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Developmental Biology

Pax7 Laminin 항 체와 면역 형광에 의해 골격 근육 인공위성 세포의 식별

doi: 10.3791/57212 Published: April 19, 2018
* These authors contributed equally

Summary

위성 세포의 정확한 식별 다양 한 생리 및 병 적인 조건 하에서 그들의 기능을 공부 하는 것이 필수적입니다. 이 문서는 얼룩 면역 형광 기반으로 성인 골격 근육 섹션에 위성 셀을 식별 하는 프로토콜을 제공 합니다.

Abstract

면역 형광 검사 조직 섹션에 다른 세포 유형을 식별 하는 데 도움이 효과적인 방법입니다. 원하는 셀 인구를 공부 하기 위하여 특정 셀 표식에 대 한 항 체는 조직 섹션에 적용 됩니다. 성인 골격 근육 인공위성 세포 (SCs)는 근육 수리 및 재생에 기여 하는 줄기 세포 이다. 따라서, 그것은 시각화 하 고 다른 생리 적인 조건 하에서 위성 세포 인구를 추적 하는 것이 중요입니다. 골격 근육을 휴식, SCs 기저 lamina 및 myofiber 플라즈마 멤브레인 사이 상주 합니다. SCs는 myofibers 또는 세포 배양에서 식별 하는 데 일반적으로 사용 되 마커 Pax7 짝된 상자 단백질입니다. 이 문서에서는, 골격 근육 부분에 최적화 된 Pax7 면역 형광 검사 프로토콜은 일반적인 얼룩 및 백그라운드를 최소화 하 여. 기저 lamina의 단백질 (laminin)를 인식 하는 또 다른 항 체도 SCs 유사한 프로토콜을 식별 하는 데 사용할 수 있습니다 또한 더블 또는 트리플 Pax7 및 관심사의 추가적인 단백질을 위한 항 체와 라벨을 수행 하기 위해 추가 되었다.

Introduction

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골격 근육 multinucleated 근육 세포의 구성, myotubes 이라고, myofibers, 힘 및 수 축을 통해 움직임을 생성 하는 구성. Craniofacial 일부 근육을 제외 하면 대부분 골격 근육 somite1라고 하는 임시 미 발달 구조에서 파생 됩니다. 조직적 전조 세포 상피 somite myoblasts 될에서 delaminate. 더 Myoblasts myocytes 멀티 nucleated myofibers를 myotubes 될 융합으로 구분 합니다. 위의 과정은 myogenesis 이라고 불리고 일시적으로 통제 제어 유전자 발현의 특징 이다. 조직적 선구자 표현할 Pax3 Pax7, 반면 myoblasts 익스프레스 MyoD 또는 Myf5 myocytes 익스프레스 myogenin myosins2,3. 근육 성장 있는 myofibers 될 큰 근육 섬유 크기 (비 대)4증가 기존 섬유 (증식)에 더 많은 myonuclei를 통합 하는 프로세스입니다. 근육 성장, 동안 줄기 세포 속성을 차별화 하 고 자기 갱신 수에 있는 조직적 셀의 지속 가능한 소스가입니다. 이 세포는 위성 세포 sarcolemma는 myofiber의 (세포 막)와 기저 lamina5사이 그들의 물리적 위치에 따라 불린다. SCs는 적극적으로 청소년 단계 (출생 후 쥐의 첫 2-3 주), 근육 성장에 기여 하지만 성인 근육6휴식에서 무부하 될. 놀랍게도, 그들은 근육에 다시 활성화 될 수 있습니다 손상 및 복구 손상 된 근육7새로운 근육 세포로 분화.

줄기 세포 속성 기본 근육 생물학 및 근육 질환8의 치료에 대 한 관련 SCs의 연구를 확인합니다. 결과적으로, 그것은 과거 십 년간에서 강렬한 수 사의 영역 되었습니다. 유전학 그리고 epigenetics SCs9,10의 해 부에 엄청난 진행이 했다. 분리 하 고 제자리에 SCs 식별에 관련 된 기술은 개발 하 고 방법11에 따라 최적화 된 했다. Immunofluorescent 얼룩 Pax7를 포함 하 여 특정 항 체를 사용 하 여 SCs의 식별 수 있습니다. 그러나, 부족 및 강한 자동-형광 성인 골격 근육 조직을 결합 하는 SCs의 작은 크기 렌더링 시각화 도전. 여기, 우리는 immunofluorescent 얼룩 프로토콜 Pax7 마우스 근육 조직에 대 한 최적화 및 zebrafish 근육12는 기존 방법에 따라 설명 합니다. 또한, 뚜렷한 fluorophore 표시 Laminin 항 체 기저 lamina는 SCs는 위치를 식별 하기 위해 채택 된다. 이 프로토콜은 지속적으로 Pax7 긍정적인 SCs와 모든 테스트 생리 적 조건 및 발달 단계에서 조직적 선구자의 시각화 수 있습니다.

