Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Bir sıçan modelinde kısmi kolektomi sonra kaçağı azaltmak için Yağ dokusundan elde edilen kök hücre sayfasının nakli

doi: 10.3791/57213 Published: August 11, 2018

Summary

Hazırlık ve nakli Yağ dokusundan elde edilen kök hücre (ASC) yaprak bir sıçan modelinde yeterince dikilmiş kolorektal anastomoses üzerine sunulur. Bu yeni uygulama ASC sayfaları kolorektal anastomoz kaçağı azaltmak gösterir.

Abstract

Anastomoz kaçağı Kolorektal cerrahi sonrası felaket bir komplikasyondur. Kaçak Önleme için geçerli yöntemleri klinik etkinliğinin farklı düzeylerde olmasına rağmen onlar kadar şimdi kusurlu çözümleri vardır. Kök hücre tedavisi ASC sayfalarını kullanarak bu soruna bir çözüm sağlayabilir. ASCs gibi gelecek vaat eden adaylar doku trofik ve immunomodulatory özellikleri nedeniyle şifa teşvik için kabul edilir. Burada, kolorektal anastomoz kaçağı azaltmak için fare modeli üzerine nakledilen yüksek yoğunluklu ASC levhalar, üretmek için yöntemleri sağlar. ASCs hücre sayfaları kolayca müstakil ısı duyarlı kültür yemekleri kurdu. Nakli günü, kısmi bir kolektomi ile 5-dikiş kolorektal anastomoz gerçekleştirildi. Hayvanlar hemen 1 ASC sayfa başına fare ile nakledilen. ASC sayfaları kendiliğinden herhangi bir yapıştırıcı, dikiş veya herhangi bir biomaterial olmadan anastomoz yapıştırılır. Hayvan grupları 3 ve 7 gün feda postoperatively. Transplante hayvanlara göre anastomoz apse ve kaçak insidansı denetim hayvanlarda daha yüksek. Bizim modelinde, ASC sayfaları nakli kolorektal anastomoz sonra başarılı ve daha düşük bir sızıntı oranı ile ilişkili.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Birincil bir anastomoz ile kısmi kolektomi kolorektal kanser, Crohn hastalığı ve divertikülit1,2gibi kolon etkileyen birçok hastalık için yapılabilir sık gerçekleştirilen bir cerrahidir. Kolorektal anastomoz anastomoz kaçağı3sonra komplikasyon en korkunç. Her ne kadar anastomoz kaçağı ile ilişkili çeşitli risk faktörleri belirlenmiştir, sızıntıyı önlemek için çözümler bilinmeyen4,5kalır.

Stromal hücreler (ASCs) Yağ dokusundan elde edilen adaylar rejeneratif terapiler8için umut verici bu hücreler kılan anti-enflamatuar ve trofik özellikleri6,7ile ilişkilidir. Doku iyileşmesine katkıda bulunmak üzere ASCs etkinliğini kalp kası, cilt ve özofagus9,10,11,12,13gibi çeşitli dokularda gösterildi. Ancak, bağırsak iyileşmesine katkıda bulunmak üzere ASCs kullanımı birkaç raporları vardır. ASCs yerel nakli için deneysel kolorektal anastomoses ASC kaplı biosutures üzerinden veya seröz ASCs enjeksiyonlari14 iyileşmesinde ya hiçbir gelişme gösterdi veya anastomoz kaçağı anastomoz rağmen daha elverişli önlemek değil 15şifa.

ASCs yerel nakli süspansiyon veya ile birlikte Biyomalzeme yetersiz hücre saklama veya nakledilen hücreler11yetersiz bir dağılımı ile ilişkili olabilir. Hücre sayfa teknoloji16,17 ASC teslim18,19bir yöntem sunmaktadır. Bu nedenle, bir önceki çalışmada, bir hücrede organize hangi ASCs içinde deneysel kolorektal anastomoz20sayfa uygulanan olabilir yeni bir yaklaşımın önerilmiş. Bu çalışmada ASC sac ekimi bir sıçan modelinde kısmi kolektomi sonra kolorektal anastomoz kaçağı azaltmada başarılı olduğunu gösterdi. Bu makalede ASC levha hazırlama ve cerrahi ekimi Teknik raporlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Subkutan karın yağ dokusu tıbbi etik kurul (#MEC-2014-092), Erasmus MC Üniversitesi Tıp Merkezi, Rotterdam, Hollanda onayı ile insan bağışçılardan elde edildi. Tüm hayvan deneyleri Etik Komitesi hayvan deney, Erasmus MC Üniversitesi Tıp Merkezi, Rotterdam, Hollanda (133 / 14 / 01) tarafından kabul edildi.

