Summary
Descriviamo un protocollo per il rilevamento di detersivo sensibili interazioni tra proteine di membrana utilizzando l'associazione del ricevitore dell'ordinamento, sortilina, per il primo ciclo di luminal della proteina del trasportatore del glucosio, GLUT4, ad esempio.
Abstract
La nostra capacità di esplorare le interazioni proteina-proteina è la chiave per comprendere collegamenti normativi nella cella. Tuttavia, rilevamento delle interazioni proteina-proteina in molti casi è associata con sfide sperimentali significative. In particolare, smistamento recettori interagiscono con il loro carico di proteine nel lume dei compartimenti di membrana spesso in maniera sensibile detergente, rendendo inutilizzabile la co-immunoprecipitazione di queste proteine. Associazione dell'ordinamento sortilina recettore al trasportatore di glucosio che GLUT4 può servire come un esempio di Luminale deboli interazioni tra proteine di membrana. Qui, descriviamo un test veloce, semplice e poco costoso per convalidare l'interazione tra sortilina e GLUT4. Per questo, abbiamo progettato e sintetizzato chimicamente il peptide myc-tagged corrispondente per l'epitopo sortilina-associazione potenziale nella parte luminale di GLUT4. Sortilina taggato con sei istidine è stato espresso in cellule di mammifero e isolato da lisati cellulari usando le perle di cobalto. Sortilina immobilizzata sulle perle è stato incubato con la soluzione del peptide a valori di pH diversi, e il materiale è stato analizzato mediante Western blotting. Questo test può essere facilmente adattato per studiare altre interazioni proteine sensibili al detersivo.
Introduction
GLUT4 è una proteina del trasportatore del glucosio che si esprime principalmente in cellule di grasso e muscolo scheletrico dove media l'effetto dell'insulina, il glucosio post-prandiale sangue liquidazione1. Essendo una proteina molto stabile, GLUT4 è regolamentata a livello post-traduzionale. In assenza di insulina, GLUT4 è in gran parte esclusi dalla membrana plasmatica (quindi bassa permeabilità basale per glucosio) ed è localizzata principalmente all'interno della cellula in piccole vescicole insulina-sensible a reagire (IRVs) e trans-Golgi network (TGN) che rischia di rappresentare il vano di donatore IRV. Somministrazione di insulina, il IRVs si fondono con la membrana plasmatica e consegnare GLUT4 al sito del suo funzionamento. Questo aumenta la permeabilità della membrana del plasma per il glucosio, in modo che l'assorbimento di glucosio dal sangue in adipociti e miociti scheletrici aumenta 10 a 40 volte. Dopo il ritiro di insulina, GLUT4 è interiorizzato in endosomi precoce/ordinamento e quindi estratto a TGN dove il IRVs sono ri-formata. Sia l'ordinamento passi nel pathway di GLUT4, cioè recupero dall'endosomi precoce periferici ad perinucleare TGN e la formazione del IRVs sul donatore TGN membrane sono abilitate per il membro della famiglia Vps10p, sortilina, che rappresenta un tipo la proteina del transmembrane e un recettore ordinamento. Secondo un modello, sortilina funziona come una proteina transmembrana impalcatura: si lega GLUT4 in lumen del endosomi e TGN e reclute retromer o clatrina adattatori al lato citoplasmico del donatore membrana tramite suo C-terminus2, 3. questo facilita la distribuzione di GLUT4 in vettori vescicolari che traslocano GLUT4 tra compartimenti intracellulari.
L'interazione della coda citoplasmatica di sortilina con retromer e varie proteine adattatrici è stata ben documentata. Tuttavia, l'associazione di sortilina per GLUT4 (e molti dei suoi altri ligandi di proteina) è stato impegnativo per dimostrare. In particolare, i tentativi di co-immunoprecipitate sortilina e GLUT4 non hanno avuto successo probabilmente a causa della natura sensibile detergente dell'interazione tra queste due proteine. Inoltre, come una proteina di trasporto tipico, GLUT4 ha 12 domini transmembrane e 6 anelli di luminal qualsiasi combinazione di cui potenzialmente può rappresentare un luogo sortilina-legante. Allo stesso tempo, un grande corpo di prova indiretta, ad esempio la sostanziale co-localizzazione nella cella, cross-linking con membrana permeabile DSP e l'interazione in due sistema ibrido del lievito suggeriscono che sortilina può associare a GLUT4. Inoltre, utilizzando l'approccio di quest'ultimo in combinazione con l'alanina scansione mutagenesi, precedentemente abbiamo determinato che il dominio di Vps10p di sortilina lega principalmente per il primo ciclo di luminal di GLUT4. Tuttavia, la prova di tale interazione in cellule di mammifero è scomparso. Qui, abbiamo isolato sortilina His-tag da cellule trasfettate 3T3-L1 con la resina cobalto e ha dimostrato che può interagire con peptide sintetizzato chimicamente corrispondente per il primo ciclo di luminal di GLUT4 pH 6 e pH 8 simile milieu acide nella endosomal lumen e ambiente neutro nel lume delle membrane TGN. Nessuna associazione di peptide è stata rilevata in esperimenti di controllo cui estratto preparato da cellule trasfettate con non è stato caricato sui branelli stessi.
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Protocol
1. movimentazione del Peptide
- Progettazione e ordinazione del peptide
- Scegliere la sequenza desiderata del peptide e aggiungere un tag, ad esempio myc epitopo (EQKLISEED) presso suo entrambi N - o C-terminus.
- Controllare la solubilità prevista del peptide in acqua, usando peptide solubilità calcolatrice http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php. Se la solubilità è basso, provare ad aggiungere un altro tag solubile in acqua per cambiare il bilanciamento di carica.
Nota: Abbiamo usato il peptide corrispondente al primo ciclo luminal (fll) di GLUT4 taggati con l'epitopo di myc (grassetto) al capolinea N (Myc-fll-GLUT4): LNAPQKVIEQSYNATWLGRQGPGGPSSIPPGTLTTLWA di EQKLISEEDche ha predetto "buona" solubilità in acqua . - Ordinare il peptide personalizzato con almeno 75% purezza che è sufficiente per il dosaggio e chieda al provider per test di solubilità. Separare l'ordine in almeno due aliquote in caso di problemi imprevisti con il peptide di dissoluzione.
Nota: Myc-fll-GLUT4 è stato ordinato in due aliquote. La relativa solubilità segnalata in acqua ultrapura è ≤ 10 mg/mL.
- Il peptide di dissoluzione
Nota: Acqua ultrapura è il solvente migliore. Se il peptide non sembra essere solubile in acqua, fare riferimento a http://www.genscript.com/peptide_solubility_and_stablity.html per le istruzioni.- Preparare la soluzione di lavoro del peptide in acqua ultrapura o nel buffer della scelta, con la concentrazione di 100 µ g/mL: 100x.
- Separare la soluzione in aliquote di 50-100 µ l e conservarli a-20 ° C.
2. il trattamento delle cellule
- Coltura cellulare
- Utilizzare cellule Wild type (WT) come controllo negativo e le cellule che esprimono la proteina dell'obiettivo con sei istidine (HisP) etichetta.
Nota: Abbiamo usato 3T3 L1 pre-adipociti trasfettate stabilmente con sortilina-myc/His5. - Crescere le cellule in per volta Eagle Medium (DMEM) alta zucchero di Dulbecco, completati con 10% siero bovino vitello, glutamina (2 mM) e penicillina/streptomicina (5 μg/mL) a 37 ° C in 10% CO2.
- Sedersi quattro piatti di 10cm di cellule, due di loro con HisP transfect e transfect gli altri due con il plasmide di controllo (WT). 48 ore dopo la trasfezione, le cellule dovrebbero raggiungere confluency di 80-90%.
- Utilizzare cellule Wild type (WT) come controllo negativo e le cellule che esprimono la proteina dell'obiettivo con sei istidine (HisP) etichetta.
- Preparazione dei lisati cellulari
- Preparare il tampone di lisi (10 mM Hepes, 30 mM NaCl, 5% glicerolo, 10 mM imidazolo, 0,5% Triton X-100 e proteasi inibitore cocktail senza EDTA per l'isolamento di His-Tag proteine, pH 7.4) e tenerlo a 4 ° c:
- Lavare le cellule tre volte con 10 mL di 1x tampone fosfato salino (PBS) a 4 ° C.
- Mettere i piatti sul ghiaccio e aggiungere 500 µ l di tampone di lisi per ogni piatto. Raccogliere i lisati cellulari utilizzando un raschietto di cella.
- Posto il lysate delle cellule da ogni piatto in una provetta diverse 1,5 mL. Etichettare le provette come WT-pH6, WT-pH8, HisP-pH6 HisP-pH8.
- Passare i lisati cellulari attraverso una siringa con un ago da 26G cinque volte su e giù, a lisi completa.
- Centrifugare i lisati cellulari a 16.000 x g per 10 min a 4 ° C.
- Trasferire i surnatanti in nuove provette identicamente etichettati.
- Analizzare la concentrazione nella proteina utilizzando il Kit di dosaggio della proteina BCA o altri kit.
- Utilizzando un buffer di Lisi, equalizzare la concentrazione nella proteina di tutti e quattro i lysates.
- Separare un'aliquota di piccolo (ca. 20 µ l) di ciascun lisato e tenerlo a-20 ° C per possibili esperimenti di controllo e/o risoluzione dei problemi.
3. legame delle proteine His-tag per le perle di cobalto HisPur
- Utilizzare il tampone di lavaggio disponibili in commercio o preparare uno (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 300 mM NaCl, imidazolo di 20 mM, pH 8) e tenerlo a 4 ° C.
- Prepari la lavata tampone con pH 6 di sorrisi lavaggio tampone a pH 8 con HCl. Keep esso a 4 ° C.
- Agitare delicatamente la bottiglia delle perline di cobalto per rendere la sospensione omogenea.
- Dispensare 40 µ l della sospensione di perline di cobalto nelle quattro provette da 1,5 mL contrassegnate come sopra (punto 2.2.4).
- Aggiungere 1 mL di tampone di lisi per ogni tubo, centrifugare le provette a 1000 x g per 5 s. aspirare il supernatante e aggiungere 40 µ l di tampone di lisi per perline depositati.
- Aggiungere i lisati cellulari provette corrispondenti.
- Incubare le provette per 90 min a 4 ° C su un rotatore tubo 20 giri/min.
- Centrifugare le provette a 1000 x g per 5 s e raccogliere il surnatante. Conservare il supernatante a 4 ° C.
- Aggiungere 500 µ l di tampone di lavaggio di pH 6 o pH 8 corrispondenti provette e Risospendere delicatamente le perline.
- Centrifugare le provette a 1000 x g per 5 s e scartare i sovranatante.
- Ripetere i passaggi da 3.9 e 3.10 per quattro volte.
4. associazione del Peptide alla proteina His-Tag immobilizzato le perline
- Utilizzando la soluzione di lavoro x 100 del peptide (punto 1.2.1), preparare 1 x lavoro soluzioni a pH 6 o tampone pH 8 (aliquote di due 100 µ l per ciascuno, 1 µ g/mL).
- Aggiungere 100 μL di soluzione 1x peptide ai talloni lavati con il pH corrispondente.
- Incubare le perline per 30 min a 4 ° C su un rotatore tubo 20 giri/min.
- Centrifugare le provette a 1.000 x g per 5 s, raccogliere il surnatante e tenerlo a-20 ° C.
- Ripetere i passaggi da 3.9 e 3.10 per quattro volte.
Nota: Al fine di ridurre possibile priorità bassa, la seguente procedura potrebbe sostituire punti 4.4 e 4.5. - Prendere quattro colonne micro con 30 μm pori, etichettarli come descritto al punto 2.2.4 e posizionare le colonne in provette per la raccolta.
- Dopo il completamento della fase 4.3, trasferire la miscela di incubazione nelle colonne, lasciare che la soluzione di passare attraverso per gravità. Mantenere il flusso attraverso la a-20 ° C.
- Passare 500 µ l di tampone di lavaggio con pH 6 o pH 8 attraverso colonne corrispondenti per gravità. Scartare il flusso attraverso.
- Ripetere il punto 4.8 quattro volte.
- Dopo l'ultimo lavaggio, centrifugare le colonne a 1.000 x g per 15 s.
5. eluizione da perle di cobalto
- Tampone di uso commerciale Tricine campione (200 mM Tris-HCl, 40% glicerolo, 2% SDS, 0,04% Blue di Coomassie, pH 6.8) e aggiungere il β-mercaptoetanolo alla concentrazione finale di 2%.
- Aggiungere 40 µ l di Tampone tricina (con β-mercaptoetanolo) per le perline lavati e vortexare il campione.
- Riscaldare i campioni per 10 min a 100 ° C, vortice ancora una volta, i campioni e centrifugare le provette a 1.000 x g per 5 s.
Nota: Al fine di ridurre il possibile legame non specifico nell'eluizione, la seguente procedura potrebbe sostituire passaggi 5.1-5.3. - Aggiungere 40 µ l di tampone di eluizione dell'imidazolo (50mm Na2HPO4/NaH2PO4, 300 mM NaCl, imidazolo 0,25 M) per il lavato dei branelli, vortex e incubare le provette a temperatura ambiente per 20 min.
- Centrifugare le provette a 3.000 x g per 30 s, raccogliere il surnatante (campioni eluiti) e trasferirlo in provette di nuovi.
- Aggiungere 40 μL di Tampone tricina in ogni provetta, riscaldare i campioni per 10 min a 100 ° C, vortex e centrifugare le provette a 1.000 x g per 5 s.
Nota: Se si utilizzano micro colonne, aggiungere il tampone di eluizione ai branelli lavati, incubare per 20 minuti e raccogliere l'eluizione mediante centrifugazione a 8.000 x g per 2 min.
Nota: Campioni possono essere conservati a-20 ° C fino a quando elettroforesi viene eseguita.
6. elettroforesi e Western blotting
Nota: I campioni sono pronti per la separazione mediante SDS-PAGE e successivo Western blotting. Seguire il protocollo di elettroforesi del gel (https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot) con le seguenti modifiche.
- Utilizzare commercialmente disponibile 10-20% Tricine gel gradiente.
- Sul gel, caricare 20 µ l di campioni eluiti e 20 µ l di lisati (passo 2.2.10). Per la risoluzione dei problemi, è consigliabile caricare 20 µ l di materiale non legato (punto 3.8) e 10 ng del peptide; prima del caricamento, aggiungere pari quantità di Tampone tricina a questi campioni.
- Eseguire l'elettroforesi in commerciale Tris/Tricine/SDS in esecuzione di tampone (100 mM Tris, 100mm Tricine e 0.1% SDS, pH 8.3).
- Trasferire il materiale dal gel su una membrana di nitrocellulosa da 0,45 µm mediante tampone di trasferimento (base Tris 25 mM, glicina 192 mM, pH 8,4) completati con 20% metanolo.
- Bloccare la membrana con 3% albumina di siero bovino (BSA) per 1 h a temperatura ambiente. Usando gli indicatori pre-colorato peso molecolare come guide, tagliare la membrana in senso orizzontale, macchia la parte superiore con un anticorpo contro HisP e asciugare la parte inferiore con un anticorpo contro l'epitopo di myc per identificare il peptide myc-tagged.
Nota: Nel nostro caso particolare, taglio della membrana non è necessaria poiché sia HisP e Myc-fll-GLUT4 può essere rilevata con un anticorpo anti--myc.
7. analisi dei risultati
- Quantificare l'intensità di tutti i segnali di Western blot utilizzando un programma di immagine stazione o ImageJ.
- Normalizzare il segnale dal peptide myc-tagged contro il segnale da HisP a entrambi valori di pH.
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Representative Results
Lisati sono stati preparati da 3T3 L1 cellule transfettate stabile con sortilina-myc/His5 e da cellule WT 3T3 L1, usate come controllo negativo. Entrambi lisati sono stati incubati con perle di cobalto a pH 6 o pH 8 e lavate accuratamente. Perline con proteine immobilizzate sono state incubate nella soluzione di Myc-fll-Glut4. Dopo attenti lavaggi, proteine legate ai talloni sono stati eluiti con 0,25 M imidazolo. Campioni sono stati sottoposti, insieme con i lisati originali, a SDS-PAGE in una 10-20% Tricine gel di pendenza seguita mediante Western blotting con anticorpo anti--Myc che ha permesso per la rilevazione di entrambi sortilina-myc/His (110 kD) e Myc-fll-GLUT4 (5 kD) (Figura 1) .
Myc-fll-GLUT4 (10 ng) è stato caricato sulla prima corsia del gel come riferimento. Come la purezza del peptide è solo il 75%, contaminazioni sono apparente (bande alte). Lisati cellulari originale da WT sia cellule esprimenti sortilina-myc/His contengono bande multiple riconosciuti dall'anticorpo anti--myc. Materiale isolato dalle cellule che esprime sortilina-myc/His è molto più pulito. Oltre ad alcune fasce non specifiche minori, ha solo due componenti contenenti myc: sortilina-myc/His e Myc-fll-GLUT4. Contaminanti peptidi nella prima corsia non vengono visualizzati per associare a sortilina-myc/His. Controllo negativo (eluato WT) ha fasce prevalentemente non specifiche.
GLUT4 passa attraverso compartimenti intracellulari, quali gli endosomi e TGN, che hanno differenti pH luminal, abbiamo voluto valutare l'interazione di GLUT4 con sortilina a pH 6 e pH 8 (Figura 2). Densitometria di risultati (non mostrato) non ha rivelato differenze significative nel rapporto tra Myc-fll-GLUT4 e sortilina-myc/His mantenuto le perline a valori di pH diversi. Concludiamo quindi che GLUT4 ha la capacità di interagire con sortilina in endosomi e TGN.
Figura 1 . Interazione di sortilina-myc/His con Myc-fll-GLUT4 su perle di cobalto. Lisati preparato dalle cellule 3T3-L1 WT e cellule 3T3-L1 che esprimono stabilmente sortilina-myc/His (S) erano passate sopra perle di cobalto, lavate, incubate con Myc-fll-Glut4 a pH 8, lavato di nuovo e sono eluite con tampone imidazolo. Myc-fll-Glut4 (10 ng) è stato caricato sulla prima corsia come riferimento.
Figura 2 . Sortilina-myc/His interagisce con Myc-fll-GLUT4 pH 8 e a pH 6. Myc-fll-Glut4 è stato incubato con materiale immobilizzato le perline a pH 6 e pH 8, lavato e sono eluite con tampone di glicina. La figura è stata adattata da Pan X., et al.3.
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Discussion
Sortilina è un recettore di evolutiva conservata multi-ligando proteina che è coinvolta in entrambi segnalazione alla membrana del plasma e intracellulare ordinamento eventi6,7. Tuttavia, la ricerca di ligandi di sortilina autentico (alcuni dei quali sono proteine di membrana luminale o integrale) è complicata come l'interazione di sortilina con alcuni dei suoi partner di associazione sembra essere sensibili ai detersivi. Di conseguenza, un facile e un approccio diffuso per lo studio delle interazioni proteina-proteina, co-immunoprecipitazione, non possono essere facilmente applicate. Alcuni gruppi di ricerca sono utilizzati co-immunoprecipitazione per illustrare l'interazione tra sortilina e suoi potenziali ligandi8,9. Tuttavia, questi esperimenti sono stati effettuati sia in 0,1% Triton o in 0,6% CHAPS che getta dubbi nella completezza di solubilizzazione di membrana.
Altri ricercatori hanno studiato l'interazione tra sortilina ed i suoi ligandi di risonanza plasmonica di superficie10,11. Sebbene risonanza plasmonica di superficie è probabilmente l'approccio migliore al problema, richiede attrezzature costose e quantità significative di proteine ricombinanti pure che è costoso e richiede tempo.
Qui, descriviamo una tecnica che, in combinazione con altri metodi, ad esempio di cross-linking e il sistema di due ibridi di lievito, suggeriscono fortemente che sortilina può associare a GLUT4. Il test è semplice e veloce e può essere facilmente adattato ad altre diverse dimensioni di peptidi e proteine.
Ci sono pochi passaggi critici in questo test. Il primo è idrosolubilità del peptide. Un altro è la selezione di un controllo adeguato. Chiaramente, una notevole quantità di materiale biologico può interagire con cobalto perline via endogena sua raggiungere sequenze o non specifico. Pertanto, è essenziale per immobilizzare sui branelli lisati di cellule WT e le cellule transfected con la proteina di interesse, nel nostro caso sortilina-myc/His. In un tale disegno sperimentale, materiale associato ai talloni differirà in sola proteina, sortilina-myc/His, così che un certo grado di rilegatura del peptide a microsfere di controllo può essere tollerato. Ancora, la rilegatura del peptide ai talloni possa essere ridotti aumentando il rigore i passaggi di lavaggio finale. L'uso di colonne mini per lavare le perle può diminuire sfondo associazione ulteriormente.
A causa della natura del pathway"GLUT4", abbiamo voluto associazione indirizzo di Myc-fll-GLUT4 a sortilina a valori di pH diversi. Ci rendiamo conto che il pH nel lume dell'inizio/ordinamento endosomi possono cadere inferiore a 6. Tuttavia, pH inferiore a 6 interrompe il legame delle proteine His-tag ai branelli di cobalto che possono essere considerati come una limitazione del metodo.
Isolamento della proteina dell'obiettivo sui branelli di cobalto utilizzando il suo epitopo è preferibile ad altre fasi di purificazione di affinità, quali immunoprecipitazione con anticorpi specifici, in termini di resa e legame non specifico. Ancora, è completamente possibile che l'isolamento della proteina dell'obiettivo su qualsiasi altra resina (preferibilmente, biglie magnetiche) con controlli adeguati si rivelerà successo.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Quest'opera è stata sostenuta da sovvenzioni di ricerca DK52057 e DK107498 dal NIH per Carolina X.P è stata sostenuta dalla formazione istituzionale grant 2T32DK007201 da NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8849 | for use in purification of histidine tag protein |
| Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-040-CV | PBS |
| 1mL Insulin Syringe U-100 | BD | 329652 | 26G x 1/2 |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23228 | |
| Wash buffer | Boston BioProducts | BP-234 | For His-tag protein purification |
| HisPur Cobalt Resin | Thermo Scientific | 89964 | |
| Tricine sample Buffer | Bio-Rad | 161-0739 | with SDS, bMercaptaethanol should be added |
| Elution Buffer | Boston BioProducts | BP-236 | For His-tag protein purificationwith 250mM Imidazole |
| Mini-Protean Tris-Tricine precast gels 10-20% | Bio-Rad | 456-3115 | For seperation of peptide and small protein |
| Tris/Tricine/SDS running buffer | Bio-Rad | 161-0744 | |
| Transfer Buffer | Boston BioProducts | BP-190 | Add 20% methanol |
| Nitrocellulose membrane 0.45 mm | Bio-Rad | 1620115 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | BSA |
| Anti Myc antibody | Cell Signaling | 2272 | Rabbit |
| Peptide | Genscipt | customize ordering | |
| Precision Plus Protein Dual color Standarts | BioRad | 161-0374 |
References
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