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Protocol

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이 프로토콜에서 성인 쥐 (2-6 개월), tibialis 앞쪽 (TA) 및 신 근 digitorum longus (EDL)의 앞쪽 뒷 다리 근육 그들의 SCs에 얼룩 면역 형광 검사를 수행 하려면 예제로 채택 되었다. 모든 단계 마우스 및 근육 조직 해 동물 관리 및 사용 위원회 (ACUC) NIAMS/NIH에 의해 승인 되었습니다.

1. 마우스 뒷 다리에서 따/EDL 근육 해 부

  1. NIH의 ACUC의 지침에 따라 CO2 채워진된 안락사 챔버에 마우스 안락사 필요한 경우 자 궁 경부 전위를 수행 합니다.
  2. 위에 마우스 얼굴 업 해 부 패드 (부정사). 복 부 피부에 70% 에탄올 스프레이. 마우스 배 스킨의 중앙에 가로로 여 1-2 cm를 잘라 다음 마우스 피트를 향해 개방을 당겨서 마우스를 deskin. 마우스 뒷 다리 사지의 한쪽을 노출 합니다.
  3. 두 개의 날카로운 집게를 사용 하 여: 발목, TA/EDL을 연결 하는 힘 줄을 하나를 사용 하 고 다른 하나를 사용 하 여 휴식을 전단 TA/EDL을 취재 하는 근 막. 일단 근 막 벗는 집게의 날카로운 팁을 사용 하 여 TA/EDL 근육 아래 팁을 실행 하 여 TA/EDL 경골 뼈에서 분리.
  4. 여전히는 집게로 잡고가 위로 발목 힘 줄을 잘라. 집게와 발목 쪽에서 TA/EDL을 해제 하는 동안 근육은 TA/EDL 발목에서 무릎에의 경도 선 따라가 위로 잘라. 전체 TA/EDL 경골에서 분리를 무릎 쪽 힘 줄을 잘라.

2. Cryo-포함 TA/EDL 근육의

  1. 컨테이너, 예를 들어액체 질소 목욕 준비., 액체 질소 Dewar 플라스 크. 작은 플라스틱 비 커에 (약 20 mL) 반 전체에 methylbutane를 붓는 다. 그럼 그것을 동결에 액체 질소 목욕에서 비 커를 넣어. 몇 분 후에 methylbutane 동결 되었음을 확인 합니다.
    참고: 액체 질소는 드라이 아이스의 양동이 의해 대체 될 수 있지만 동결 시간 느립니다.
  2. 해 부 TA/EDL 작은 플라스틱 주사기 플런저의 평평한 표면에 놓으십시오. 완전히 조교/EDL 몇 방울의 최적의 절삭 온도 (O.C.T.) 화합물 (냉동 매체)로 커버.
  3. 액체 질소 목욕 중 methylbutane 비 커 고 따뜻한 개체와 표면 해빙 (.가 위 손잡이). 신속 하 게 딥은 O.C.T. 스냅-동결 조직에 녹 인된 methylbutane로 플런저에 TA/EDL을 커버.
  4. 집게와 플런저에서 포함 된 조직을 분리 하 고 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 넣어. 더 많은 샘플을 처리 하는 동안 그것을 저장 하는 장소 액체 질소에 튜브.
    참고: 포함 된 조직 저장할 수 있습니다 장기 (2 년) 또는-20 ° C-80 ° C에서 짧은 기간 (6 개월)에 대 한.

3. cryostat 단면

  1. O.C.T.는 cryostat의 견본 홀더의 중심에 복합의 한 방울을 추가 합니다. O.C.T. 화합물은 거의 확정 될 때까지 기다립니다. 신속 하 게 발목 쪽으로 수직 O.C.T. 화합물에 포함 된 TA/EDL 스틱 다운 및 무릎 쪽까지.
  2. 탑재 한 cryostat에 견본 홀더, 조직 10 µ m 간격 자르고에 대 한 프 로스트 코팅 슬라이드와 cryo-섹션을 수집 한 슬라이드에 4-8 절.
  3. 적어도 3 h 하룻밤 실 온에서 섹션을 건조.
    참고: 비록 하룻밤 이상 냉장고에 섹션을 건조 하는 것은 허용, 그것은 필연적으로 증가 합니다 하지는 autofluorescence. 최상의 결과 얻으려면 건조 0.5 h에 대 한 섹션 진행 됩니다 고정과 얼룩 단계 즉시.
  4. 슬라이드 상자에서 슬라이드를 수집, 즉시 그들을 사용 하 여 또는-80 ° C 또는-20 ° C 나중에 사용할 슬라이드를 저장.

4입니다. 면역 형광 염색 법에 대 한 시 약의 준비

  1. 버퍼를 준비:
    1. 10 x PBS에서 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 1의 2 리터를 준비 합니다.
    2. 1 x PBS 16%에서 4 %paraformaldehyde (PFA)의 40 mL 준비 PFA.
    3. PBST의 2 리터를 준비: 0.1% 트리톤-100 1 x PBS.
    4. 2% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 PBST-b: PBST의 50 mL를 준비 합니다.
    5. 2%와 5 %BSA 정상 염소 혈 청으로 PBST-B-g: PBST의 10 mL를 준비 합니다.
    6. 1 mL 차단 솔루션의 준비. 희석 AffiniPure 팹 조각 염소 반대로 마우스 IgG (H + L) (1:10) PBST-b
    7. 1 x 시트르산 버퍼의 200ml를 준비 합니다.
      참고: 위의 솔루션의 볼륨은 적어도 5 슬라이드에 대 한 충분 한. 볼륨은 슬라이드의 수와 슬라이드 컨테이너의 크기에 따라 조정 되어야 한다.
  2. 항 체 얼룩을 준비:
    1. 1 차 항 체 (작업 농도): Pax7 마우스 단일 클론 항 체 (IgG1) 희석 하 여 1 차적인 항 체 혼합의 1.2 mL를 준비 (1-5 µ g/mL) + Laminin polyclonal 토끼 항 체 (0.5-2 µ g/mL) + MF20 마우스 단일 클론 항 체 (IgG2b) (0.5-2.5 µ g / mL) PBST-B-g
      참고: MF20 마우스 단일 클론 항 체 (IgG2b) 선택 사항입니다.
    2. 2 차 항 체 (작업 농도): 염소 반대로 마우스 IgG1 크로스 흡착 이차 항 체, 알 렉 사 Fluor 488 diluting 하 여 1.2 mL 이차 항 체 혼합의 준비 (0.5-2 µ g/mL) + 염소-토끼 IgG (H + L) 높은 간-흡착 이차 항 체, 알 렉 사 Fluor 플러스 555 (0.5-2 µ g/mL) + 염소 반대로 마우스 IgG2b 크로스 흡착 이차 항 체, 알 렉 사 Fluor 647 (0.5-2 µ g/mL) PBST-B-g
      참고: 알 렉 사 Fluor 647 선택 사항입니다.

5. 면역 형광 염색 법 단계

  1. Rehydrate 하 고 PFA와 cryo-섹션을 수정.
    1. 슬라이드 상자에서 TA/EDL cryo-섹션 슬라이드의 몇 가지를 제거 합니다. 따뜻한 실 온에서 슬라이드 잡고 트레이에 슬라이드.
    2. 액체 차단 펜 (PAP 펜)를 사용 하 여 모든 곳을 알아내는-섹션 슬라이드에 포함 된 영역을 그립니다. 이 원형 슬라이드 밖 흐르는 솔루션을 막을 것 이다.
    3. 실험실 연기 후드에는 트레이 가져가 라. 300-500 µ L 4%의 추가 10 분 1 x PBS와 PFA에 밖으로 세척에 대 한 실 온에서 섹션을 해결 하기 위해 원된 영역 내에서 슬라이드에 PFA 슬라이드 컨테이너에서 적어도 3 x 5 분.
      주의: PFA는 독성과 유해 폐기물; 그것은 관리와 함께 작동 한다 고 유해 폐기물 용기에 폐기.
  2. 항 원 복구
    1. 구 연산 염 버퍼의 200 mL와 함께 다른 슬라이드 컨테이너를 작성.
    2. 컨테이너에 슬라이드를 전송 합니다. 압력 밥 솥 요리 10 분에 대 한 높은 압력 모드에서 슬라이드를 슬라이드와 함께 컨테이너를 전송 합니다.
    3. 배수 물 10 분 전송에 대 한 모든 슬라이드 PBST (200 mL)와 새로운 컨테이너와 컨테이너를 쿨, 3 x 5 분 이상에 대 한 PBST와 슬라이드를 씻어.
  3. 차단
    1. 슬라이드의 건조를 피하기 위해 습 한 환경을 만들기 위해 슬라이드를 잡고 트레이를 물에 젖은 kimwipes를 추가 합니다.
    2. 트레이, 다시 슬라이드를 이동 하 고 각 슬라이드에 솔루션 차단의 200 µ L를 추가 합니다. 모자와 함께 트레이 커버 하 고 30 분 동안 개발 차단 하자.
      참고: Pax7 항 체는 마우스 단일 클론 항 체 때문에 마우스 IgG 마우스 근육 조직에 높은 백그라운드를 만드는의 불특정 바인딩. AffiniPure 팹 조각 염소 반대로 마우스 IgG (H + L)를 사용 하 여 마우스에 마우스 난다 바인딩을 차단 합니다.
  4. 1 차 항 체를 적용 합니다.
    1. 슬라이드 슬라이드 컨테이너에서 한 번 PBST와 린스. 그런 다음 다시 얼룩 트레이 슬라이드를 이동 합니다.
    2. 각 슬라이드에 1 차적인 항 체 혼합의 200 µ L을 적용 하 고 모자, 트레이 커버 개발 1 시간 실내 온도에 또는 하룻밤에 4 ° C에서 반응 하 게.
      참고: 4 ° C에서 하룻밤 반응 비록 만족 스러운 결과 제공 실 온에서 반응 개발 최상의 결과 제공 합니다. Myosin MF20 항 체 트리플 (Pax7, Laminin MF20) 라벨 수행 믹스에 추가할 수 있습니다. MF20 얼룩 분화 근육 섬유. 이 단계는 또한 PBST-B-g을 줄이기 위해 다음 단계에서 2 차 항 체 (염소 항 체)에서 잠재적인 난다 바인딩 다른 차단 단계 역할을 합니다.
  5. 2 차 항 체를 적용 합니다.
    1. 실 온에서 PBST와 함께 1 차 항 체에 밖으로 세척 적어도 3 x 5 분.
    2. 각 슬라이드에 이차 항 체 혼합의 200 µ L을 추가 하 고 허용 하는 적어도 1 시간에 대 한 실 온에서 개발 하는 반응.
      참고: Pax7 + Laminin에 대 한 사용 하 여 염소 반대로 마우스 IgG1 알 렉 사 488와 염소 안티 토끼 알 렉 사 555.
      Pax7 + Laminin + MF20, 염소 반대로 마우스 IgG2b 알 렉 사 647 믹스에 추가.
    3. PBST와 2 차 항 체에 밖으로 세척 적어도 3 x 5 분.
  6. DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) 카운터 얼룩 및 장착
    1. PBST 슬라이드 컨테이너, 예를 들어, PBST의 200 mL에 DAPI의 10 µ L에에서 DAPI (1:20, 000)를 희석.
    2. 슬라이드 3 분 DAPI 컨테이너에 얼룩.
    3. PBST와 DAPI 적어도 5 x 5 분 동안 세척 한다.
    4. 설치 매체와 함께 슬라이드를 탑재 합니다. Coverslips와 함께 슬라이드 커버.
      주의: DAPI는 유독 하 고 위험한; 그것은 신중 하 게 처리 해야 한다 고 유해 폐기물 병에서 삭제.

6. 형광 현미경 검사 법

참고: immunofluorescent 얼룩 프로토콜 위에 보고는 넓은 필드 형광 또는 confocal 현미경으로 SCs 시각화를 수 있습니다. 그것은 처음 SCs를 식별 하는 도전 수 있습니다. 도움이 될 수 있는 몇 가지 권장 되는 단계는 여기 있다.

  1. DAPI 채널 및 낮은 배율 목표를 사용 하 여 슬라이드에 대 한 섹션을 시각화.
  2. 높은 낮은 배율을 전환 합니다. 관찰 하기 위해 SCs, 적어도 20 X 목적은 필요)입니다.
  3. 488 (FITC)에 대 한 듀얼 필터 큐브를 사용 하 여 / 555 (Rhodamine) Pax7 Laminin를 모두 관찰 하는 SCs를 식별 하는 동시에 신호. 이 설정에서 Pax7 얼룩의 신호는 배경 잡음을 더 나은 대비.
  4. 신속 하 게 제대로 식별 SCs DAPI FITC에서 채널 대체. 모든 SCs Pax7/DAPI 양성 해야 합니다.

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Representative Results

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위의 단계에 따라 SCs 성공적으로 성인 휴식 근육 섹션 형광 현미경 (그림 1)의 밑에 구상 될 수 있다. 비록 성인 근육 조직 섬유의 특정 유형에 서 강한 자동 형광 있다, 밝은 알 렉 사 시리즈 염료 배경 잡음을 극복할 수와 신호 밖으로 서 (그림 1A, B, 화살표 머리). 두 광자 공초점 현미경 넓은 분야 형광 현미경 (그림 1A) 보다 상대적으로 깔끔한 이미지를 (그림 1B)를 캡처합니다. 동일한 프로토콜 또한 청소년 생쥐 (그림 2A), 마우스 배아 (그림 2B)의 근육 조직에서 잘 작동 하 고 부상 성인 근육 조직 (그림 3). 청소년 및 미 발달 근육 조직에는 더 많은 활성화 된 SCs (그림 2A, 화살표) 또는 Pax7 긍정적인 조직적 선구자 (그림 2B, 화살표)을 상대적으로 더 큰 핵; 따라서, 성인 생쥐 ( 그림 1그림 2 ) 보다 젊은 쥐의 SCs를 시각화 하기 위해 상대적으로 쉽습니다. 다친된 근육 조직에 또한 있다 더 활성화 Pax7 긍정적인 SCs (그림 3).

Figure 1
그림 1: 마우스 성인 근육 조직을 휴식에 Pax7 및 Laminin 면역 형광 이미지. 성인 쥐의 TA/EDL 근육 섹션 Pax7 (녹색)와 항 체 Laminin (빨간색), immunostained 그리고 카운터 DAPI (파란색)으로 물. (A) 이미지 넓은 분야 형광 현미경 아래 캡처한. (B) 이미지 공초점 현미경 촬영. 스케일 바: 50 µ m. 화살표: SCs 낮은 autofluorescence와 섬유에서. 화살촉: SCs 높은 autofluorescence 섬유에서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 젊은 쥐의 근육 조직에 Pax7 Laminin 또는 MF20 면역 형광 이미지. 젊은 쥐의 TA/EDL 근육 섹션 Pax7 (녹색) 및 Laminin (빨간색) 또는 항 체 MF20 (마젠타), immunostained 그리고 카운터 DAPI (파란색)으로 물. (A) 출생 후 하루 8 (P8) 근육 섹션 confocal 현미경 촬영. (B) 배아 일 17.5 (E17.5) 근육 섹션 넓은 분야 형광 현미경 아래 캡처한. 스케일 바 = 50 µ m. 화살표: SCs P8 근육 섹션 (A); 대표 Pax7 + E17.5 근육 섹션 이미지 (B)에 더 많은 반면에 조직적 선구자. 이 두 이미지는 또한에서 생성 된 이미지는 게시 된 종이13 (s그림 3D)와 s (그림 1B), 각각 원시 데이터에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 부상된 성인 근육 조직에 Pax7 및 Laminin 면역 형광의 대표 이미지. TA/EDL 근육 부분의 부상된 성인 근육 조직 (7 일) 부상 이후 Pax7 (녹색)와 항 체 Laminin (레드), immunostained 그리고 카운터 DAPI (파란색)으로 물. 이미지는 confocal 현미경 체포 됐다. 눈금 막대 = 50 µ m. 화살표: SCs 섹션에서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

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위의 프로토콜 Pax7/MF20 zebrafish 골격 근육12얼룩의 방법에 근거 했다. 사용 하 고 단계 차단 솔루션은 동일 하거나 유사한. 사용 하는 항 체는 동일 합니다. 조정된 단계 마우스 근육 조직과 SCs의 기능에 근거 했다. 첫째, 항 체 Laminin 시각화 하 고 SCs의 위치를 확인할 수 있도록 믹스에 추가 되었습니다. 그것은 특히 도움이 488/555;의 듀얼 필터 큐브를 사용 하 여 현미경 SCs의 수를 계산 하 이 크게 시끄러운 autofluorescent 배경에서 밖으로 서 SC 파생 Pax7 신호를 향상. 둘째, 사용 Pax7 항 체는 마우스 항 체 이기 때문에, 우리는 마우스에 마우스 차단 단계 (5.3)을 줄이기 위해 마우스 IgG의 불특정 바인딩에서 발생 배경 추가. 셋째, 항 원 검색 단계 (단계 5.2) 조직을 고정 하는 PFA에 Pax7 항 체와 얼룩에 대 한 중요 했다.

동일한 프로토콜 (강아지와 배아) 젊은 쥐의 근육 조직에 사용 되었다 (그림 2). 사실, 그것은 동일한 프로토콜 보다 성인 쥐 새끼에 SCs를 시각화 하는 상대적으로 쉽게 했다. 그것은 성인 근육 조직으로 진행 하기 전에 경험을 얻기 위해 새끼에 SCs를 얼룩 시작 도움이 될 수도 있습니다. 1 차 항 체 (단계 5.4) 없이 부정적인 제어 모든 실험에 필요한 이기도합니다. 유사한 프로토콜 처리 단계 추가 파라핀으로 파라핀 섹션에 성공적으로 사용 되었다. 그러나, 파라핀 섹션 경향이 있다 신호는 상대적으로 약한 Pax7 식 SCs에서 마스크 더 높은 autofluorescence 배경. 만약에 가능 하다 면, 파라핀 섹션을 사용 하지 마십시오. 동일한 프로토콜 또한 수많은 SCs, 그리고 강아지의 근육 조직 (그림 3)으로 얻은 그 비슷한 결과 준 부상된 근육 조직에 고용 되었다.

근육 조직 autofluorescence 깨끗 한 면역 형광 검사 결과14를 얻기에 중요 한 장애를 나타냅니다. Autofluorescence 줄일 수 있는 곳을 알아내는-섹션의 건조 시간을 단축 하 고 갓된 cryo-섹션을 사용 하는 것이 좋습니다. 다른 프로토콜15와 마찬가지로 마우스에 마우스 차단 단계 추가 백그라운드를 줄이기 위해 필요 합니다.

넓은 분야 형광 현미경, 공초점 현미경 눈 조각을 통해 SCs 시각화에 대 한 효과적인 동안, 높은-품질의 이미지를 캡처 confocal 현미경의 사용은 권장 됩니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

우리 감사 NIAMS 빛 이미징 섹션 현미경 및 기술 지원을 제공 합니다. MF20 및 Pax7 항 체 개발 연구 Hybridoma 은행은 NICHD의 후원 하에 개발 하 고 유지 관리 학과 생물 과학, 아이오의 대학, 아이오와 시티에서 얻은 했다. 이 작품은 국립 보건원의 NIAMS의 교내 연구 프로그램에 의해 지원 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
methylbutane Sigma-Aldrich M32631
Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound Electron Microscopy Sciences 62550-01
10x PBS Gibco, Themo Fisher 70011-044
16% PFA TED PELLA 50-00-0
Triton-100 Sigma-Aldrich T8787
Normal Goat Serum Thermo Fisher 0 1-6201
AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. 115-007-003
20x Citrate Buffer Thermo Fisher 00 500
Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) Developmental Study Hybridoma Bank N/A
Laminin polyclonal rabbit antibody Sigma-Aldrich L9393
MF20 mono-clonal mouse antibody (IgG2b) (supernatant) Developmental Study Hybridoma Bank N/A
Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher A-21121
Goat anti-Mouse IgG2b cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 647 Thermo Fisher A-21242
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 Thermo Fisher A32732
Leica CM1860 cryostat
Leica DM6000 wide-field fluorescent microscope
Leica DMR wide-field fluorescent microscope
Zeiss LSM510 confocal microscope
Zeiss LSM780 confocal microscope
Cuisinart electronic pressure cooker

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References

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Feng, X., Naz, F., Juan, A. H., Dell'Orso, S., Sartorelli, V. Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies. J. Vis. Exp. (134), e57212, doi:10.3791/57212 (2018).More

Feng, X., Naz, F., Juan, A. H., Dell'Orso, S., Sartorelli, V. Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies. J. Vis. Exp. (134), e57212, doi:10.3791/57212 (2018).

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