1. insan ASCs yalıtım ve kültür

  1. Yalıtım orta 3 mL yağ dokusu 1 g için hazırlayın. Mix düşük glikoz Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (LG-DMEM) 10 g/L ile sığır Serum Albumin (BSA) ve 1 g/L collagenase tip 1.
  2. İnsan subkutan karın yağ dokusu teşrih (n = 8, her kadın, ortalama yaş 40 ± 9 yaşında) için küçük parçalar (0.5 cm) bir steril cerrahi bıçak büyüklüğüne 10, Adson-kahverengi doku forseps ve Metzenbaum makas içinde steril bir biyolojik SafetyCabinet kullanarak.
  3. Disseke doku steril cam medya depolama şişede depolayın. Disseke doku toplam miktarı tartmak ve hazım hazırlanan yalıtım orta (yağ dokusunun 50 g) 150 mL şişe başına yalıtım orta ile başlayın. Protokol burada disseke yağ dokusu ve yalıtım orta 4 ° C'de şişeyle gecede bir silindir karıştırıcı depolayarak duraklatılmış. Sonra şişeyi sonraki adımla devam etmeden önce ertesi gün oda sıcaklığı 25 ° C için 15 dakika prewarm.
    Not: Subkutan karın yağ dokusu, artık malzeme olarak Meme rekonstrüksiyonu ameliyat Erasmus MC Tıbbi Etik Komitesi (# MEC-200) ve davranış kuralları göre onayı ile bağış elde edildi: "doğru ikincil kullanımı İnsan doku"(< http://www.federa.org>). Arta kalan yağ dokusu sadece kim devre için ikincil kullanım dışı değil bağışçılardan kullanılmıştır.
  4. Bir shaker-kuluçka 150 devir/dakika ve 37 ° C için 1 h steril cam medya depolama şişedeki disseke yağ dokusu sindirmek.
  5. 50 mL tüpler içine sindirilmiş çözüm bölmek ve tüpler için 390 x g, 10 dk santrifüj kapasitesi.
  6. Kültür ortamı hazırlamak: LG-DMEM % 10 fetal Sığır serum (FBS), 50 µg/mL gentamisin ve 1,5 µg/mL ampothericin B. ile desteklenmiş
  7. Santrifüjü süpernatant kaldırmak ve hücre Pelet kültür orta (LG-DMEM % 10 fetal Sığır serum (FBS), 50 µg/mL gentamisin ve 1,5 µg/mL ampothericin B ile desteklenmiş) 20 ml resuspend. Hücreleri 390 x g de 5 min için tekrar santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın.
  8. Hücre Pelet 10 mL kültür orta (LG-DMEM %10 FBS, 50 µg/mL gentamisin ve 1,5 µg/mL ampothericin B) ile resuspend ve hücre süspansiyon 100 µm filtre.
  9. (Kırmızı kan hücre lizis için) %3 asetik asit/metilen blue çözümü 50 µL hücre süspansiyon 50 µL için çözüm karışımı ekleyip 10 µL hücreleri saymak için kullanabilirsiniz. Hücre hemasitometre ile sayım gerçekleştirin. O zaman 40.000 hücreleri/cm2 ' kültür orta (LG-DMEM %30 FBS, 50 µg/mL gentamisin ve 1,5 µg/mL ampothericin B) yoğunluğu, hücreleri plaka.
  10. %5 CO2 24 h için nemli bir ortamda 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.
  11. Kuluçka, yıkama sıcak (37 ° C) fosfat içeren hücreleri ile serum fizyolojik (PBS) hücre artıkları kaldırmak ve medya ile % 10 FBS kültür orta değiştirmek için ara belleğe alınmış taze takip askorbik asit-2-fosfat (25 µg/mL) ve insan rekombinant fibroblast büyüme eklendi faktör 2 (FGF2, 1 ng/mL).
  12. % 90 izdiham standart % 0.25 tripsin EDTA çözüm (bir T175 şişesi için 3 mL) kullanarak, alt kültür ASCs. 3-5 dk sonra kültür orta (LG-DMEM %10 FBS, 50 µg/mL gentamisin ve 1,5 µg/mL ampothericin B) 10 mL % 0.25 tripsin EDTA çözümle etkisiz hale getirin.
    Not: Akış Sitometresi Analizi ortak ASC yüzey işaretleyicileri ve tri-lineage farklılaşma deneyleri daha önce gerçekleştirilmiş ve ASCs bu görüntülenen iletişim kuralı ASC belirli özellikleri21,22kullanarak izole ortaya.
  13. 10 mL (%10 FBS, 50 µg/mL gentamisin ve 1,5 µg/mL ampothericin B LG-DMEM takviye) bir T175 şişesi için kültür ortamının hücrelerle yıkama ve 250 x g. Kaldır, 8 dk için hücreleri süpernatant santrifüj kapasitesi ve kültür orta 1 mL hücrelerde resuspend. Bir hemasitometre içeren hücreleri saymak.
  14. T175 kültür şişeler 8.000 hücreler/cm2yoğunluğu, hücrelerde plaka.
  15. Kalan ASCs % 10 dimetil sülfoksit (DMSO) ile sıvı azot kültür orta daha fazla kullanımdan önce dondurmak.

2. ASC levha hazırlama

  1. Termo-yanıt veren Kültür yemekleri (3,5 cm çapında) önceden FBS 1 mL ile kat sonra hücre tohum önce bulaşıkları 37 ° C'de bir kuluçka için en az 30 dakika yerleştirin.
  2. 3-5 dk (3 mL T175 kültür şişesi için) için standart %0.25 tripsin EDTA çözeltisi kullanarak ASCs trypsinize. Trypsinization sonra herhangi bir hücre kümeleri varsa, hücreleri sayma önce 100 µm filtreden filtre.
  3. Tripsin çözüm nötralize LG-DMEM % 10 ile desteklenmiş FBS (bir T175 şişesi için 10 mL) ve santrifüj hücre süspansiyon 250 x g., 8 dk süpernatant kaldırmak ve LG-DMEM % 10 ile desteklenmiş 1 mL hücrelerde resuspend FBS.
  4. Termo-yanıt veren Kültür yemekleri FBS ile kaplama sonra bulaşıkları 37 ° C'de ısınma bir tabak da kuluçka geçmek ve yemek FBS kaldırın.
  5. Tohum ASCs 400.000 hücre/cm2 (toplamda, kültür orta çanağı başına 2 ml sulandırılmış 3.52 × 106 hücre).
  6. Dikkatli bir şekilde hücreleri mümkün olduğunca eşit yavaşça çanak sallanan tarafından dağıt.
  7. Kültür ASC sayfaları %5 CO2ile nemli bir ortamda 37 ° C'de 48 h için.
    Not: ASCs ASC sayfası oluşumu ile müdahale ya da kurulan ASC yaprak erken dekolmanı neden sıcaklık damla önlemek için tohum sonra da kuluçka kapıyı açmak en aza indirmek deneyin.

3. kısmi kolektomi ve kolorektal anastomoz

  1. Neden ve erkek Wistar farelerle (vezin 250-350 g arasında) 1 L/dk isoflurane korumak (1.5-5%)/oxygen inhalasyon ve 0,05 mg/kg buprenorfin intramüsküler enjekte.
  2. Hayvanlar genel anestezi altında olduğunda, anestezik derinlik refleks testi kullanarak değerlendirmek. A vitamini içeren göz merhem kuruluğu önlemek için gözler için geçerlidir. Anestezi ameliyat için yeterli olduğu düşünüldüğünde, aseptik karın tüyleri tıraş ve cerrahi alan iki kez % 70 etanol ile püskürtme hazırlayın. Karın ile steril kağıt perdeleri asmak. Aseptik bir tekniği kullanır ve steril alan bütün cerrahi işlem sırasında sahip.
  3. Karın bir ensizyon 5 cm steril cerrahi bıçak büyüklüğüne 10 ile yapmak ve belgili tanımlık kesme Metzenbaum makasla genişletmek. Tanımlamak ve iki nokta üst üste exteriorize ve karın boşluğu ile serum fizyolojik ıslatılmış gauzes kalan iki nokta üst üste pack. Doğru orta tanımlamak ve kolik arterler bıçaklanmasından yaptı, açık açık Halsted sivrisinek kullanarak her araç incelemek ve her bireysel araç absorbe olmayan örgülü ipek 4/0 ile ligate.
  4. Kolon segment 1.0 cm aborally çekum ve kaudal mezenterik arter yukarıda 0.5 cm arasında izole et. Metzenbaum makas kullanarak sağlıklı kolon transect. Kolon segment rezeksiyonundan sonra iki nokta üst üste proksimal ve distal ucunun iki uzun pamuk temizleme bezi trans-anally distal kolon aracılığıyla ve proksimal kolon sonuna içine tanıtarak birleştirin.
  5. Cerrahi mikroskop kullanarak, tek katmanlı 5 kesintiye uğramış dikiş (absorbe olmayan monofilament poliamid 8/0) kullanarak dikiş ters çevirme tarafından yeterince dikilmiş bir uçtan uca anastomoz oluşturun. Tüm Katmanlar iki nokta üst üste duvarın üzerinden kesilen dikiş yeri ve deniz mili extraluminally getirin.
  6. Fareler rasgele kontrol ve ASC sayfa grubu ayırmak.

4. ASC sac ekimi

  1. Oda sıcaklığında 40dakika vivo içinde nakli ASC sayfası dekolmanı kolaylaştırmak için önce soğumasını kültür yemekleri izin.
    Not: dekolmanı sonra ASC sayfaları yaklaşık 2 cm çapında daraltmak. ASC sayfası canlılığı sonra dekolmanı20en az 3-6 h için yüksek kalır.
  2. Çıkarmak belgili tanımlık kültür orta ve 1 mL serum ile ücretsiz LG-DMEM değiştir.
  3. Yavaşça ASC sac jant atravmatik forseps ile kapmak ve anastomoz hattı üzerine ASC sayfanın çanak tarafına yerleştirin.
  4. Dikkatlice streç ASC dışarı yaklaşık 0.25 cm üstündeki ve altındaki anastomoz hattı atravmatik forseps ve şal sayfanın çevresinde iki nokta üst üste ile levha. İki nokta üst üste şal ASC sayfası dorsal yan etrafında kadar kaldır.
    Not: ASC sayfaları kendiliğinden anastomoz hattına uygun, doku yapıştırıcı kullanmaya gerek yok veya herhangi bir diğer biomaterial. Kontrol grubunda herhangi bir ek tedavi almaz.
  5. Pamuk temizleme bezi kaldırmak ve değişmek belgili tanımlık eldiven ve aletler. Kolon karın değiştirin. Kapat karın-linea alba kullanarak dikiş absorbe çalışan bir tabaka ile Poliglikolik Asit 5/0 örgülü. Subkutiste ve dikiş absorbe örgülü Poliglikolik Asit 5/0 kullanarak çalışan bir katmanda birlikte cutis dikiş.

5. ameliyat sonrası değerlendirme ve takip

  1. Hemen 5 mL sıcak salin Subkutan Enjeksiyon hayvanlarla postoperatively suyla temasa. Vücut ısısını korumak ve hayvanlar sternal recumbency korumak için yeterli kendine gelmek kadar hayati belirtileri izlemek için a ısı lamba altında hayvanlar koyun.
    Not: ameliyat geçirmiş hayvanlar tamamen iyileşti kadar diğer hayvanlar şirkete iade. Sonra kurtarma, normal fare yemek ve su ücretsiz erişim sağlar. Ameliyat sonrası ağrı yardım için 0,05 mg/kg buprenorfin subkutan her 6-8 h 3 gün boyunca yönetmek. Hiçbir antibiyotikler bu çalışmada herhangi bir zamanda idare.
  2. Günlük klinik değerlendirme sağlık ve kilo almak. Bir çok düşük sağlık puan veya şiddetli kilo kaybı, hayvanlar tarafından hala iken anestezi altında kalp ponksiyon yoluyla kan kaybı euthanized.
  3. Ameliyat sonrası günde 3 ya da gün 7, 1 L/dk isoflurane tekrar farelerle anestezi (1.5-5%)/oxygen inhalasyon buprenorfin, olmadan ve re-laparatomi U şeklinde bir kesi ile gerçekleştirin. Karın peritonit, yapışıklıkları, fibröz yapışıklıklar ve abse varlığı belirtileri için kontrol edin. Yapışıklıklar şiddeti puan ve karın ve anastomoz bölgesinde apse.
  4. Kolon anastomoz dahil olmak üzere kapalı bir parçasını hava üfleme tarafından anastomoz patlama basıncı belirler. Ne zaman ilk hava sızıntı basınç patlama olarak hava basıncı ve rüptür yerinin kaydedin.
  5. Kurban her hayvandan iki nokta üst üste kaldırmak - kolorektal anastomoz içeren - kolon kesme parçasını ile ve %4 arabelleğe alınmış formaldehit, gömme ve iki nokta üst üste 4 mikron kalınlığında bölümlere kesme parafin tarafından takip düzeltin.
  6. Süre hayvan anestezi altında kan kaybı kalp ponksiyon yoluyla tarafından doğrudan anastomoz segment toplandıktan sonra ötenazi. Hayvan ölüm hareketi ve Kalbi nefes yokluğu ile onaylayın.
  7. Hematoksilen ve eozin ve Picro Sirius kırmızı gibi histochemical stainings ve immunohistokimyasal stainings karşı insan mitokondri, sıçan endotel hücreleri (anti-CD34) ve hücreleri (CD3 +, CD163 +) bağışıklık sisteminin antikor ile gerçekleştirin.
  8. Bilgisayarlı analiz slaytlarını digitalize ve hayvan grupları karşılaştırın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ASC sayfası kültür ve kolon rezeksiyonu ve anastomoz prosedürü tasvir eden bu çalışmanın bir akış şeması Şekil 1' de gösterilen. Şekil 2 ASC sayfası mikroskobik Morfoloji ve sırasında ve dekolmanı sonra ASC sayfası makroskopik görünümü gösterir. Şekil 3 ASC sayfası dekolmanı ve nakli farklı adımları gösterir. Şekil 4 postoperatively 3 gün ASC sayfası anastomoz hattı ve Önleme gelen sızıntı varlığı gösterir.

Kolorektal anastomoz değerlendirme için izin takip süresi. Farklı değerlendirmeler rakamlar ve tablo gösterilir. Denetim hayvanlar için karşılaştırıldığında, transplante hayvan grupları sık anastomoz yırtılması ve kaçak postoperatif günde 3 daha az ve daha az sık apse oluşumu postoperatif günde 7 gösterdi. Denetim hayvanlar için karşılaştırıldığında, transplante hayvanlar önemli yapışıklıklar veya yapışıklıkları oluşumu geliştirmek mi değil. Tablo 1 transplante ve sigara nakledilmektedir hayvanlarda dönemleri takip sonunda makroskopik bulgular gösterir.

Figure 1
Şekil 1: çalışma akış şeması. A) ASCs izole ve termo-yanıt veren Kültür yemekleri tohum önce genişletilmiş. ASCs 400.000 hücre/cm2 bir yoğunluk tohumlari ve nakli önce 48 saat için kültürlü. Nakli günü, ASC sayfası Müstakil Oda sıcaklığında 30 dk. B soğumasını termo-yanıt veren Kültür çanak izin vererek) düzeninin cerrahi işlem; gemileri temin ligasyonu sonra kısmi kolektomi ve kolorektal anastomoz yapılır. Bir ASC sayfası ASC sayfa grubunda anastomoz etrafında sarılı idi; a) caecum, b) terminal ileum, c) anüs. Cerrahi işlem şematik bakış kısmen Wu Z. ve arkizniyle uyarlanmıştır. 24 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: ASC sayfası önce ve sonra dekolmanı. A) ASC sayfası termo-yanıt veren Kültür yemekleri kültür 40 x büyütme 48 saat sonra. ASC yaprak ASCs ticari termo-yanıt veren Kültür yemekleri kültür tarafından elde edilmiştir. B-C) ASC sayfası (B) sırasında ve dekolmanı (C) sonra. Termo-yanıt veren Kültür yemekleri oda sıcaklığına soğuması için izin verildi zaman ASC sayfa kendiliğinden bir bozulmamış ASC sayfası olarak çanak yüzeyinden ilişkisi kesildi. Enzimatik tedavi gerekli. Dekolmanı sonra ASC sayfasının boyutu küçülür. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: ASC sac ekimi. A) ASC sayfa yönlendirmesini termo-yanıt veren kültür tabağına tasviri. 26 B) ASC yönlendirme sayfadan sonra nakli. ASC sayfanın çanak tarafına anastomoz hattı serozal yüzey üzerine yerleştirilir (anastomoz hattı haç ile belirtilir). C) intraoperatif sayısı nakli farklı adımları. İki atravmatik forseps ASC tabaka Asansör ve anastomoz hattı sarmak için kullanılmıştır. Beyaz okları ASC sayfası konumu gösterir. Nakli görüntülerini kısmen Sukho, s., ve arkizniyle uyarlanmıştır. 20 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: kolorektal anastomoz makroskopik ve histolojik değerlendirme. A-B) kontrol grubuna kıyasla, makroskopik gözlem gösterdi azaltılmış kaçağı ve apse oluşumu ameliyat sonrası günde 3 (A) ve 7 (B), anılan sıraya göre. Beyaz ok anastomoz yerinin gelin ve siyah okları transplante ASC sayfaları gelin. H & E. ile lekeli transplante hayvanlarda kolorektal anastomoz sitesinin C) temsilcisi kesit Sayfa yapısı anastomoz sitesinde kurmak için 7 gün postoperatively belirlenmiştir. Görüntüler Sukho, s., ve arkizniyle kısmen adapte edildi. 20 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Ameliyat sonrası gün 3 Ameliyat sonrası gün 7
Denetim (%) ASC sayfası (%) p-değeri Denetim (%) ASC sayfası (%) p-değeri
Peritonit 1/14(7.1) 0/14(0) NS 0/15(0) 0/14(0) NS
Anastomoz bozulma 10/14(71.4) 2/14(14.3) 0,002 3/15(20) 2/14(14.3) NS
Yapışıklıkları 2/14(14.3) 2/14(14.3) NS 2/15(13) 2/14(14.3) NS
Anastomoz apse 14/14(100) 12/14(85.7) NS 10/15(66.7) 4/14(28.6) 0,04
Anastomoz, yapışma 14/14(100) 14/14(100) NS 15/15(100) 14/14(100) NS
Başka bir yerde apse 11/14(78.5) 8/14(57.1) NS 6/15(40) 4/14(28.6) NS
Başka bir yerde yapışma 8/14(57.1) 3/14(21.42) NS 9/15(60) 7/14(50) NS

Tablo 1: Ameliyat sonrası makroskopik bulgular.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Anastomoz kaçağı birincil bir anastomoz ile kolon rezeksiyonu takiben en ciddi advers olay var. Anastomoz bozulma ve sızıntı önlemek için en iyi teknikler hala eksik. Değişen sonuçlar25,26,27ile Biyomalzeme, oluşan bir dizinin yerel uygulama yapılmıştır. Hücre tedavileri doku tamir dokusu değiştirme tarafından veya yerel parakrin salgısı ile şifa stimülasyon kolaylaştırmak için amaçtır.

Bu sıçan modelinde, ASC sac ekimi Teknik olarak başarılı oldu. Klinik ve histolojik sonra kolon rezeksiyonu ile birincil anastomoz kaçağı azaltmayı ASC sayfasının etkinliğini göstermiştir.

Kolorektal anastomoses ASC sayfasına nakli kolorektal cerrahide yeni bir yaklaşımın var. Bu çalışmada, ilk kez, yüksek yoğunluklu ASC sabıkası nakli. Seçimi bir hücre sayfası teslim ASCs için geleneksel hücre nakli teknikleri daha önce raporlanmış avantajları hücre sayfa teknoloji28,29 dayanıyordu. Buna ek olarak, ASCs için seçim anti-enflamatuar ve trofik becerileri, özellikle kalp kası ve cilt şifa11,12,19,32 gösterdi birden fazla çalışmaları temel alınmıştır .

ASC levha hazırlama ve dekolmanı zor olabilir. Bazı ASC bağış ASC yaprak zamanından önce kültür çanak müstakil ve katlanmış, bunların kullanımı engellemek. Bu çalışmada, bu belirli bağış bu sorun için kesin nedeni tanımlanmamış. Bu yana kültür orta yüksek tüketim bu bağış haberdar oldu, nükleer silahların yayılmasına karşı oranı bireysel değişimler önemli bir rol oynayabilir kabul edildi. Serum kaplama hücre adezyon yüzeye yardımcı. Hücre kültüründe dikkatli dağıtım ile birlikte yemek ve katlama daha az (sıcaklık damla önlenmesi) ASCs, ASC yaprak tohum sonra kuluçka kapı açılışı minimize oluştu. Bu şekilde, tüm bağış sayfalarından ASC başarıyla, teknik fizibilite teyit nakledilen.

Nakli günü, çoğu ASC sayfaları kendiliğinden oda sıcaklığına kadar soğumasını termo-yanıt veren Kültür çanak izin sonra ilişkisi kesildi. Ancak, yaprak sınırlı sayıda tam ayırmaz. Kültür çanak veya yumuşak bir pipet sonunda kullanarak RIM kızarma nazik sallayarak tam dekolmanı yardımcı oldu.

Başarılı ASC sac ekimi için kolorektal anastomoses için birkaç önemli adımlar ele alınması gerekmektedir. İlk, aşırı kan anastomoz sitesinde ASC levha ve seröz yüzeyi arasında temas sağlamak için kaldırılması gerekir. İkinci olarak, ASC sayfanın çanak tarafına anastomoz serozal yüzeyinde yer almalıdır. Hasat sonra hücre yaprak işlevi hücre yüzey proteinleri ve hücre-hücre kavşak proteinler korunması nedeniyle korunur öne ise. Buna ek olarak, kendiliğinden kısa sürede serozal yüzeye bağlı kalmak için ASC sayfaları yeteneğini varlığı ile tüp bebek kültür19,20,21sırasında üretilen yatırılan ECM kolaylaştırılmış. Üçüncü olarak, ASC levha ve kolon çapı boyutunu anastomoz sitenin tam kapsama sağlamak için yakın olabilir. Daha büyük yüzeyler kaplı gerektiğinde, birkaç yaprak kullanımı kabul edilebilir.

Bu iletişim kuralı ASC levha hazırlama ve nakli için bazı sınırlamalar vardır. Termo-yanıt veren Kültür yemekleri ASC sayfası hazırlamak için kullanırken, sıcaklık kesinlikle 37 ° C'de erken dekolmanı önlemek için tüm süreci sırasında sağlanmalıdır. Nakli sonra ASC sayfası sağkalım oranı bilinmiyor. Önceki deneyler ASCs 3 gün postoperatively uygun olduğunu olsa da, 7 gün postoperatively bu ASCs mitokondrial etkinliği azalmış17. Hücre hayatta kalma oranı ve doz etkisini nakli gereken sorular gelecek çalışmalar ele önemli vardır. ASC sayfası macroscopically ve mikroskobik ameliyat sonrası değerlendirme tanımlanabilir beri gözlemci önyargı tamamen kullanılabileceği belirlenmemiştir. Transplante hayvanlar daha ameliyat sonrası belli etmedi, ancak hayvanlar17, kolorektal anastomoz değerlendirilmesi kontrol göre adezyon oluşumunu intra abdominal bu yapışıklıklar varlığı ile engel.

Bu uygulama teknik avantajı basit ve gerçekleştirmek kolay olmasıdır. Sadece küçük bir miktar pratik ve evrensel atravmatik forseps kullanarak ile bağırsak cerrahlar-meli muktedir ASC sayfası anastomoz etrafında sarın. Buna ek olarak, ASC sayfaları hemen ev sahibi dokulara uygun beri ameliyat süresi büyük ölçüde etkilenmez. Ayrıca, ASC sayfaları kullanırken, hiçbir sentetik biomaterial bir yabancı cisim reaksiyonu riskini en aza indirmek vücutta kalır.

Transplante ASCs hücre çarşaflarda organize kolorektal anastomoz kaçağı azaltmak için yeteneklerini gösterdi. İçinde görüş-in bunlar sonuçlar umut verici, gelecekteki çalışmaları için her iki uzun vadeli etkileri değerlendirmek için yapılmalıdır tedavi ve güvenlik nedeniyle. Bunun yanı sıra, ASC yaprak overexpression vasküler endotelyal büyüme faktörü30inducing gibi tedavi edici etkileri değiştirmek için birkaç yöntem tarif edilmiştir. Bu yöntemler ASC sayfalarını kullanarak doku onarımı daha da artırabilir ve gelecekte çalışmalar düşünülmelidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar araştırma potansiyel bir çatışması olarak yorumlanamaz herhangi bir ticari veya mali ilişki yokluğunda yapılmıştır bildirin.

Acknowledgments

Yazarlar, Prof. Dr. S.E.R. Hovius, Dr. M.A.M. Mureau ve Plastik Cerrahi Anabilim Dalı deri altı yağ dokusu toplanması için tüm cerrahlar için minnettarız. P. Sukho çalışma yürütülmesi sırasında Hollanda Fellowship programı (NFP-12/435), hibe tarafından desteklenmektedir. Y.M. Bastiaansen-Jenniskens hibe Hollandalı Artrit Vakfı (LP11) tarafından desteklenmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LG DMEM Gibco, Life technologies 22320022 ASC isolation and culture
Collagenase type I Gibco, Life technologies 17100-01 ASC Isolation
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9418 ASC Isolation
Fetal bovine serum Gibco, Life technologies 10270-106 FBS, ASC isolation and culture
3% acetic acid with methylene blue Stemcell Technologies 7060 ASC Isolation
Gentamicin Gibco, Life technologies 15750-037 ASC isolation and culture
Ampothericin B Gibco, Life technologies 15290-018 ASC isolation and culture
Shaker (Gallenkamp Environmental Shaker Model 10X 400) Akribis Scientific F240 ASC Isolation
Centrifuge Hettichlab Rotina380 ASC isolation and culture
Phosphate buffer saline Gibco, Life technologies 14190-094 PBS, ASC isolation and culture
Ascorbic acid-2-phosphate Sigma-Aldrich A8960 ASC isolation and culture
Human recombinant fibroblast growth factor 2 AbD Serotec AF-100-15 FGF2, ASC isolation and culture
Trypsin EDTA Gibco, Life technologies 25200-056 ASC culture
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2650-5x DMSO, ASC freezing
Thermo-responsive culture dishes Nunc Thermo scientific 174904 ASC sheet preperation
Non-absorbable braided silk 4/0 B Braun 21151042 surgery
Non-absorbable monofilament polyamide 8/0 B Braun G1118170 surgery
Absorbable braided polyglycolic acid 5/0 B Braun C1048207 surgery

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kawahara, H., et al. Single-incision laparoscopic right colectomy for recurrent Crohn's disease. Hepatogastroenterology. 57, (102-103), 1170-1172 (2010).
  2. Saia, M., Buja, A., Mantoan, D., Agresta, F., Baldo, V. Colon Cancer Surgery: A Retrospective Study Based on a Large Administrative Database. Surg Laparo Endo Per. 26, (6), e126-e131 (2016).
  3. Snijders, H. S., et al. Meta-analysis of the risk for anastomotic leakage, the postoperative mortality caused by leakage in relation to the overall postoperative mortality. Eur J Surg Oncol. 38, (11), 1013-1019 (2012).
  4. Daams, F., Luyer, M., Lange, J. F. Colorectal anastomotic leakage: aspects of prevention, detection and treatment. World J Gastroentero. 19, (15), 2293-2297 (2013).
  5. Testini, M., et al. Bovine pericardium patch wrapping intestinal anastomosis improves healing process and prevents leakage in a pig model. PLoS One. 9, (1), e86627 (2014).
  6. Kilroy, G. E., et al. Cytokine profile of human adipose-derived stem cells: expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors. J Cell Physiol. 212, (3), 702-709 (2007).
  7. Mussano, F., et al. Growth Factor Profile Characterization of Undifferentiated and Osteoinduced Human Adipose-Derived Stem Cells. Stem Cells Int. 6202783 (2017).
  8. Hassan, W. U., Greiser, U., Wang, W. Role of adipose-derived stem cells in wound healing. Wound Repair Regen. 22, (3), 313-325 (2014).
  9. Shudo, Y., et al. Addition of mesenchymal stem cells enhances the therapeutic effects of skeletal myoblast cell-sheet transplantation in a rat ischemic cardiomyopathy model. Tissue Eng Pt A. 20, (3-4), 728-739 (2014).
  10. Otsuki, Y., et al. Adipose stem cell sheets improved cardiac function in the rat myocardial infarction, but did not alter cardiac contractile responses to beta-adrenergic stimulation. Biomed Res. 36, (1), 11-19 (2015).
  11. Hamdi, H., et al. Epicardial adipose stem cell sheets results in greater post-infarction survival than intramyocardial injections. Cardiovasc Res. 91, (3), 483-491 (2011).
  12. Cerqueira, M. T., et al. Human adipose stem cells cell sheet constructs impact epidermal morphogenesis in full-thickness excisional wounds. Biomacromolecules. 14, (11), 3997-4008 (2013).
  13. Perrod, G., et al. Cell Sheet Transplantation for Esophageal Stricture Prevention after Endoscopic Submucosal Dissection in a Porcine Model. PLoS One. 11, (3), e0148249 (2016).
  14. Pascual, I., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells in biosutures do not improve healing of experimental colonic anastomoses. Brit J Surg. 95, (9), 1180-1184 (2008).
  15. Yoo, J. H., et al. Adipose-tissue-derived Stem Cells Enhance the Healing of Ischemic Colonic Anastomoses: An Experimental Study in Rats. J Korean Soc Coloproctol. 28, (3), 132-139 (2012).
  16. Okano, T. Cell sheet engineering. Rinsho Shinkeigaku. 46, (11), 795-798 (2006).
  17. Chen, G., et al. Application of the cell sheet technique in tissue engineering. Biomed Rep. 3, (6), 749-757 (2015).
  18. Labbe, B., Marceau-Fortier, G., Fradette, J. Cell sheet technology for tissue engineering: the self-assembly approach using adipose-derived stromal cells. Methods Mol Biol. 702, 429-441 (2011).
  19. Sukho, P., et al. Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet Application for Tissue Healing In Vivo: A Systematic Review. Tissue Eng Part B-Re. (2017).
  20. Sukho, P., et al. Effects of adipose stem cell sheets on colon anastomotic leakage in an experimental model: Proof of principle. Biomaterials. 140, 69-78 (2017).
  21. Verseijden, F., et al. Angiogenic capacity of human adipose-derived stromal cells during adipogenic differentiation: an in vitro study. Tissue Eng Pt A. 15, (2), 445-452 (2009).
  22. Sukho, P., et al. Effect of Cell Seeding Density and Inflammatory Cytokines on Adipose Tissue-Derived Stem Cells: an in Vitro Study. Stem Cell Rev. 13, (2), 267-277 (2017).
  23. Surface, N. U. Cell Harvesting by Temperature Reduction. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/AppNote-Nunc-UpCell-N20230.pdf (2008).
  24. Wu, Z., et al. Colorectal anastomotic leakage caused by insufficient suturing after partial colectomy: a new experimental model. Surg Infect (Larchmt). 15, (6), 733-738 (2014).
  25. Wu, Z., et al. Reducing colorectal anastomotic leakage with tissue adhesive in experimental inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 21, (5), 1038-1046 (2015).
  26. Servier. Smart servier medical art. http://smart.servier.com (2017).
  27. Wu, Z., et al. Reducing anastomotic leakage by reinforcement of colorectal anastomosis with cyanoacrylate glue. Eur Surg Res. 50, (3-4), 255-261 (2013).
  28. Aysan, E., Dincel, O., Bektas, H., Alkan, M. Polypropylene mesh covered colonic anastomosis. Results of a new anastomosis technique. Int J Surg. 6, (3), 224-229 (2008).
  29. Suarez-Grau, J. M., et al. Fibrinogen-thrombin collagen patch reinforcement of high-risk colonic anastomoses in rats. World J Gastrointest Surg. 8, (9), 627-633 (2016).
  30. Kobayashi, J., Okano, T. Fabrication of a thermoresponsive cell culture dish: a key technology for cell sheet tissue engineering. Sci Technol Adv Mat. 11, (1), 014111 (2010).
  31. Elloumi-Hannachi, I., Yamato, M., Okano, T. Cell sheet engineering: a unique nanotechnology for scaffold-free tissue reconstruction with clinical applications in regenerative medicine. J Intern Med. 267, (1), 54-70 (2010).
  32. Miyahara, Y., et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nat Med. 12, (4), 459-465 (2006).
  33. Makarevich, P. I., et al. Enhanced angiogenesis in ischemic skeletal muscle after transplantation of cell sheets from baculovirus-transduced adipose-derived stromal cells expressing VEGF165. Stem Cell Res Ther. 6, 204 (2015).
Bir sıçan modelinde kısmi kolektomi sonra kaçağı azaltmak için Yağ dokusundan elde edilen kök hücre sayfasının nakli
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sukho, P., Boersema, G. S. A., Kops, N., Lange, J. F., Kirpensteijn, J., Hesselink, J. W., Bastiaansen-Jenniskens, Y. M., Verseijden, F. Transplantation of Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet to Reduce Leakage After Partial Colectomy in A Rat Model. J. Vis. Exp. (138), e57213, doi:10.3791/57213 (2018).More

Sukho, P., Boersema, G. S. A., Kops, N., Lange, J. F., Kirpensteijn, J., Hesselink, J. W., Bastiaansen-Jenniskens, Y. M., Verseijden, F. Transplantation of Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet to Reduce Leakage After Partial Colectomy in A Rat Model. J. Vis. Exp. (138), e57213, doi:10.3791/57213 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter