Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

זיהוי של שרירי השלד תאים הלוויין על-ידי Immunofluorescence עם Pax7 ו- Laminin נוגדנים

Published: April 19, 2018 doi: 10.3791/57212
Automatic Translation
*1, *2, 1, 2, 1
1Laboratory of Muscle Stem Cells and Gene Regulation, National Institutes of Health, 2Office of Science and Technology, National Institute of Arthritis, Musculoskeletal and Skin Diseases (NIAMS), National Institutes of Health
* These authors contributed equally

Summary

זיהוי מדויק של תאים הלוויין חיוני ללמוד את הפונקציות שלהם בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים. מאמר זה מציג פרוטוקול כדי לזהות תאים הלוויין במקטעי שרירי השלד למבוגרים מאת מבוססי immunofluorescence מכתים.

Abstract

Immunofluorescence היא שיטה יעילה המסייעת לזהות סוגי תאים שונים במקטעי רקמות. ללימוד האוכלוסייה התא הרצוי, נוגדנים עבור תאים מסוים סמנים מוחלים על רקמות חלקים. בשרירי השלד למבוגרים, תאי לוויין (SCs) הם תאי גזע שתורמים שריר תיקון והתחדשות. לכן, חשוב להמחיש ולאתר האוכלוסייה בלוויין תא בתנאים פיזיולוגיים שונים. נח שרירי השלד, SCs שוכנים בין הנדן הבזליים קרום פלזמה myofiber. סימן נפוץ לזיהוי SCs את myofibers או תרבית תאים הוא החלבון לזווג תיבת Pax7. במאמר זה, פרוטוקול immunofluorescence Pax7 אופטימיזציה במקטעי שרירי השלד מוצג זה ממזער שאינם ספציפיים מכתים ורקע. עוד נוגדן מזהה חלבון (laminin) של הנדן הבזליים נוספה גם כדי לסייע בזיהוי SCs-בדומה פרוטוקולים יכול לשמש גם כדי לבצע כפולים או משולשים תיוג עם Pax7, נוגדנים חלבונים נוספים של עניין.

Introduction

שרירי השלד הוא מורכב של תאי שריר multinucleated, הנקרא myotubes, המסודרות myofibers, המניבות כוח ותנועות דרך ציר. שרירי השלד ביותר, למעט כמה שרירים ואסטתיים, נגזרות מבנה עובריים זמני בשם somite1. קודמן myogenic תאים delaminate מ somite אפיתל להפוך myoblasts. Myoblasts נוספות להבדיל לתוך השריר כי הפתיל כדי להפוך myotubes כדי ליצור myofibers רב nucleated. התהליך הנ ל נקרא myogenesis והוא מאופיין על ידי מוסדר חנותם בקרת ביטוי גנים. מבשרי myogenic אקספרס Pax3 ו- Pax7, ואילו myoblasts אקספרס אלוהים ו/או Myf5 ונייטרלים אקספרס2,myogenin ו- myosins3. השריר הוא תהליך שבו myofibers להיות גדולים יותר על ידי שילוב myonuclei יותר קיימים סיבים (היפרפלזיה) ועל ידי עלייה סיבי השריר (היפרטרופיה) בגודל4. במהלך השריר, יש מקור בר-קיימא של תאי myogenic יש מאפייני תא גזע בכך שהם יכולים להבדיל ולחדש את עצמי. תאים אלה מכונים תאי לוויין לפי מיקומם הפיזי בין הנדן הבזליים5sarcolemma (קרום התא של myofiber). SCs נמרצות לתרום לצמיחה שרירים על הבמה לנוער (2-3 השבועות הראשונים של עכברים כמחנכת), אבל להיות השבתה הדרגתית ב נח שריר למבוגרים6. למרבה הפלא, הם יכולים להיות מופעל מחדש בתגובה שריר פצעה, להבדיל לתוך תאי שריר חדשים כדי לתקן את השריר הפגוע7.

