Summary
Les auteurs décrivent un protocole pour la détection de détergent sensible des interactions entre les protéines de la membrane à l’aide de liaison du récepteur tri, SORTILINE, pour la première boucle luminale de la protéine de transport du glucose, GLUT4, à titre d’exemple.
Abstract
Notre capacité d’explorer les interactions protéine-protéine est la clé pour comprendre la réglementation connexions dans la cellule. Cependant, détection d’interactions protéine-protéine dans bien des cas est associée à des défis importants expérimentales. En particulier, les récepteurs tris interagissent avec leur cargaison de protéines dans la lumière des compartiments membranaires souvent de façon sensible à détergent, ce qui rend inutilisable le co-immunoprécipitation de ces protéines. La liaison de la SORTILINE récepteur tri au transporteur du glucose que GLUT4 peut servir d’exemple de luminal de faibles interactions entre les protéines membranaires. Nous décrivons ici un essai rapide, simple et peu coûteux pour valider l’interaction entre SORTILINE et GLUT4. Pour cela, nous avons conçu et synthétisé chimiquement le peptide myc-le tag correspondant à l’épitope SORTILINE liaison potentielle dans la partie luminale de GLUT4. SORTILINE Taggé six histidines a été exprimé dans les cellules de mammifères et isolé de lysats de cellules à l’aide de perles de Cobalt. SORTILINE immobilisé sur les perles est incubée avec la solution de peptide à différentes valeurs de pH, et la substance éluée a été analysée par Western Blot. Ce dosage peut être facilement adapté pour étudier d’autres interactions de protéine-protéine de détergent-sensible.
Introduction
GLUT4 est une protéine de transport du glucose qui est exprimée principalement dans les cellules de graisse et le muscle squelettique où il intervient dans l’effet de l’insuline sur post-prandiale sang glucose dégagement1. Une protéine très stable, GLUT4 est réglementée au niveau post-traductionnelle. En l’absence d’insuline, GLUT4 est largement exclus de la membrane plasmique (donc faible perméabilité basale pour le glucose) et est localisée principalement à l’intérieur de la cellule en petites vésicules insulino-sensible (IRVs) et le réseau trans-Golgi (TGN) qui est susceptible de représenter le compartiment donneur IRV. Après l’administration d’insuline, les IRVs fusionnent avec la membrane plasmique et livrer GLUT4 sur le site de son fonctionnement. Cela augmente la perméabilité de la membrane plasmique pour le glucose, alors que l’absorption du glucose du sang dans les adipocytes et les myocytes squelettiques augmente de 10 à 40 fois. Après le retrait de l’insuline, GLUT4 est internalisée dans les endosomes précoces/tri et puis Récupérée à TGN où les IRVs sont reformés. Les deux tri étapes dans la voie de GLUT4, c'est-à-dire la récupération depuis le périphérique endosomes précoces à le périnucléaire TGN et la formation des IRVs sur le donateur TGN membranes sont activées par le membre de la famille Vps10p, SORTILINE, qui représente un type j’ai protéine transmembranaire et un récepteur de tri. Selon un même modèle, SORTILINE fonctionne comme une protéine transmembranaire échafaud : il lie GLUT4 dans la lumière des endosomes et TGN et recrute des adaptateurs retromer ou clathrine du côté cytoplasmique de la membrane de donneur le via son extrémité C-terminale2, 3. ce qui facilite la distribution de GLUT4 dans les transporteurs vésiculaires qui translocation GLUT4 entre les compartiments intracellulaires.
L’interaction de la queue cytoplasmique de SORTILINE avec retromer et diverses protéines adaptateur a été bien documentée. Toutefois, la liaison de la SORTILINE à GLUT4 (et à plusieurs de ses autres ligands de protéine) a été difficile à prouver. En particulier, tente de co-immunoprécipitation SORTILINE et GLUT4 n’ont pas été réussie, probablement en raison de la nature de détergent sensible de l’interaction entre ces deux protéines. En outre, comme une protéine de transport typique, GLUT4 a 12 domaines transmembranaires et 6 boucles luminales toute combinaison qui peut représenter un site de liaison SORTILINE. Dans le même temps, un grand nombre de preuves indirectes, comme la co-localisation substantielle dans la cellule, réticulation avec DSP membrane perméable et l’interaction de deux système hybride de levure suggèrent que SORTILINE peut lier à GLUT4. En outre, en utilisant l’approche de ce dernier dans une combinaison avec l’alanine mutagénèse d’analyse, nous avons précédemment déterminé que le domaine Vps10p de SORTILINE lie principalement à la première boucle luminale de GLUT4. Toutefois, la preuve d’une telle interaction dans les cellules de mammifères est porté disparue. Ici, nous avons isolé la SORTILINE His-tag de cellules transfectées 3 t 3-L1 à l’aide de résine de cobalt et démontré qu’il peut interagir avec le peptide synthétisé chimiquement correspondant à la première boucle luminale de GLUT4 à pH 6 et 8 qui ressemblent à un milieu acide dans le endosomale lumen et environnement neutre dans la lumière des membranes TGN. Aucune liaison peptide a été détecté dans des expériences de contrôle où les extraits préparés à partir de cellules non transfectées a été chargé sur les billes de mêmes.
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Protocol
1. manipulation du Peptide
- Conception et commande du peptide
- Choisir la séquence souhaitée du peptide et ajouter une balise, telle que de l’épitope myc (EQKLISEED) à ses deux N - ou extrémité C-terminale.
- Vérifier la solubilité prévue du peptide dans l’eau, à l’aide de peptide solubilité calculatrice http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php. Si la solubilité est faible, essayez d’ajouter une autre balise hydrosoluble pour modifier l’équilibre des charges.
NOTE : Nous avons utilisé le peptide correspondant à la première boucle luminale (fll) de GLUT4 taggés l’épitope myc (caractères gras) à l’extrémité N terminale (Myc-fll-GLUT4) : LNAPQKVIEQSYNATWLGRQGPGGPSSIPPGTLTTLWA de EQKLISEEDqui a « bonne » prédite solubilité dans l’eau . - Commander le peptide personnalisé au moins 75 % pureté qui est suffisant pour le dosage et demande le fournisseur de test de solubilité. Séparer l’ordre dans au moins deux parties aliquotes en cas de problèmes imprévus avec dissolvant le peptide.
NOTE : Myc-fll-GLUT4 a été ordonnée en deux parties aliquotes. Sa solubilité dans l’eau ultrapure est ≤ 10 mg/mL.
- Dissoudre le peptide
Remarque : L’eau Ultrapure est le meilleur solvant. Si le peptide ne semble pas être soluble dans l’eau, veuillez consulter http://www.genscript.com/peptide_solubility_and_stablity.html pour obtenir des instructions.- Préparer 100 x solution de travail du peptide en eau ultrapure ou dans un tampon de choix, avec la concentration de 100 μg/mL.
- Séparer la solution en 50-100 µL d’extraits et les stocker à-20 ° C.
2. manipulation de cellules
- Culture cellulaire
- Utiliser les cellules de type sauvage (WT) comme témoin négatif et les cellules exprimant la protéine cible le tag six histidines (PSIS).
NOTE : Nous avons utilisé 3 t 3 L1 pré-adipocytes stablement transfectés avec SORTILINE-myc/His5. - Cultiver les cellules en sucre élevée Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco, additionné de 10 % de sérum de boeuf veau, glutamine (2 mM) et la pénicilline/streptomycine (5 μg/mL) à 37 ° C, 10 % CO2.
- S’asseoir quatre plats de 10 cm de cellules, deux d'entre eux avec PSIS transfecter et transfecter les deux autres avec plasmide contrôle (WT). 48 h après la transfection, les cellules devraient atteindre 80-90 % confluence.
- Utiliser les cellules de type sauvage (WT) comme témoin négatif et les cellules exprimant la protéine cible le tag six histidines (PSIS).
- Préparation des lysats cellulaires
- Préparer le tampon de lyse (10 mM Hepes, 30 mM NaCl, 5 % de glycérol, 10 mM Imidazole, 0,5 % Triton X-100 et protéase inhibiteur cocktail sans EDTA pour l’isolement des protéines His-étiquetées, pH 7,4) et le conserver à 4 ° c :
- Laver les cellules trois fois avec 10 mL de 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 4 ° C.
- Mettre les plats sur la glace et ajouter 500 µL de tampon de lyse à chaque plat. Récolter les lysats de cellules à l’aide d’un grattoir de cellules.
- Place le lysat cellulaire de chaque plat dans un tube de différents 1,5 mL. Identifier les tubes comme WT-pH6, WT-pH8, HisP-pH6 HisP-pH8.
- Traverser les lysats cellulaires une seringue avec une aiguille 26G cinq fois monte et descend à la lyse complète.
- Centrifuger les lysats cellulaires à 16 000 x g pendant 10 min à 4 ° C.
- Transférer les surnageants dans de nouveaux tubes étiquetés de manière identique.
- Analyser la concentration de protéines en utilisant le Kit de dosage de protéines BCA ou autre kit.
- À l’aide du tampon de lyse, égaliser la concentration en protéines de quatre lysats tous.
- Séparer une aliquote de petit (env. 20 µL) de chaque lysat et le conserver à-20 ° C pour des expériences de contrôle possibles et/ou dépannage.
3. liaison des protéines son marqués aux talons HisPur Cobalt
- Utiliser le tampon de lavage disponible dans le commerce ou préparer (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 300 mM NaCl, imidazole de 20 mM, pH 8) et le conserver à 4 ° C.
- Préparer le lavage tampon à pH 6 de gloussement lavage tampon pH 8 avec HCl. donjon il à 4 ° C.
- Doucement agiter la bouteille les billes de cobalt pour produire une suspension homogène.
- Diluer 40 µL de la suspension de perles de Cobalt dans quatre tubes de 1,5 mL marquées comme indiqué ci-dessus (étape 2.2.4).
- Ajouter 1 mL de tampon de lyse dans chaque tube, centrifuger les tubes à 1000 x g pendant 5 s. aspirer le surnageant et ajouter 40 μL de tampon de lyse à perles sédentarisés.
- Ajouter les lysats cellulaires à tubes correspondants.
- Incuber les tubes pendant 90 min à 4 ° C sur un agitateur de tube à 20 tr/min.
- Centrifuger les tubes à 1000 x g pendant 5 s et de recueillir le liquide surnageant. Garder le surnageant à 4 ° C.
- Ajouter 500 µL de tampon de lavage pH 6 ou pH 8 à tubes correspondants et remettre en suspension les perles doucement.
- Centrifuger les tubes à 1000 x g pendant 5 s et jeter le surnageant.
- Répétez les étapes, 3.9 et 3.10 pour quatre fois.
4. la liaison du Peptide à la protéine sa-le tag immobilisée sur les perles
- À l’aide de la solution de travail de 100 x du peptide (étape 1.2.1), préparer 1 x solutions de travail à pH 6 ou tampon de lavage pH 8 (deux 100 µL d’extraits pour chacun, 1 µg/mL).
- Ajouter 100 μL de la solution de peptide 1 x aux talons lavés avec le pH correspondant.
- Incuber les perles pour 30 min à 4 ° C sur un agitateur de tube à 20 tr/min.
- Centrifuger les tubes à 1 000 x g pendant 5 s, recueillir le surnageant et le conserver à-20 ° C.
- Répétez les étapes, 3.9 et 3.10 pour quatre fois.
Remarque : Afin de diminuer le fond possible, les étapes suivantes pourraient remplacer les étapes 4.4 et 4.5. - Prendre quatre colonnes micro avec 30 μm pores, étiquetez-les comme au point 2.2.4 et placer les colonnes dans les tubes de prélèvement.
- Après l’étape 4.3, transvaser le milieu d’incubation dans les colonnes, laisser la solution passer par gravité. Maintenir le flux à travers à-20 ° C.
- Passer 500 µL de tampon de lavage avec pH 6 ou pH 8 par colonnes correspondantes par gravité. Jeter le débit à travers.
- Répétez l’étape 4.8 quatre fois.
- Après le dernier lavage, centrifuger les colonnes à 1 000 x g pendant 15 s.
5. l’élution des billes de Cobalt
- Utilisation commerciale Tricine solution tampon (200 mM Tris-HCl, 40 % de glycérol, 2 % SDS, 0,04 % bleu de Coomassie, pH 6,8) et β-mercaptoéthanol s’ajoute la concentration finale de 2 %.
- Ajouter 40 µL de tampon de Tricine (avec β-mercaptoéthanol) aux perles lavées et vortex l’échantillon.
- Chauffer les échantillons pendant 10 min à 100 ° C, vortex les échantillons à nouveau et centrifuger les tubes à 1 000 x g pendant 5 s.
Remarque : Afin de réduire les liaisons non spécifiques possibles dans l’élution, les étapes suivantes pourraient remplacer les étapes 5.1-5.3. - Ajouter 40 μL de tampon d’élution Imidazole (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 300 mM NaCl, imidazole 0,25 M) à la lavé perles, vortex et incuber les tubes à température ambiante pendant 20 min.
- Centrifuger les tubes à 3 000 x g pendant 30 s, recueillir le surnageant (éluées échantillons) et la transférer dans de nouveaux tubes étiquetés.
- Ajouter 40 μL de tampon de Tricine dans chaque tube, chauffer les échantillons pendant 10 min à 100 ° C, vortex et centrifuger les tubes à 1 000 x g pendant 5 s.
Remarque : Si micro colonnes sont utilisées, ajouter de la mémoire tampon d’élution aux talons lavés, incuber pendant 20 min et recueillir l’élution par centrifugation à 8 000 x g pendant 2 min.
Remarque : Les échantillons peuvent être conservés à-20 ° C jusqu'à ce que l’électrophorèse est réalisée.
6. électrophorèse et Western Blot
Remarque : Les échantillons sont prêts pour la séparation par SDS-PAGE et éponger occidental ultérieur. Suivre le protocole de l’électrophorèse sur gel (https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot) avec les modifications suivantes.
- Utiliser des gels de gradient Tricine disponible dans le commerce 10 à 20 %.
- Sur le gel, charger 20 µL des échantillons éluées et 20 µL de lysats (étape 2.2.10). Pour dépannage, il est recommandé de charger 20 µL du matériel non lié (étape 3,8) et 10 ng du peptide ; avant le chargement, ajouter une quantité égale de tampon de Tricine à ces échantillons.
- Réaliser l’électrophorèse Tris/Tricine/SDS commercial tampon (100 mM Tris, 100 mM Tricine, SDS 0,1 %, pH et 8.3).
- Transfert du matériel depuis le gel sur une membrane de nitrocellulose de 0,45 µm en utilisant le tampon de transfert (base Tris de 25 mM, glycine 192 mM, pH 8,4) additionné de 20 % de méthanol.
- Bloquer la membrane avec 3 % d’albumine sérique Bovine (BSA) pendant 1 h à température ambiante. Utilisant préalablement teinté masse moléculaire marqueurs comme guides, couper la membrane horizontalement, épongez la partie supérieure avec un anticorps contre PSIS et épongez la partie inférieure avec un anticorps dirigé contre l’épitope myc pour identifier le peptide myc-tag.
Remarque : Dans notre cas particulier, découpe de la membrane n’est pas nécessaire puisque les PSIS et Myc-fll-GLUT4 peuvent être détectés avec un anticorps anti-myc.
7. analyse des résultats
- Quantifier l’intensité de tous les signaux de Western blot, en utilisant un programme Image Station ou ImageJ.
- Normaliser le signal provenant du peptide myc-tag contre le signal provenant du PSIS à deux valeurs de pH.
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Representative Results
Lysats ont été préparés à partir de 3 t 3 L1 cellules transfectées stablement avec SORTILINE-myc/His5 et à partir des cellules WT 3 t 3 L1, utilisés comme contrôle négatif. Les deux lysats ont été incubées avec des perles de cobalt à pH 6 ou pH 8 et lavés. Perles avec les protéines immobilisées sont ensuite incubées dans la solution de Myc-fll-Glut4. Après lavages prudents, protéines liées aux talons sont élués avec 0,25 M Imidazole. Les échantillons ont été soumis, ainsi que les lysats originales, SDS-page dans un Tricine de 10 à 20 %, gel en gradient suivie d’éponger occidental avec les anticorps anti-Myc permettant la détection des deux SORTILINE-myc/His (110 kD) et Myc-fll-GLUT4 (5 kD) (Figure 1) .
Myc-fll-GLUT4 (10 ng) a été chargé sur la première voie du gel comme référence. Comme la pureté du peptide n’est que de 75 %, des contaminations sont apparentes (bandes supérieures). Des lysats de cellules originales de WT et les cellules exprimant SORTILINE-myc/His contiennent des bandes multiples, reconnus par l’anticorps anti-myc. Matériel isolé de cellules exprimant SORTILINE-myc/His est beaucoup plus propre. En plus de quelques bandes mineures de non spécifique, il a seulement deux composantes myc : SORTILINE-myc/His et Myc-fll-GLUT4. Peptides contaminantes dans la première voie ne semblent pas se lier à la SORTILINE-myc/His. Contrôle négatif (éluat WT) a bandes principalement non spécifiques.
GLUT4 traverse des compartiments intracellulaires, comme les endosomes et TGN, disposant de différents pH luminal, nous avons voulu évaluer l’interaction du GLUT4 avec SORTILINE à pH 6 et 8 (Figure 2). La densitométrie des résultats (non illustré) n’a pas révélé des différences significatives dans le ratio entre Myc-fll-GLUT4 et SORTILINE-myc/His accumulée sur les perles à différents pH. Nous concluons donc que GLUT4 possède la capacité d’interagir avec la SORTILINE dans les endosomes et TGN.
Figure 1 . Interaction SORTILINE-myc/his avec Myc-fll-GLUT4 sur perles cobalt. Lysats préparés à partir de cellules 3 t 3-L1 WT et cellules 3 t 3-L1 exprimant de manière stable SORTILINE-myc/His (S) ont été passés au-dessus des perles de cobalt, lavés, incubés avec Myc-fll-Glut4 à pH 8, lavés à nouveau et éluée avec tampon Imidazole. Myc-fll-Glut4 (10 ng) a été chargé sur la première voie comme une référence.
Figure 2 . SORTILINE-myc/His interagit avec Myc-fll-GLUT4 à pH 8 et à pH 6. Myc-fll-Glut4 est incubé avec matériel immobilisé sur les perles à pH 6 et 8, lavés et éluée avec tampon Glycine. La figure a été adaptée de Pan X., et al.3.
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Discussion
SORTILINE est un récepteur évolutionnaire protéine conservée de multi-ligand qui est impliqué dans les deux la signalisation à la membrane plasmique et intracellulaire tri événements6,7. Cependant, la recherche de ligands de la SORTILINE authentique (dont certains sont des protéines de la membrane luminale ou intégrale) est compliquée comme l’interaction de la SORTILINE avec certains de ses partenaires de liaison semble être sensible aux détergents. Par conséquent, une simple et une approche généralisée pour l’étude des interactions protéine-protéine, co-immunoprécipitation, ne peut pas s’appliquer facilement. Certains groupes de chercheurs ont utilisé des co-immunoprécipitation de démontrer l’interaction entre SORTILINE et son potentiel ligands8,9. Toutefois, ces expériences ont été menées soit dans 0,1 % Triton ou en CHAPS de 0,6 % qui jette des doutes dans l’intégralité de la solubilisation de la membrane.
Autres chercheurs ont étudié l’interaction entre SORTILINE et ses ligands par résonance de plasmons de surface10,11. Bien que la résonance plasmonique de surface est sans doute la meilleure approche du problème, il faut des équipements coûteux et des quantités importantes de pures protéines recombinantes qui est coûteux et prend du temps.
Nous décrivons ici une technique qui, en combinaison avec d’autres méthodes, telles que la réticulation et le système hybride à deux de levure, suggèrent fortement que SORTILINE peut lier à GLUT4. Le test est rapide et facile et peut être facilement adapté aux autres différentes tailles de peptides et protéines.
Il y a quelques étapes cruciales dans ce test. Le premier est sa solubilité du peptide dans l’eau. Un autre est la sélection du contrôle approprié. De toute évidence, une quantité importante de la matière biologique peut interagir avec cobalt perles via sa portée endogène des séquences ou non spécifique. Par conséquent, il est indispensable d’immobiliser sur les perles de lysats de cellules WT et cellules transfectées par la protéine d’intérêt, dans notre cas SORTILINE-myc/His. Dans un tel dispositif expérimental, matériel lié aux talons différera dans une seule protéine, SORTILINE-myc/His, afin qu’un certain degré de liaison de contexte du peptide aux billes de contrôle peut être toléré. Pourtant, la liaison de contexte du peptide aux talons peut être réduite en augmentant la rigueur de la procédure de lavage final. L’utilisation des colonnes minis pour les perles de lavage peut diminuer le fond lie encore plus loin.
En raison de la nature de la « voie de GLUT4 », nous avons voulu adresse contraignant de Myc-fll-GLUT4 à SORTILINE à différents pH. Nous nous rendons compte que le pH dans la lumière de début/tri endosomes peut tomber en dessous de 6. Cependant, pH inférieur à 6 perturbe la liaison des protéines His-étiquetées à billes de cobalt, qui peuvent être considérés comme une limitation de la méthode.
Isolement de la protéine cible sur des billes de cobalt à l’aide de son épitope est préférable aux autres étapes de purification d’affinité, comme immunoprécipitation avec des anticorps spécifiques, en termes de rendement et non-spécifiques. Pourtant, c’est tout à fait possible l’isolement de la protéine cible sur n’importe quel autre résine (de préférence, billes magnétiques) avec des contrôles appropriés s’avérera fructueuse.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions de recherche DK52057 et DK107498 du NIH à K.V.K. X.P a été pris en charge par la 2T32DK007201 de subvention formation institutionnelle du NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8849 | for use in purification of histidine tag protein |
| Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-040-CV | PBS |
| 1mL Insulin Syringe U-100 | BD | 329652 | 26G x 1/2 |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23228 | |
| Wash buffer | Boston BioProducts | BP-234 | For His-tag protein purification |
| HisPur Cobalt Resin | Thermo Scientific | 89964 | |
| Tricine sample Buffer | Bio-Rad | 161-0739 | with SDS, bMercaptaethanol should be added |
| Elution Buffer | Boston BioProducts | BP-236 | For His-tag protein purificationwith 250mM Imidazole |
| Mini-Protean Tris-Tricine precast gels 10-20% | Bio-Rad | 456-3115 | For seperation of peptide and small protein |
| Tris/Tricine/SDS running buffer | Bio-Rad | 161-0744 | |
| Transfer Buffer | Boston BioProducts | BP-190 | Add 20% methanol |
| Nitrocellulose membrane 0.45 mm | Bio-Rad | 1620115 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | BSA |
| Anti Myc antibody | Cell Signaling | 2272 | Rabbit |
| Peptide | Genscipt | customize ordering | |
| Precision Plus Protein Dual color Standarts | BioRad | 161-0374 |
References
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