疫沈降の co を使用できなくなり、洗剤に敏感なファッション多いの膜区画のルーメン内タンパク質貨物と対話します。グルコーストランスポーター GLUT4 を膜タンパク質相互作用弱い内腔の例として役立つことを並べ替えの受容体ソーティリンの結合。ここでは、ソーティリンと GLUT4 の相互作用を検証するための高速、シンプル、かつ安価な試金を記述します。そのため設計し、GLUT4 の内腔の一部の潜在的なソーティリン-結合エピトープに対応する myc タグ付きペプチドを化学合成した.6 ヒスチジンが付いたソーティリンは、哺乳類細胞で発現され、コバルト ビーズを用いたセル lysates から分離されました。ビーズに固定化したソーティリンが異なる pH 値でペプチド溶液で培養された、溶出の材料は西部にしみが付くことによって分析しました。この試金は簡単に他の洗剤に敏感なタンパク質間相互作用の研究に適応することができます。
Introduction
GLUT4 はそれが食後血ブドウ糖クリアランス1インスリンの効果を仲介する脂肪と骨格筋細胞に主に発現するグルコース輸送タンパク質です。非常に安定したタンパク質であること、GLUT4 は翻訳後修飾レベルで調整されます。インスリンのない場合は、GLUT4 は、主細胞膜 (それゆえ低グルコースの基底透水性) から除外され、主に小さなインスリン応答性小胞 (IRVs) の細胞内局在とトランスゴルジ ネットワーク (TGN) を表す可能性があります。IRV ドナー コンパートメントです。インスリン投与時に、IRVs は細胞膜と融合し、その機能のサイトに GLUT4 を提供します。脂肪細胞、骨格筋細胞に血液からブドウ糖取り込み上昇する 10 倍、これはグルコースの細胞膜の透過性を増加します。インスリン離脱後 GLUT4 は並べ替えと初期エンドソームに取り込ま、TGN、IRVs、再結成に取得されます。両方の並べ替え手順 GLUT4 経路、すなわち末梢早期エンドソームから核 TGN に取得し、IRVs の形成の TGN ドナーの Vps10p 家族のメンバー、ソーティリンは、型を表しますで膜が有効 I膜貫通型タンパク質と並べ替えの受容体。1 つのモデルによるとソーティリンは、膜貫通足場蛋白質として働く: それはエンドソームと TGN の内腔の GLUT4 を連結して、その C 末端の2、 、ドナー膜を介して細胞質側にレトロマーやクラスリン アダプターを募集3。 これは容易に細胞内コンパートメント間 GLUT4 を若し小胞のキャリアへの GLUT4 の分配。
ソーティリンの細胞質テール レトロマーとさまざまなアダプター蛋白質との相互作用はよく記載されています。ただし、ソーティリン GLUT4 (とその他のタンパク質のリガンドのいくつか) のバインドに証明するためにチャレンジしております。特に、co immunoprecipitate ソーティリンと GLUT4 の試みこれらの 2 つの蛋白質間の相互作用の洗剤に敏感な性質のためにおそらく成功されていません。また、典型的な輸送体タンパク質 GLUT4 が 12 の膜貫通ドメインと六つの内腔ループの組み合わせはソーティリン結合部位を表すことができる可能性があります。同時に酵母 2 ハイブリッド系の架橋膜透過性の DSP との相互作用のセルで、実質的なの共局在などの間接証拠の大きいボディは、そのソーティリンは GLUT4 にバインドすることをお勧めします。さらに、変異をスキャン アラニンと組み合わせで後者のアプローチを使用して、以前決定した GLUT4 の最初の内腔のループに主にソーティリンの Vps10p ドメインがバインドされていること。しかし、哺乳類細胞でこのような相互作用の証拠が行方不明になっています。ここでは、酸性の環境でのようなソーティリン コバルト樹脂を使用し、pH 6 および 8 の pH で GLUT4 の最初の内腔ループに対応する化学的に合成されたペプチドがやり取りできることを示した transfected 3t3-l1 細胞からの彼の付けられた分離した、エンドソーム内腔と TGN 膜の内腔で中立的な環境。同じビーズで非トランスフェクト細胞から調製した抽出物を読み込んだ制御実験のペプチド結合が見つかりませんでした。
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Protocol
1. ペプチドの取り扱い
- デザインとペプチドの順序
- ペプチドの任意のシーケンスを選択し、myc エピトープ (EQKLISEED) でそのいずれか N- または C 末端などのタグを追加します。
- ペプチドの溶解度電卓 http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php を用いた水中ペプチドの予測の溶解度をチェックします。溶解度が低い場合は、電荷バランスを変更する別の水溶性タグを追加ましょう。
注意: 使用して GLUT4 myc エピトープ (太字) タグの最初の内腔ループ (fll) に対応するペプチド N 末端 (Myc-fll-GLUT4): 水に「良い」予測への溶解度は、 EQKLISEEDLNAPQKVIEQSYNATWLGRQGPGGPSSIPPGTLTTLWA. - 注文少なくとも 75% のカスタムのペプチド純度、試金のためだけで十分ですし、溶解テストのプロバイダーに依頼します。ペプチドの溶解と予期しない問題がある場合、少なくとも 2 つの因数に順序を分けます。
注: 2 つの因数で Myc fll GLUT4 が命じられました。純水で溶解性報告は ≤10 mg/mL です。
- ペプチドの溶解
注: 超純水は最高の溶剤です。水溶性ペプチドが表示されない場合は、手順については http://www.genscript.com/peptide_solubility_and_stablity.html を参照してください。- 純水または 100 μ g/mL の濃度で選択、バッファーの中のペプチドの実用的なソリューション x 100 を準備します。
- 50-100 μ 因数にソリューションを分離し、-20 ° C で保存
2. 細胞の取り扱い
- 細胞培養
- 否定的な制御、および 6 ヒスチジン (HisP) が付いたターゲット蛋白質を発現する細胞として野生型 (WT) セルを使用します。
注意: 3T3 L1 前脂肪細胞安定発現するソーティリン myc/彼5を使用します。 - ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 高糖度, 10% 牛ウシ血清を添加した細胞を成長グルタミン (2 mM) とペニシリン/ストレプトマイシン (5 μ g/mL) 10% CO2の 37 ° C で。
- 細胞の 4 つの 10 cm 皿に座る、HisP とそれらの 2 つを transfect し、transfect 制御プラスミド (WT) と他の 2 つ。トランスフェクション後 48 時間は、電池が 80-90% の confluency に達する必要があります。
- 否定的な制御、および 6 ヒスチジン (HisP) が付いたターゲット蛋白質を発現する細胞として野生型 (WT) セルを使用します。
- セル Lysates の準備
- 換散バッファー (10 mM Hepes、30 mM の NaCl、5% グリセロール、10 mM のイミダゾール、0.5% トリトン X-100 およびプロテアーゼ抑制剤のカクテル edta、pH 7.4 の彼の付けられた蛋白質の分離) を準備し、4 でそれを維持 ° c:
- リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 4 ° C で × 1 の 10 mL で 3 回セルを洗浄します。
- 氷の上の皿を入れて、それぞれの皿に換散バッファーの 500 μ L を追加します。細胞スクレーパーを使用してセル lysates を収穫します。
- 場所別 1.5 mL チューブに各皿から細胞ライセート。WT pH6、WT pH8、HisP pH6、HisP pH8 チューブ ラベルを付けます。
- セル lysates を通過注射器 26 G 針、5 回上下、完全溶解。
- 4 ° C で 10 分間 16,000 x g でセル lysates を遠心分離します。
- 培養上清を新しい同じラベルの付いたチューブに転送します。
- BCA タンパク質アッセイ キットや他のキットを使用して蛋白質の集中を分析します。
- 換散バッファーを使用すると、すべての 4 つの溶解液のタンパク質濃度を均等化します。
- 各ライセートの小 (約20 μ L) 因数を分離可能な制御実験やトラブル ・ シューティングのための-20 ° C で保管してください。
3. HisPur コバルト ビーズに彼の付けられた蛋白質の結合
- 市販の洗浄バッファーを使用または 1 つ (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 300 mM の NaCl、20 mM のイミダゾール、pH 8) を準備し、4 ° C で維持
- 準備洗浄バッファーを幸せそうな洗浄バッファー pH 8 による pH 6 塩酸維持それ 4 ° C で
- 均質な懸濁液にコバルト ビーズのボトルを軽く旋回します。
- 上記のようについた 4 つの 1.5 mL チューブ (ステップ 2.2.4) にコバルト ビーズ懸濁液 40 μ L を分注します。
- 各管に 1 mL の溶解バッファーを追加し 5 s. 吸引、上澄みの 1000 x g でチューブを遠心し、定住ビーズに換散バッファーの 40 μ L を追加します。
- 対応する管にセル lysates を追加します。
- 4 ° C で 20 rpm 管回転で 90 分の管を孵化させなさい。
- 遠心分離機管 1000 g は 5 s、収集清 x。4 ° C で上澄みを維持します。
- 対応するチューブに pH 8 の pH 6 洗浄バッファー 500 μ L を追加し、再優しくビーズを中断します。
- 5 s と破棄のため 1000 x g でチューブを遠心培養上清。
- 手順 3.9 および 3.10 を 4 回。
4. ビーズに固定化した彼の付けられた蛋白質をペプチドの結合
- PH 6 または 8 の pH 洗浄バッファー (各 2 つ 100 μ 因数、1 μ g/mL) で稼動するソリューション x 1 ペプチド (ステップ 1.2.1) の 100 倍実用的なソリューションを使用して準備します。
- 対応する pH と洗浄のビーズに 1 x ペプチド溶液 100 μ L を追加します。
- 4 ° C で 20 rpm 管回転で 30 分のビーズをインキュベートします。
- 5 1,000 x g でチューブを遠心分離機 s、上澄みを収集し、-20 ° C でそれを維持
- 手順 3.9 および 3.10 を 4 回。
注: 可能なバック グラウンドを低減するために次の手順は 4.4 と 4.5 の手順を置き換えることができます。 - 30 μ m の孔を持つ 4 つのマイクロ列を取り出して 2.2.4 には、ステップのようにラベルを貼ってコレクション チューブに列を配置します。
- 4.3、ステップの終了時は、列にインキュベーション混合物を転送後、は、重力によって通過するソリューションを許可します。-20 ° C で流れを維持します。
- 重力によって洗浄バッファー pH 6 または pH 8 対応する列との 500 μ L を渡します。流れを破棄します。
- 手順 4.8 4 回繰り返します。
- 最後の洗浄後遠心 15 1,000 x g で列 s。
5. コバルト ビーズから溶出
- 商業トリシン サンプル バッファーを使用 (200 mM トリス-HCl、40% のグリセロール、2% SDS 0.04% pH 6.8 ブルー) と β-メルカプトエタノールを加える最終濃度 2%。
- ビーズ洗浄と渦サンプル (β-メルカプトエタノール) とトリシン サンプル バッファーの 40 μ L を追加します。
- 100 ° C で 10 分間のサンプルを熱渦再度、サンプル 5 1,000 x g でチューブを遠心分離機と s。
注: 溶出の可能な非特異的結合を減少するために次の手順は手順 5.1 5.3 を置き換えることができます。 - 洗浄に溶出イミダゾール バッファー (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 300 mM の NaCl、0.25 M イミダゾール) の 40 μ L を追加ビーズ、渦と 20 分間室温でチューブを孵化させなさい。
- 3,000 x 30 g のチューブを遠心分離機 s、上清 (溶出サンプル) を収集し、新しいラベルの付いた管にそれを転送します。
- 各管にトリシン サンプルバッファーの 40 μ L を追加、100 ° C、渦および遠心分離機で 10 分間のサンプルを加熱チューブ 5 1,000 x g で s。
注: は、20 分間インキュベート マイクロ列を使用すると、洗浄のビーズに溶出バッファーを追加する場合と 2 分 8,000 × g で遠心分離して溶出を収集します。
注: サンプルは電気泳動の実行まで、-20 ° C で保存できます。
6. 電気泳動および西部にしみが付くこと
注: サンプルは SDS のページおよびそれに続く西部のしみによる分離の準備ができています。ゲル電気泳動 (https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot) 次の修正のプロトコルに従ってください。
- 市販の 10-20% トリシン勾配ゲルを使用します。
- ゲル、溶出サンプルの 20 μ L と 20 μ L の lysates (ステップ 2.2.10) をロードします。トラブルの撮影のため、非連結材 (ステップ 3.8) の 20 μ L をロードお勧め 10 ペプチド; ng、読み込み前にこれらのサンプルをトリシン サンプル バッファーの等しい量を追加します。
- 商業トリス/トリシン/SDS バッファー (100 mM 100 mM トリシン、トリスと 0.1 %sds、pH 8.3) を実行しているの電気泳動を行います。
- 転送バッファー (25 mM Tris ベース、192 mM グリシン、pH 8.4) 20% メタノールを添加したを使用して 0.45 μ m ニトロセルロース膜にゲルから材料を転送します。
- 3% の膜をブロック ウシ血清アルブミン (BSA) 室温で 1 時間。事前にステンド グラスの分子量のマーカーを使用すると、ガイドとして、膜を水平にカット、HisP、抗体と上の部分のしみ、myc タグ付きペプチドを識別する myc エピトープ抗体に底の部分のしみ。
注: 特定の例、膜の切削は必要ありません HisP と Myc fll GLUT4 は反 myc 抗体を検出できるので。
7. 結果の分析
- イメージ ステーションや ImageJ のプログラムを使用してすべての西部のしみの信号の強さを定量化します。
- 両方の pH 値で HisP から信号に対して myc タグ付きペプチドから信号を正規化します。
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Representative Results
Lysates 3T3 L1 細胞安定発現するソーティリン myc/彼5と WT 3T3 L1 細胞、ネガティブ コントロールとして使用からの調製。両方の lysates は pH 6 または 8 の pH でコバルト ビーズをインキュベートされ、徹底的に洗浄します。固定された蛋白質とビーズ、Myc fll Glut4 のソリューションで培養。注意して洗浄後 0.25 M イミダゾールとビーズに結合蛋白質が溶出しました。勾配ゲルが両方の検出ソーティリン myc/彼許可反 Myc 抗体を用いてウェスタンブロッティング続いて 10-20% トリシンの SDS ページに、元の lysates と一緒に、サンプルを受けた (110 kD) と Myc fll GLUT4 (5 kD) (図 1).
Myc fll GLUT4 (10 ng) 参照としてゲルの最初の車線に読み込まれました。ペプチッドの純度が 75% だけの汚染は明白な (より高いバンド) です。WT とソーティリン myc/彼の表現するセルからの元のセル lysates には反 myc 抗体によって認識される複数のバンドが含まれます。ソーティリン myc/彼の表現する細胞から分離した材料が多くきれいです。いくつかのマイナーな非固有のバンドに加えて、myc を含むコンポーネントが 2 つだけ: ソーティリン myc/彼と Myc fll GLUT4。第 1 レーンで汚染のペプチドは、ソーティリン myc/彼にバインドするは表示されません。ネガティブ コントロール (WT 溶出液) は主に無指定バンドです。
GLUT4 はエンドソームや TGN など、異なる内腔 pH がある、細胞内コンパートメントを通過する際、GLUT4 と pH 6 8 (図 2) でソーティリンとの相互作用を評価するために考えました。(表示されていません) 結果の密度測定は明らかにいない Myc fll GLUT4 とソーティリン myc/彼の比率には差別 pH 値でビーズ上に保持されます。こうして GLUT4 がエンドソームと TGN の両方でソーティリンと対話する能力を持っていることが分かった。
図 1.コバルト ビーズに Myc-fll-GLUT4 ソーティリン myc/彼との相互作用します。WT 3t3-l1 細胞から調製したライセートとコバルト ビーズを通過、洗浄、Myc-fll-Glut4 ph 8、再び、洗浄およびイミダゾールのバッファーで溶出させた 3t3-l1 細胞を安定に発現するソーティリン myc/彼 (S)。Myc fll Glut4 (10 ng) 参照として最初の車線に読み込まれました。
図 2.PH 8 で pH 6 Myc fll GLUT4 とソーティリン myc/彼対話します。Myc fll Glut4 は pH 6 で pH 8、洗浄し、グリシンのサンプル バッファーで溶出ビーズに固定化した材料で孵化します。図は、 et al3パン X. から適応されています。
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Discussion
ソーティリンは両方のシグナル伝達の細胞膜と細胞内の並べ替えイベント6,7に関連する進化的保存されている複数のリガンド蛋白質受容体です。ただし、本格的なソーティリン配位子 (一部が内腔や不可欠な膜蛋白質) の検索は、その結合パートナーのいくつかとソーティリンの相互作用が洗剤に敏感であるように複雑です。したがって、簡単および蛋白質蛋白質の相互作用を研究するための広範なアプローチ co-免疫沈降を容易に適用できません。いくつかの研究グループは、ソーティリンとその潜在的な配位子8,9の間の対話を示す co 免疫沈降を使用しています。しかし、これらの実験実施されている 0.1% のいずれかトリトンまたは 0.6% チャップス膜可溶化の完成度に疑問をキャスト。
他の研究者は、表面プラズモン共鳴10、11ソーティリンとそのリガンドの相互作用を調査しました。表面プラズモン共鳴は間違いなく問題に最適な方法が、高価な機器、高価な時間のかかるである純粋な組換え蛋白質のかなりの量が必要です。
ここでは、架橋、酵母 2 ハイブリッド系など、他の方法との組み合わせで、そのソーティリンは、GLUT4 にバインドすることは強くお勧めする手法について述べる。アッセイでは他のタンパク質やペプチドのさまざまなサイズに容易に合わせることがあり、高速かつ簡単。
この試金のいくつかの重要な手順があります。最初の 1 つは、ペプチドの水に対する溶解度です。もうひとつは、適切なコントロールの選択項目です。明らかに、生物材料のかなりの量は、コバルト ビーズを介して内因性の彼に達するシーケンスまたは非具体的に操作できます。したがって、WT 細胞ビーズ lysates の固定化が不可欠だし、我々 の場合の興味の蛋白質発現する細胞ソーティリン myc/彼。のみ 1 つの蛋白質のような実験デザイン、ビーズにバインドされている材料が異なるソーティリン、myc/彼のコントロール ビーズにペプチドの背景結合性を許容できるように。まだ、ビーズにペプチドの背景結合は最終的な洗浄ステップの金詰りを高めることによって減らすことが。ビーズを洗浄するためのミニ列の使用は、さらにバインド バック グラウンドを減らすかもしれない。
「GLUT4 経路」の性質のための pH 値でソーティリンに Myc fll GLUT4 のアドレスのバインドと考えました。初期/並べ替えの内腔で pH がわかるエンドソームが 6 を下回ることができます。ただし、6 より低い pH はメソッドの制限と思われるコバルト ビーズに彼の付けられた蛋白質の結合を混乱させます。
彼を用いたコバルト ビーズにおける標的蛋白質の分離エピトープは利回りと非特異的結合の特異抗体で免疫沈降などの他のアフィニティ精製ステップすることが望ましい。まだ、それは完全に可能なその他の樹脂上のターゲット蛋白質の分離を (好ましくは、磁気ビーズ) 適切なコントロールが成功した証明します。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、DK52057 と K.V.K. X.P に NIH から DK107498 は、NIH からの研修制度の助成金 2T32DK007201 によって支えられた研究補助金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8849 | for use in purification of histidine tag protein |
| Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-040-CV | PBS |
| 1mL Insulin Syringe U-100 | BD | 329652 | 26G x 1/2 |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23228 | |
| Wash buffer | Boston BioProducts | BP-234 | For His-tag protein purification |
| HisPur Cobalt Resin | Thermo Scientific | 89964 | |
| Tricine sample Buffer | Bio-Rad | 161-0739 | with SDS, bMercaptaethanol should be added |
| Elution Buffer | Boston BioProducts | BP-236 | For His-tag protein purificationwith 250mM Imidazole |
| Mini-Protean Tris-Tricine precast gels 10-20% | Bio-Rad | 456-3115 | For seperation of peptide and small protein |
| Tris/Tricine/SDS running buffer | Bio-Rad | 161-0744 | |
| Transfer Buffer | Boston BioProducts | BP-190 | Add 20% methanol |
| Nitrocellulose membrane 0.45 mm | Bio-Rad | 1620115 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | BSA |
| Anti Myc antibody | Cell Signaling | 2272 | Rabbit |
| Peptide | Genscipt | customize ordering | |
| Precision Plus Protein Dual color Standarts | BioRad | 161-0374 |
References
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