מאפייני תא גזע לבצע חקר SCs הרלוונטיים עבור שריר בסיסיים בביולוגיה והן טיפולים של מחלות שריר8. כתוצאה מכך, עבר שטח של חקירה אינטנסיבית בעשורים האחרונים. התקדמות עצומה נעשתה בניתוח את הגנטיקה ואת אפיגנטיקה SCs9,10. מעורב בידוד וזיהוי SCs בחיי עיר היו שפותח וטכניקות אופטימיזציה לאורך הדרך11. צביעת immunofluorescent מאפשר זיהוי SCs באמצעות נוגדנים ספציפיים, כולל זה עבור Pax7. עם זאת, המחסור ואת גודל קטן של ה-SCs בשילוב עם auto-פלורסצנטיות חזקה של רקמת שריר השלד למבוגרים לדקלם את הפריט החזותי מאתגר. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מוכתמים immunofluorescent הממוטבות עבור העכבר שריר Pax7, המבוסס על שיטה קיימת עבור דג זברה שריר12. בנוסף, נוגדן Laminin המסומנת fluorophore ברורים הוא מועסק כדי לזהות הנדן הבזליים שתחתיו ה-SCs ממוקמים. פרוטוקול זה מאפשר באופן עקבי את החזיית SCs Pax7-חיובית, מבשרי myogenic תחת כל נבדק בתנאים פיזיולוגיים ושלבים התפתחותיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ב פרוטוקול זה, שרירי הגפיים האחוריות הקדמי של עכברים בוגרים (2-6 חודשים), השוקתי הקדמי (TA), השריר פושט האצבעות הארוך (EDL), הועסקו בתור דוגמה כדי לבצע את immunofluorescence מכתים-SCs שלהם. כל השלבים טיפול עכברים שריר רקמות והניתוחים אושרו על ידי חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה (ACUC) של NIAMS/NIH.

1. לנתח את השריר ת א/אדי מן האיבר הינד העכבר

  1. המתת חסד העכבר בחדר מלא המתת חסד2 CO תחת הנחיות ACUC של NIH. לבצע פריקה צוואר הרחם במידת הצורך.
  2. לשים את הפנים העכבר על משטח חיתוך (פרקדן). תרסיס אתנול 70% על גבי העור בבטן שלו. חתך של 1-2 ס מ פתיחה אופקית על המרכז של העור בטן העכבר, אז כן, עדיף את העכבר על ידי משיכת הפתח לכיוון כפות הרגליים העכבר. חושפים צד אחד של האיבר הינד העכבר.
  3. להשתמש מלקחיים חדה שני: להשתמש אחד להחזיק את הגידים לצרף את ת א/אדי לקרסול ולהשתמש השני כדי לשבור להטיה fascia כיסוי ה-TA/EDL. לאחר fascia קולפה, להשתמש קצה חד של המלקחיים כדי לנתק את ת א/אדי של עצם השוקה על-ידי הפעלת את הקצה מתחת לשריר ת א/אדי.
  4. חתך הגידים הקרסול עם מספריים בעודו מחזיק אותם עם המלקחיים. חתוך את השריר עם מספריים לאורך קו האורך ת א/אדי בין הקרסול לברך כשאתם מרימים את ת א/אדי מהצד הקרסול עם המלקחיים. חותכים את הגידים בצד הברך כדי לנתק את אדי/ת א שלם של עצם השוקה.

2. הקפאה-הטבעה של שריר ת א/אדי

  1. הכנת אמבט חנקן נוזלי במיכל, למשל., חנקן נוזלי דיואר הבקבוק. שופכים methylbutane לתוך חבית פלסטיק קטנה (בערך 20 מ ל) עד חצי מלא. אז לשים את. הספל באמבטיה בחנקן נוזלי להקפיא אותו. לאחר כמה דקות, לבדוק methylbutane הוא קפוא.
    הערה: ניתן להחליף החנקן הנוזלי דלי קרח יבש, אך הזמן הקפוא הוא איטי יותר.
  2. להניח את אדי/ת א גזור על גבי משטח שטוח של פומפה מזרק פלסטיק קטנים. כיסוי מלא ה-TA/EDL עם מספר טיפות של האופטימלית חיתוך טמפרטורה (O.C.T.) מורכב (המדיום ההקפאה).
  3. לקחת את הספל methylbutane מהאמבטיה חנקן נוזלי, להפשיר את השטח עם חפץ חמים (למשל., נקודת האחיזה של מספריים). במהירות מח ש O.C.T. מכוסה ת א/אדי על הבוכנה לתוך methylbutane נמס אל snap-הקפאת הרקמה.
  4. לנתק את הרקמה מוטבע של הבוכנה עם מלקחיים, ושם את זה בתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL. למקם את הצינור לתוך חנקן נוזלי לאחסן אותו לטיפול דגימות נוספות.
    הערה: הרקמה מוטבע ניתן לאחסן ב-80 מעלות צלזיוס לטווח ארוך (שנתיים) או-20 ° C לטווח קצר (6 חודשים).

3. cryostat חלוקתה

  1. להוסיף טיפה של מתחם במרכז בעל הדגימה cryostat O.C.T.. המתן עד למתחם O.C.T. כמעט פני השטח למוצק. מקל במהירות את אדי/ת א מוטבע למתחם O.C.T., בניצב עם הקרסול-בצד למטה ובצד הברך-למעלה.
  2. הר בעל הדגימה על גבי cryostat לחתוך את הרקמה במרווח 10 מיקרומטר, לאסוף את הסעיפים הקפאה על פרוסט מצופה שקופיות עם סעיפים 4-8 על שקופית אחת.
  3. יבש הסעיפים בטמפרטורת החדר במשך לפחות 3 h ללון.
    הערה: למרות ייבוש הסעיפים במקפיא נלון או יותר קבילה, באופן בלתי נמנע יגדיל את autofluorescence. לקבלת תוצאות מיטביות, יבש הסעיפים עבור 0.5 h, ואז להמשיך עם קיבוע והשלבים מכתימים מיד.
  4. לאסוף את השקופיות בתיבה שקופיות, להשתמש בהם באופן מיידי, או לאחסן את השקופיות ב- 80 ° C או-20 ° C לשימוש מאוחר יותר.

4. הכנה של ריאגנטים Immunofluorescence מכתים

  1. הכן מאגרים:
    1. להכין 2 ל' 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) מהערוץ 10 x.
    2. להכין 40 מ של 4% paraformaldehyde (PFA) ב- PBS 1 x מ- 16% מחברים.
    3. להכין 2 ל' של PBST: 1 x PBS עם 0.1% טריטון-100.
    4. להכין 50 מ של PBST-b: PBST עם 2% אלבומין שור (BSA).
    5. הכינו 10 מ"ל של PBST-ב'-ז': PBST עם סרום עז נורמלי BSA ו- 5% 2%.
    6. להכין 1 מ"ל של חסימת פתרון. AffiniPure Fab שתדללו פרגמנט עז אנטי עכבר אג (H + L) (1:10) PBST-ב'.
    7. להכין 200 מ ל 1 x ציטראט המאגר.
      הערה: הכרכים של הפתרונות שלעיל מספיקים עבור שקופיות לפחות 5. אמצעי אחסון צריך להיות מותאם על פי מספר השקופיות והגודל של המכולות שקופיות.
  2. להכין נוגדן כתמים:
    1. ראשי נוגדנים (ריכוז בעבודה): להכין 1.2 מ של נוגדן ראשוני מיקס על ידי דילול Pax7 העכבר monoclonal נוגדנים (IgG1) (1-5 µg/mL) + Laminin ארנב polyclonal נוגדנים (0.5-2 µg/mL) + MF20 העכבר monoclonal נוגדנים (IgG2b) (0.5-2.5 µg / מ"ל) ב- PBST-B-G.
      הערה: MF20 העכבר monoclonal נוגדנים (IgG2b) היא אופציונלית.
    2. נוגדנים משניים (ריכוז בעבודה): להכין 1.2 מ של נוגדנים משניים מיקס על ידי דילול עז העכבר אנטי IgG1 קרוס-הספוחה משני נוגדן, אלקסה עבור חיל הים 488 (0.5-2 µg/mL) + עז ארנב אנטי איג (H + L) מאוד קרוס-הספוחה משני נוגדנים, אלקסה עבור חיל הים בתוספת 555 (0.5-2 µg/mL) + עז אנטי-העכבר IgG2b קרוס-הספוחה משני נוגדן, אלקסה עבור חיל הים 647 (0.5-2 µg/mL) ב- PBST-B-G.
      הערה: עבור חיל הים אלקסה 647 היא אופציונלית.

5. immunofluorescence מכתים צעדים

  1. נתרענן ונחזור לתקן את הסעיפים הקפאה עם כדורגלן.
    1. הסר את מספר השקופיות הקפאה. באזור ת א/אדי תיבת שקופיות. חממו את השקופיות מגש שקופית החזקת בטמפרטורת החדר.
    2. השתמש עט חוסם נוזלי (PAP עט) כדי לצייר אזור הכולל כל הקפאה-הסעיפים בשקופית. מעגל זה ימנע את הפתרונות זורם מחוץ לשקופית.
    3. קח את המגש ברדס fume מעבדה. להוסיף 300-500 µL של 4% מחברים אותן לשקופית בתוך חגו באזור לתקן את הסעיפים בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות לשטוף החוצה כדורגלן עם PBS 1 x לפחות 3 x 5 דקות בתוך מיכל שקופיות.
      התראה: PFA היא toxic של פסולת מסוכנת; זה צריך להיות פעלו בזהירות, הושלך לתוך מיכל פסולת מסוכנת.
  2. אחזור אנטיגן
    1. למלא מיכל שקופית אחרת עם 200 מ ל מאגר ציטראט.
    2. להעביר את השקופיות לתוך המיכל. העברת המכולה עם השקופיות סיר לחץ לבשל את השקופיות במצב לחץ גבוה למשך 10 דקות.
    3. לקרר את המיכל עם ניקוז מים במשך 10 דקות העברת כל השקופיות כדי מיכל חדש עם PBST (200 מ"ל), לשטוף את השקופיות עם PBST למשך לפחות 3 x 5 דקות.
  3. חסימת
    1. להוסיף kimwipes ספוגי מים במגש מחזיק את השקופיות כדי ליצור סביבה לחה כדי למנוע ייבוש של השקופיות.
    2. העבר את השקופיות חזרה המגש, וכן להוסיף 200 µL של חסימת פתרון על כל שקופית. מכסים את המגש עם כובע ולתת את חסימת לפתח למשך 30 דקות.
      הערה: נוגדן Pax7 הוא נוגדן חד שבטי עכבר, אז יש איגוד לא ספציפי של העכבר IgG ברקמות השריר העכבר יוצר רקע. שימוש AffiniPure Fab פרגמנט עז העכבר אנטי אג (H + L) חוסם של עכבר-על הכריכה לא ספציפי.
  4. החל נוגדנים העיקרי.
    1. יש לשטוף את השקופיות עם PBST פעם בגורם המכיל של השקופית. ואז להעביר את השקופיות בחזרה למגש מכתימים.
    2. החל µL 200 של נוגדן ראשוני תערובת על כל שקופית, מכסים את המגש עם כובע, והנח את התגובה לפתח בטמפרטורת החדר במשך 1 h או ב 4 ° C נלון.
      הערה: התגובה לילה ב 4 ° C נותן את התוצאה הטובה ביותר, למרות פיתוח התגובה בטמפרטורת החדר נותן תוצאות משביעות רצון. ניתן להוסיף הנוגדן MF20 צולבות הקישור חוטים שרירן בתערובת לבצע תיוג של טריפל (Pax7, Laminin, MF20). כתמים MF20 הבדיל סיבי השריר. שלב זה משמש גם צעד חסימת נוסף עם PBST-B-G כדי להפחית מחייב לא ספציפי פוטנציאלי משני הנוגדנים (עז נוגדנים) בשלב הבא.
  5. החל נוגדנים משניים.
    1. תשטוף את הנוגדנים ראשי עם PBST בטמפרטורת החדר לפחות 3 x 5 דקות.
    2. להוסיף 200 µL של נוגדנים משניים לערבב כל שקופית, ולאפשר את התגובה לפתח בטמפרטורת החדר במשך לפחות שעה.
      הערה: עבור Pax7 + Laminin, להשתמש עז העכבר אנטי IgG1 אלקסה 488 עז ארנב אנטי אלקסה 555.
      עבור Laminin + Pax7 + MF20, להוסיף עז אנטי-העכבר IgG2b אלקסה 647 בתערובת.
    3. תשטוף את הנוגדנים משני עם PBST לפחות 3 x 5 דקות.
  6. דאפי (4', 6-diamidino-2-phenylindole) נגד הכתם מכשירי הרכבה
    1. לדלל דאפי (1:20, 000) ב- PBST בגורם המכיל של שקופיות, למשל, 10 µL של דאפי ב 200 מ של PBST.
    2. מכתים את השקופיות בגורם המכיל של דאפי למשך 3 דקות.
    3. לשטוף את דאפי עם PBST למשך לפחות 5 x 5 דקות.
    4. לטעון את השקופיות הרכבה בינונית. מכסים את השקופיות עם coverslips.
      זהירות: דאפי היא רעילה, מסוכנים; זה צריך להיות שטופלו עם טיפול והוא מסולק בבקבוק פסולת מסוכנת.

6. מיקרוסקופ פלואורסצנטי

הערה: פרוטוקול מוכתמים immunofluorescent דיווח מעל יאפשר SCs ויזואליזציה עם גם שדה רחב פלורסנט או קונאפוקלית מיקרוסקופ. זה יכול להיות מאתגר בתחילה לזהות SCs... להלן כמה צעדים מומלצים שעשויים להיות לעזר.

  1. השתמש דאפי ערוץ הגדלה נמוכה מטרות להמחיש את המקטעים של השקופיות.
  2. מתג ההגדלה מנמוך לגבוה. להתבונן SCs, לפחות 20 X מטרה נדרש).
  3. שמתשהל סינון כפול עבור 488 (FITC) / 555 (Rhodamine) כדי לצפות גם Pax7 וגם Laminin אותות בו-זמנית כדי לזהות SCs. תחת הגדרה זו, האות של Pax7 מכתים יש ניגוד יותר רעשי הרקע.
  4. במהירות לסירוגין את הערוץ של FITC כדי דאפי לזהות כראוי SCs. כל SCs צריך להיות Pax7 דאפי-חיובי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

השלבים לעיל, SCs ניתן לאבחן בהצלחה בסעיפים למבוגרים מנוחתו השריר תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 1). למרות לרקמת שריר למבוגרים יש חזקה אוטומטי-קרינה פלואורסצנטית בסוג מסוים של סיבים, אלקסה סדרת צבעים בהירים ניתן להתגבר על רעשי הרקע ואת האות בולטת (איור 1 א', ב'; ראשי חץ). שני הפוטונים מיקרוסקופיה קונפוקלית לוכדת תמונה נקייה יחסית (איור 1B) מאשר במיקרוסקופ פלואורסצנטי שדה רחב (איור 1 א'). באותו הפרוטוקול גם עבד גם על שרירי רקמות של עכברים לנוער (איור 2 א), העוברים העכבר (איור 2B), ונפצעו רקמות שריר למבוגרים (איור 3). ברקמות השריר לנוער, עובריים, ישנם SCs מופעל (איור 2 א, חצים) או Pax7-חיוביות יותר מבשרי myogenic (איור 2B, חצים) בעלי גרעינים גדולים יחסית; לכן, קל יחסית לדמיין SCs של עכברים צעירים יותר של עכברים בוגרים (איור 2 לעומת איור 1). רקמת השריר הפגוע, גם ישנם יותר מופעל SCs Pax7-חיוביות (איור 3).

Figure 1
איור 1: תמונות של immunofluorescence Pax7 ו- Laminin על העכבר למבוגרים נח רקמות שריר. ת א/אדי שרירים חלקים של עכברים בוגרים היו immunostained עם Pax7 (ירוק), נוגדנים Laminin (אדום), נגד מוכתם דאפי (כחול). (א) התמונה שנתפסו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי שדה רחב. (B) התמונה שנתפסו תחת מיקרוסקופ קונפוקלי. גודל ברים: 50 מיקרומטר. חצים: SCs מסיבי עם autofluorescence נמוך. ראשי חץ: SCs מסיבי עם autofluorescence גבוהה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: תמונות של immunofluorescence Pax7 ו Laminin או MF20 על רקמות שריר של עכברים צעירים. ת א/אדי שרירים חלקים של עכברים צעירים היו immunostained עם Pax7 (ירוק), Laminin (אדום) או MF20 (מגנטה) נוגדנים, נגד מוכתם דאפי (כחול). יום לאחר הלידה (א) סעיף 8 של השריר (P8) כבשו תחת מיקרוסקופ קונפוקלי. (B) יום עובריים בסעיף 17.5 של השריר (E17.5) כבשו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי שדה רחב. גודל ברים = 50 מיקרומטר. חצים: SCs P8 שריר בסעיף (א); נציג Pax7 + myogenic מבשרי במקטע שריר E17.5, בעוד ישנם יותר בתמונה (B). אלה שתי תמונות שונו מן הנתונים הגולמיים גם להפיק תמונות מאמר שפורסם13 (sדמות תלת-ממד), (sאיור 1B), בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: תמונת הנציגה של immunofluorescence Pax7 ו- Laminin על רקמות שריר למבוגרים פצוע. ת א/אדי שרירים חלקים רקמות שריר למבוגרים פצוע (7 ימים לאחר פציעה) היו immunostained עם Pax7 (ירוק), נוגדנים Laminin (אדום), נגד מוכתם דאפי (כחול). התמונה צולמה תחת מיקרוסקופ קונפוקלי. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. חצים: SCs במקטע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול הנ ל מבוססת על שיטה של Pax7/MF20 מכתים על שרירי השלד דג זברה12. הפתרונות בשימוש וחסימת צעדים הן זהות או דומות. הנוגדנים בשימוש זהים. השלבים מנוכי עונתיות התבססו על התכונות של רקמת שריר עכבר ו- SCs. ראשית, Laminin נוגדן נוסף בתערובת שיעזרו להמחיש, לאשר את המיקום של SCs. זה היה מועיל במיוחד לספור את מספר SCs תחת המיקרוסקופ בעת שימוש הקוביה סינון כפול של 488/555; זה שיפור משמעותי את האות Pax7 SC-derived להתבלט רקע autofluorescent רועש. שנית, מאחר הנוגדן Pax7 בשימוש נוגדן העכבר, הוספנו שלב חסימה עכבר-על (שלב 5.3) כדי להפחית את הרקע הנובע האיגוד לא ספציפי של העכבר IgG. שלישית, השלב אחזור אנטיגן (שלב 5.2) היה קריטי עבור צביעת עם נוגדנים Pax7 על כדורגלן קבוע רקמות.

באותו הפרוטוקול שימש על רקמות שריר של עכברים צעירים (הגורים ו עוברי) (איור 2). למעשה, זה היה יחסית קל יותר להציג באופן חזותי SCs הגורים מאשר בעכברים למבוגרים מאת באותו הפרוטוקול. ייתכן שיהיה זה יעיל להתחיל עם צביעת SCs על הגורים לצבור ניסיון לפני שתמשיך עם רקמת השריר למבוגרים. פקד שלילי ללא נוגדנים הראשי (שלב 5.4) נחוץ גם בבכל ניסוי. פרוטוקול דומה שימש בהצלחה במקטעי פרפין עם תוספת פרפין וצעדי העיבוד. עם זאת, הסעיפים פרפין נוטים להיות בעלי רקע autofluorescence גבוהה יותר, אשר רעולי פנים אותות ה-SCs שיש להם ביטוי Pax7 חלשים יחסית. במידת האפשר, הימנע משימוש פרפין מקטעים. באותו הפרוטוקול הועסק גם על רקמות השריר הפגוע יש SCs רבים, ולא נתן תוצאות דומות לאלה שהושג עם רקמת השריר של הכלבלב (איור 3).

Autofluorescence רקמות שריר מייצג את המכשול בהשגת תוצאות נקיות immunofluorescence14. הפחתת זמן ייבוש סעיפים-הקפאה יכול להקטין autofluorescence, באמצעות הקפאה הטרי-סעיפים מומלץ בחום. בדומה לפרוטוקולים אחרים15, הצעד חסימה על עכבר נדרשת כדי לצמצם עוד יותר את הרקע.

בעוד מיקרוסקופ פלואורסצנטי שדה רחב וגם מיקרוסקופ קונפוקלי היו יעילים להמחשת SCs דרך העין חתיכות, השימוש של מיקרוסקופ קונפוקלי מומלץ כדי ללכוד תמונות באיכות גבוהה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים NIAMS אור הדמיה המקטע למתן מיקרוסקופים וסיוע טכני. נוגדנים MF20 ו- Pax7 התקבלו מהבנק התפתחותית מחקרים ליפידים שפותח תחת חסותה של NICHD ומתוחזק על ידי העירייה במחלקה למדעי הביולוגיה, אוניברסיטת איווה, איווה. עבודה זו נתמכה על ידי מגזר מחקר התוכנית של NIAMS של מכוני הבריאות הלאומיים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
methylbutane Sigma-Aldrich M32631
Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound Electron Microscopy Sciences 62550-01
10x PBS Gibco, Themo Fisher 70011-044
16% PFA TED PELLA 50-00-0
Triton-100 Sigma-Aldrich T8787
Normal Goat Serum Thermo Fisher 0 1-6201
AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. 115-007-003
20x Citrate Buffer Thermo Fisher 00 500
Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) Developmental Study Hybridoma Bank N/A
Laminin polyclonal rabbit antibody Sigma-Aldrich L9393
MF20 mono-clonal mouse antibody (IgG2b) (supernatant) Developmental Study Hybridoma Bank N/A
Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher A-21121
Goat anti-Mouse IgG2b cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 647 Thermo Fisher A-21242
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 Thermo Fisher A32732
Leica CM1860 cryostat
Leica DM6000 wide-field fluorescent microscope
Leica DMR wide-field fluorescent microscope
Zeiss LSM510 confocal microscope
Zeiss LSM780 confocal microscope
Cuisinart electronic pressure cooker

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buckingham, M. Gene regulatory networks and cell lineages that underlie the formation of skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (23), 5830-5837 (2017).
  2. Buckingham, M., Relaix, F. PAX3 and PAX7 as upstream regulators of myogenesis. Semin Cell Dev Biol. 44, 115-125 (2015).
  3. Relaix, F., Buckingham, M. From insect eye to vertebrate muscle: redeployment of a regulatory network. Genes Dev. 13 (24), 3171-3178 (1999).
  4. Chang, N. C., Chevalier, F. P., Rudnicki, M. A. Satellite Cells in Muscular Dystrophy - Lost in Polarity. Trends Mol Med. 22 (6), 479-496 (2016).
  5. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).
  6. Kuang, S., Rudnicki, M. A. The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential. Trends Mol Med. 14 (2), 82-91 (2008).
  7. Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Satellite cells, the engines of muscle repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (2), 127-133 (2011).
  8. Rinaldi, F., Perlingeiro, R. C. Stem cells for skeletal muscle regeneration: therapeutic potential and roadblocks. Transl Res. 163 (4), 409-417 (2014).
  9. Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis. Curr Opin Cell Biol. 19 (6), 628-633 (2007).
  10. Giordani, L., Puri, P. L. Epigenetic control of skeletal muscle regeneration: Integrating genetic determinants and environmental changes. FEBS J. 280 (17), 4014-4025 (2013).
  11. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nat Protoc. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  12. Feng, X., Adiarte, E. G., Devoto, S. H. Hedgehog acts directly on the zebrafish dermomyotome to promote myogenic differentiation. Dev Biol. 300 (2), 736-746 (2006).
  13. Juan, A. H., et al. Polycomb EZH2 controls self-renewal and safeguards the transcriptional identity of skeletal muscle stem cells. Genes Dev. 25 (8), 789-794 (2011).
  14. Jackson, K. A., Snyder, D. S., Goodell, M. A. Skeletal muscle fiber-specific green autofluorescence: potential for stem cell engraftment artifacts. Stem Cells. 22 (2), 180-187 (2004).
  15. Lepper, C., Conway, S. J., Fan, C. M. Adult satellite cells and embryonic muscle progenitors have distinct genetic requirements. Nature. 460 (7255), 627-631 (2009).

Tags

ביולוגיה התפתחותית בעיה 134 שרירי השלד תאים הלוויין Pax7 immunofluorescence תאי גזע הנדן הבזליים
זיהוי של שרירי השלד תאים הלוויין על-ידי Immunofluorescence עם Pax7 ו- Laminin נוגדנים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Feng, X., Naz, F., Juan, A. H.,… More

Feng, X., Naz, F., Juan, A. H., Dell'Orso, S., Sartorelli, V. Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies. J. Vis. Exp. (134), e57212, doi:10.3791/57212 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter