Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Transplantation av fettvävnad-Derived stamceller blad att minska läckage efter partiell kolektomi i en råtta modell

Published: August 11, 2018 doi: 10.3791/57213
Automatic Translation
1,2,3, 4, 5, 4, 1,6, 1, 5, 1,5
1Department of Clinical Sciences of Companion Animals, Faculty of Veterinary Medicine, Utrecht University, 2Department of Otorhinolaryngology, Erasmus MC University Medical Center, 3Department of Clinical Sciences and Public Health, Faculty of Veterinary Science, Mahidol University, 4Department of Surgery, Erasmus MC University Medical Center, 5Department of Orthopaedics, Erasmus MC University Medical Center, 6Hill's Pet Nutrition Inc.

Summary

Förberedelse och transplantation av fettvävnad som härrör stamceller (ASC) ark på otillräckligt sys kolorektal anastomoser i en råtta modell presenteras. Den här romanen applikationen visar att ASC ark kan minska kolorektal anastomos läckage.

Abstract

Anastomotic läckage är en katastrofal komplikation efter kolorektal kirurgi. Även nuvarande metoder för förebyggande av läckage har olika nivåer av klinisk effekt, är de förrän nu ofullkomlig lösningar. Stamcellsterapi använda ASC ark kan ge en lösning på problemet. ASCs betraktas som lovande kandidater för att främja vävnad healing på grund av deras trofiska och immunmodulerande egenskaper. Här, tillhandahåller vi metoder för att producera hög densitet ASC-ark, som transplanteras till en kolorektal anastomos i en råtta modell att minska läckaget. ASCs bildade cell ark i thermo-lyhörd kultur rätter som enkelt kan tas loss. På dagen för transplantation utfördes en partiell kolektomi med en 5-sutur kolorektal anastomos. Djur transplanterades omedelbart med 1 ASC ark per råtta. ASC ark följs spontant anastomos utan någon lim, sutur eller någon biomaterial. Djurgrupper offrades 3 och 7 dagar postoperativt. Jämfört med transplanterade djur, var incidensen av anastomotic bölder och läckage högre i kontrolldjur. I vår modell, transplantation av ASC ark efter kolorektal anastomos var lyckad och associerad med en lägre läckage.

Introduction

Partiell kolektomi med en primär anastomos är en vanligen utförs operation som kan göras för många sjukdomar som påverkar tjocktarmen som kolorektal cancer, Crohns sjukdom och divertikulit1,2. Mest fruktade komplikationen efter kolorektal anastomos är anastomotic läckage3. Även om flera riskfaktorer associerade med anastomotic läckor har identifierats, fortfarande lösningar för att förhindra läckage okänt4,5.

Fettvävnad-derived stromaceller (ASCs) är associerade med antiinflammatoriska och trofiska egenskaper6,7, vilket gör dessa celler lovande kandidater för regenerativ terapier8. Effektiviteten i ASCs att främja läkning av vävnad visades i olika vävnader såsom hjärtmuskulatur, hud och matstrupe9,10,11,12,13. Men finns det några rapporter om användningen av ASCs att främja tarmens läkning. Lokala transplantation av ASCs till experimentella kolorektal anastomoser via ASC-belagd biosutures eller serös injektioner av ASCs visade antingen ingen förbättring i healing14 eller hindrade inte anastomotic läckage trots en gynnsammare anastomotic Healing15.

Lokala transplantation av ASCs i suspension eller kombineras med biomaterial kan vara associerad med otillräcklig cell lagring eller en otillräcklig fördelning av transplanterade celler11. Cell ark teknik16,17 erbjuder en innovativ metod för ASC leverans18,19. Därför, i en tidigare studie, en ny metod föreslogs i vilken ASCs organiserade i en cell blad skulle kunna tillämpas på experimentell kolorektal anastomos20. Denna studie visade att ASC ark transplantation är framgångsrik i att minska kolorektal anastomos läckage efter partiell kolektomi i en råtta modell. Denna artikel redovisar ASC blad beredning och kirurgisk transplantation teknik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Subkutan buken fettvävnad erhölls från mänskliga donatorer med godkännande av medicinsk etisk kommitté (#MEC-2014-092), Erasmus MC University Medical Center, Rotterdam, Nederländerna. Alla djurförsök godkändes av den etiska kommittén av djur experiment, Erasmus MC University Medical Center, Rotterdam, Nederländerna (133-14-01).

1. mänskliga ASCs isolering och kultur

  1. Förbered 3 mL isolering medium för 1 g av fettvävnad. Mix låg glukos Dulbecco's modifierade örnens medium (LG-DMEM) med 10 g/L bovint serumalbumin (BSA) och 1 g/L kollagenas typ 1.
  2. Dissekera mänskliga subkutan buken fettvävnad (n = 8, alla kvinnliga, genomsnittlig ålder 40 ± 9 år gammal) i små bitar (0,5 cm) med en sterila kirurgiska bladet storlek 10, Adson-brun vävnad pincett och Metzenbaum sax i en steril biologiska SafetyCabinet.
  3. Lagra dissekerade vävnaden i en steril glasflaska media lagring. Väger den totala mängden dissekerade vävnad och börja matsmältningen med förberedda isolering medium (50 g av fettvävnad med 150 mL isolering medium per flaska). Protokollet kan pausas här genom att lagra flaskan med dissekerade fettvävnad och isolering medium vid 4 ° C på en rulle mixer över natten. Sedan prewarm flaskan nästa dag i rumstemperatur 25 ° C under 15 minuter innan du fortsätter med nästa steg.
    Obs: Subkutan buken fettvävnad erhölls som överblivet material från donatorer som genomgår Bröstkirurgi återuppbyggnad med godkännande av Erasmus MC medicinsk etiska kommittén (# MEC-200) och enligt uppförandekoden: ”korrekt sekundär användning av mänsklig vävnad ”(< http://www.federa.org>). Överblivna fettvävnad användes endast från givare som inte avanmäla dig till sekundär användning.
  4. Smälta dissekerade fettvävnaden i en steril media lagring glasflaska i en shaker-inkubator vid 150 rpm och 37 ° C i 1 h.
  5. Dela upp smält lösningen i 50 mL rör och centrifugera rören för 10 min vid 390 x g.
  6. Förbereda odlingssubstratet: LG-DMEM kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS), 50 µg/mL gentamicin och 1,5 µg/mL ampothericin B.
  7. Efter centrifugeringen, avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 20 mL odlingsmedium (LG-DMEM kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS), 50 µg/mL gentamicin och 1,5 µg/mL ampothericin B). Centrifugera cellerna igen för 5 min vid 390 x g och avlägsna supernatanten.
  8. Återsuspendera cellpelleten med 10 mL odlingsmedium (LG-DMEM kompletteras med 10% FBS, 50 µg/mL gentamicin och 1,5 µg/mL ampothericin B) och filtrera cellsuspensionen genom en 100 µm filter.
  9. Tillsätt 50 µL 3% ättiksyra/methylene blå lösning (för röd blod cell lysis) i 50 µL cellsuspension, blanda lösningen och använda 10 µL för att räkna cellerna. Utföra cell räknar med en hemocytometer. Sedan tallrik cellerna på en täthet av 40 000 celler/cm2 i odlingsmedium (LG-DMEM kompletteras med 30% FBS, 50 µg/mL gentamicin och 1,5 µg/mL ampothericin B).
  10. Inkubera cellerna vid 37 ° C i en fuktig atmosfär med 5% CO2 för 24 h.
  11. Efter inkubering, tvätta cellerna med varmt (37 ° C) fosfat buffrad saltlösning (PBS) för att ta bort cellfragment och ersätta media med 10% FBS odlingsmedium med nymalen lagt askorbinsyra-2-fosfat (25 µg/mL) och humant rekombinant fibroblast tillväxt faktor 2 (FGF2, 1 ng/mL).
  12. Subkultur ASCs på 90% sammanflödet med standard 0,25% trypsin EDTA-lösning (3 mL för en T175 kolv). Efter 3-5 min, neutralisera 0,25% trypsin EDTA-lösningen med 10 mL odlingsmedium (LG-DMEM kompletteras med 10% FBS, 50 µg/mL gentamicin och 1,5 µg/mL ampothericin B).
    Obs: Flöda flödescytometri analys med hjälp av vanliga ASC yta markörer och trilinjär differentiering analyser var utfört tidigare och avslöjade att ASCs isolerade använder detta protokoll visas ASC särdrag21,22.
  13. Tvätta cellerna med 10 mL odlingsmedium (LG-DMEM kompletteras med 10% FBS, 50 µg/mL gentamicin och 1,5 µg/mL ampothericin B) för en T175 kolv och centrifugera cellerna i 8 min på 250 x g. ta bort supernatanten och återsuspendera cellerna i 1 mL odlingsmedium. Räkna cellerna med en hemocytometer.
  14. Platta celler i T175 kultur kolvar med en täthet av 8 000 celler/cm2.
  15. Frysa de återstående ASCs i flytande kväve med 10% dimetyl sulfoxid (DMSO) i odlingsmedium innan fortsatt användning.

2. ASC blad beredning

  1. Pre päls thermo-lyhörd kultur rätter (3,5 cm i diameter) med 1 mL av FBS och placera sedan rätterna i en inkubator vid 37 ° C i minst 30 min före cellen sådd.
  2. Trypsinize ASCs med 0,25% trypsin EDTA standardlösning för 3-5 min (3 mL för en T175 kultur kolv). Om det finns någon cell klumpar efter trypsinization, filtrera cellerna genom en 100 µm filter innan du räknar.
  3. Neutralisera trypsin lösningen med LG-DMEM kompletteras med 10% FBS (10 mL till en T175 kolv) och centrifugera cellsuspensionen i 8 min på 250 x g. avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i 1 mL av LG-DMEM kompletteras med 10% FBS.
  4. Efter beläggning thermo-lyhörd kultur rätter med FBS, flytta rätter från inkubatorn till en värmande tallrik vid 37 ° C och ta bort FBS från skålen.
  5. Utsäde ASCs på 400 000 celler/cm2 (sammanlagt, 3.52 × 106 celler utspätt i 2 mL odlingsmedium per maträtt).
  6. Fördela noggrant cellerna så jämnt som möjligt genom att försiktigt svänga skålen.
  7. Kultur ASC ark för 48 h vid 37 ° C i en fuktig atmosfär med 5% CO2.
    Obs: Försöka minimera öppna dörren till inkubatorn efter sådd ASCs för att förhindra att temperaturen droppar som kan störa ASC blad bildande eller orsaka för tidig avlossning av bildade ASC ark.

3. partiell kolektomi och kolorektal anastomos

  1. Inducera och bibehålla manliga Wistar råttor (väger mellan 250-350 g) med 1 L/min isofluran (1.5-5%)/oxygen inandning och injicera 0,05 mg/kg buprenorfin intramuskulärt.
  2. När djuren är under narkos, bedöma bedövningsmedel djup använder reflex test. Gäller a-vitamin som innehåller ögonsalva för ögonen för att förebygga torrhet. När anestesi bedöms vara tillräcklig för kirurgi, aseptiskt förbereda buken genom rakning hårstrån och besprutning det kirurgiska området två gånger med 70% etanol. Drapera buken med steril papper draperier. Använd aseptisk teknik och bibehålla fältet sterila under hela operationstiden.
  3. Gör en mittlinjen buk snitt 5 cm med en steril kirurgiska bladet storlek 10 och förlänga snittet med Metzenbaum sax. Identifiera och exteriorize tjocktarmen och packa tjocktarmen från resten av bukhålan med saltlösning fuktade Flor. Identifiera rätt, mitten och vänster kolik artärer i tarmkäxet, rakt på sak dissekera runt varje fartyg som använder Halsted mygga och ligera varje enskilt fartyg med icke-resorberbar flätad siden 4/0.
  4. Isolera segmentet kolon mellan 1,0 cm aborally till blindtarmen och 0,5 cm ovanför den kaudala mesenterica artären. Transekt genom hälsosam kolon med Metzenbaum sax. Efter resektion av segmentet kolon, sammanföra proximala och distala ändarna av tjocktarmen genom att införa två långa bomullspinnar trans-analt genom distala kolon, och sedan in i proximala kolon slutet.
  5. Med kirurgiska Mikroskop, skapa en otillräckligt sys end-to-end-anastomos genom en-lagers Invertera suturering med 5 avbrutna suturer (icke-resorberbar monofilament polyamid 8/0). Placera de avbrutna suturerna genom alla lager av kolon väggen och placera den knop extraluminally.
  6. Dela in råttorna slumpmässigt i kontroll eller ASC ark group.

4. ASC ark Transplantation

  1. Tillåta de kultur rätterna svalna till rumstemperatur 40 min innan i vivo transplantation, att underlätta ASC kalkylblad lösgörande.
    Obs: Efter avskiljandet, ASC ark krymper till ca 2 cm i diameter. ASC ark lönsamhet förblir hög för minst 3-6 h efter avlossning20.
  2. Ta bort odlingsmedium och Ersätt det med 1 mL serum gratis LG-DMEM.
  3. Försiktigt ta fälgar av ASC arket med atraumatiska pincett och placera skålen-sida bladet ASC ovanpå anastomotic linjen.
  4. Försiktigt sträcka ut ASC blad ca 0,25 cm ovanför och nedanför anastomotic linjen med hjälp av atraumatiska pincett och wrap bladet runt tjocktarmen. Lyft tjocktarmen upp till wrap bladet ASC runt ryggsidan.
    Obs: ASC ark följer spontant anastomotic linjen, det finns ingen anledning att använda vävnad lim eller några andra biomaterial. Kontrollgruppen får inte någon ytterligare behandling.
  5. Ta bort bomullspinnar och ändra handskar och instrument. Ersätta tjocktarmen i buken. Nära buken-linea alba med ett skikt av kör suturer med resorberbara flätad polyglycolic syra 5/0. Sutur i underhuden och tillsammans i ett skikt av kör suturer med resorberbara cutis flätad polyglycolic syra 5/0.

5. postoperativ utvärdering och uppföljning

  1. Omedelbart rehydrera djuren med en subkutan injektion av 5 mL varm saltlösning postoperativt. Placera djuren under en värmelampa att upprätthålla kroppstemperaturen och övervaka vitala tills djur återfå tillräckligt medvetande för att upprätthålla sternala koordinationsrubbning.
    Obs: Djur som hade genomgått en operation var inte återvände till företaget av andra djur tills återhämtat sig helt. Efter återhämtning, Tillåt fri tillgång till vatten och vanlig råtta chow. För postoperativ smärtlindring, administrera buprenorfin 0,05 mg/kg subkutant varje 6-8 h i 3 dagar. Inga antibiotika gavs när som helst i denna studie.
  2. Få dagliga kliniska utvärderingar av wellness och vikt. Vid en mycket låg wellness poäng eller kraftig viktminskning, bör djur bli euthanized av exsanguination via hjärt punktering medan fortfarande under narkos.
  3. Postoperativ dag 3 eller dag 7, söva råttor igen med 1 L/min för isofluran (1.5-5%)/oxygen inandning utan buprenorfin, och utföra en re-laparotomi med en U-formad snitt. Kontrollera buken för tecken på peritonit, striktur, fibrösa sammanväxningar och förekomsten av bölder. Poäng svårighetsgraden av sammanväxningar och abscess både i buken och på området anastomotic.
  4. Bestämma anastomotic sprängtryck trycket av insufflation av luft i ett stängt segment av kolon inklusive anastomos. Spela in lufttrycket och förlägga av brista när den första luften läcka som sprack trycket.
  5. Ta bort tjocktarmen från varje offrade djur och fixa det skära segmentet av kolon - innehållande kolorektal anastomos - med 4% buffrad formaldehyd, efter av paraffin inbäddning och skära kolon i 4 μm tjocka sektioner.
  6. Euthanize djuren medan under narkos direkt efter insamling av segmentet anastomos av exsanguination via hjärt punktering. Bekräfta djurs död med avsaknad av andning rörlighet och ett hjärtslag.
  7. Utföra histochemical infärgning som Hematoxylin och Eosin och Picro Sirius röd och immunhistokemiska färgningar med antikroppar mot mänskliga mitokondrier, råtta endotelceller (anti-CD34) och celler i immunsystemet (CD3 +, CD163 +).
  8. Digitalisera bilder för datoriserade analys och jämför djurgrupper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ett flödesschema för denna studie som skildrar både ASC ark kultur och förfarandet för kolon resektion och anastomos visas i figur 1. Figur 2 visar ASC ark mikroskopiska morfologi och bladet ASC makroskopiska utseende under och efter avskildheten. Figur 3 visar de olika stegen i ASC kalkylblad lösgörande och transplantation. Figur 4 visar förekomsten av ASC arket på anastomotic linjen och förebyggande från läckage 3 dagar postoperativt.

Uppföljningsperioden tillåtet för kolorektal anastomos utvärdering. De olika bedömningarna som visas i figurerna och tabell. De transplanterade djurgrupper jämfört med kontrollgrupp djur, och visade mindre frekventa anastomotic sårruptur och läckage på postoperativ dag 3 och mindre frekvent abscess formation på postoperativ dag 7. Jämfört med kontrollgrupp djur, utvecklades transplanterade djur inte betydande sammanväxningar eller striktur bildandet. Tabell 1 visar de makroskopiska fynd i slutet av uppföljningen perioder hos transplanterade och icke-transplanterade.

Figure 1
Figur 1: studie flödesschema. (A) ASCs var isolerade och expanderade före sådd på thermo-lyhörd kultur rätter. ASCs var seedade på en täthet av 400 000 celler/cm2 och odlade för 48 h innan transplantation. På dagen för transplantation, ASC ark var fristående genom att låta thermo-lyhörd kultur skålen svalna till rumstemperatur i 30 min. B) stödordningen för kirurgiska ingrepp; efter ligering av leverera fartyg utförs en partiell kolektomi och kolorektal anastomos. En ASC-ark var virad runt anastomos i gruppen ASC ark; (a) blindtarmen, b) terminal ileum, c) anus. En schematisk översikt över det kirurgiska ingreppet var delvis anpassad med tillstånd från Wu Z. et al. 24 Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: ASC ark före och efter avlossning. (A) ASC blad i thermo-lyhörd kultur rätter efter 48 h av kultur 40 x förstoring. ASC ark erhölls genom odling ASCs på kommersiella thermo-lyhörd kultur rätter. B-C) ASC ark under (B) och efter avlossning (C). När de thermo-lyhörda kultur rätterna tilläts svalna till rumstemperatur, bladet ASC spontant genom utbrytning ur skålen ytan ett intakt ASC ark. Ingen enzymatisk behandling var nödvändig. Storleken på bladet ASC minskade efter avskildheten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: ASC ark transplantation. (A) skildring av ASC ark orientering i thermo-lyhörd kultur skålen. 26 B) orientering av ASC ark efter transplantation. Den skål sidan av bladet ASC placerades ovanpå serös ytan av anastomotic linjen (anastomotic linjen indikeras med korsningar). (C) intraoperativ utsikt över de olika stegen för organtransplantation. Två atraumatiska pincett användes för att lyfta upp bladet ASC och vira det runt anastomotic linjen. Vita pilar indikerar ASC ark läge. Bilder av transplantation anpassades delvis med tillstånd från Sukho, s., et al. 20 Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: kolorektal anastomos makroskopiska och histologisk utvärdering. A-B) jämfört med kontrollgruppen, makroskopiska observation visade minskat läckage och abscess bildas vid postoperativ dag 3 A och 7 B, respektive. Vita pilarna pekar på anastomotic area och svarta pilarna pekar på transplanterade ASC ark. (C) representativt tvärsnitt av webbplatsen kolorektal anastomos i transplanterade djur färgad med H & E. Den täcker strukturen kunde identifieras på webbplatsen anastomos upp till 7 dagar postoperativt. Bilderna anpassades delvis med tillstånd från Sukho, s., et al. 20 Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Postoperativ dag 3 Postoperativ dag 7
Kontroll (%) ASC ark (%) p-värde Kontroll (%) ASC ark (%) p-värde
Peritonit 1/14(7.1) 0/14(0) NS 0/15(0) 0/14(0) NS
Anastomotic störningar 10/14(71.4) 2/14(14.3) 0,002 3/15(20) 2/14(14.3) NS
Striktur 2/14(14.3) 2/14(14.3) NS 2/15(13) 2/14(14.3) NS
Abscess vid anastomos 14/14(100) 12/14(85.7) NS 10/15(66.7) 4/14(28.6) 0,04
Vidhäftning på anastomos 14/14(100) 14/14(100) NS 15/15(100) 14/14(100) NS
Abscess någon annanstans 11/14(78.5) 8/14(57.1) NS 6/15(40) 4/14(28.6) NS
Vidhäftning på andra ställen 8/14(57.1) 3/14(21.42) NS 9/15(60) 7/14(50) NS

Tabell 1: Postoperativ makroskopiska fynd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Anastomotic läckage är den allvarligaste biverkan efter kolon resektion med en primär anastomos. Optimal tekniker för att förhindra anastomotic störningar och läckage saknas fortfarande. Lokala tillämpningen av en array av biomaterial har genomförts, med varierande resultat25,26,27. Syftet med cellterapi är att underlätta vävnad reparera genom vävnad ersätter eller stimulering av lokala helande genom parakrin sekretion.

I denna råtta modell var ASC ark transplantation tekniskt lyckad. Kliniska och histologiska utvärderingar visat effektiviteten av bladet ASC minska läckage efter kolon resektion med primär anastomos.

Transplantation av en ASC-ark till kolorektal anastomoser är en ny metod i kolorektal kirurgi. I denna studie, för första gången var en hög densitet ASC ark transplanteras. Valet för ASCs levereras som en cellagret baserades på cell ark teknik28,29 tidigare rapporterade fördelar jämfört med konventionella cell transplantation tekniker. Dessutom baserades valet för ASCs på flera studier som visade deras antiinflammatoriska och trofiska förmågor, särskilt i hjärtmuskeln - och hud-helande11,12,19,32 .

ASC blad beredning och avlossning kan vara utmanande. I vissa ASC givare, ASC ark fristående tidigt från kultur skålen och vikta, utgör hinder för deras användning. I denna studie identifierades inte den exakta orsaken till detta problem i dessa specifika givare. Eftersom en hög konsumtion av odlingsmedium anmäldes i dessa givare, antogs det att individuella variationer i spridning ränta kan spela en viktig roll. Serum beläggning biträtt i celladhesion till ytan. Tillsammans med noggrann fördelning av cellerna i kulturen uppstod maträtt och minimera öppnandet av inkubator dörren efter sådd ASCs (förhindra temperatur sjunker), mindre vikning av ASC täcker. På detta sätt transplanterades ASC ark från alla givare framgångsrikt, bekräfta genomförbarheten av tekniken.

På dagen för transplantation fristående de flesta ASC ark spontant efter att thermo-lyhörd kultur skålen svalna till rumstemperatur. Ett begränsat antal ark dock inte helt loss. Milda skakningar av kultur maträtt eller mjuk spolning vid kanten med pipett till slut hjälpte komplett detachement.

För framgångsrika ASC ark transplantation till kolorektal anastomoser behöver flera kritiska steg åtgärdas. Första, överdriven blod på webbplatsen anastomos bör tas bort för att säkerställa kontakten mellan bladet ASC och serös ytan. Det andra bör skålen sidan av bladet ASC placeras på anastomos serös yta. Det antas att funktionen cell ark efter skörd upprätthålls på grund av bevarandet av cell ytproteiner och cell-till-cell korsningen proteiner. ASC ark förmåga att spontant följa serös ytan på kort tid kan dessutom underlättas av förekomsten av deponerade ECM som produceras under in vitro-kultur19,20,21. Tredje, storleken på bladet ASC och kolon diameter bör vara jämförbara att tillåta fullständig täckning av webbplatsen anastomos. När större ytor behöver täckas, kan användning av flera ark övervägas.

Det finns vissa begränsningar i detta protokoll för ASC blad beredning och transplantation. När du använder thermo-lyhörd kultur rätter för att förbereda bladet ASC, bör temperaturen strikt bibehållas vid 37 ° C under hela processen för att förhindra för tidig avlossning. Efter transplantation är ASC ark överlevnaden okänd. Även om tidigare experiment visade att ASCs var livskraftig på 3 dagar postoperativt, mitokondriell aktivitet av dessa ASCs minskades 7 dagar postoperativt17. Cell survival rate och dos effekten av transplantation är viktiga frågor som måste behandlas i framtida studier. Observatör bias kan inte helt uteslutas eftersom bladet ASC urskiljas makroskopiskt och mikroskopiskt på postoperativ utvärderingar. Även om transplanterade djur inte visade mer postoperativ kan vidhäftning bildandet jämfört för att styra djuren17, utvärdering av kolorektal anastomos hindras av närvaron av dessa intraabdominella sammanväxningar.

En fördel med denna ansökan teknik är att det är enkelt och lätt att utföra. Med endast en liten mängd av praxis och använda universal atraumatiska pincett, bör intestinal kirurger kunna Vira bladet ASC runt anastomos. Dessutom påverkas kirurgi tid inte avsevärt eftersom ASC ark omedelbart följa värd vävnader. Dessutom när du använder ASC ark, fortfarande inga syntetiska biomaterial i kroppen minimerar risken att en främmande kropp reaktion.

Transplanterade ASCs organiserade i cell ark visat sin förmåga att minska kolorektal anastomos läckage. Med tanke på dessa lovande resultat, framtida studier bör genomföras för att bedöma långsiktiga effekter både för terapeutiska och säkerhetsskäl. Förutom att har flera metoder beskrivits för att ändra de terapeutiska effekterna av ASC ark till exempel inducerande överuttryck av vaskulär endotelial tillväxtfaktor30. Dessa metoder kan ytterligare öka vävnad reparera använda ASC ark och bör beaktas i framtida studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att forskningen genomfördes i avsaknad av någon kommersiell eller finansiell relation som skulle kunna tolkas som en potentiell intressekonflikt.

Acknowledgments

Författarna är tacksam till Prof. Dr. S.E.R. Hovius, Dr M.A.M. Mureaux och alla kirurger av Institutionen för plastikkirurgi för insamling av subkutan fettvävnad. P. Sukho stöds av ett bidrag från The Nederländerna Fellowship program (NFP-12/435), under genomförandet av studien. Y.M. Bastiaansen-Jenniskens stöds genom bidrag från holländska Arthritis Foundation (LP11).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LG DMEM Gibco, Life technologies 22320022 ASC isolation and culture
Collagenase type I Gibco, Life technologies 17100-01 ASC Isolation
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9418 ASC Isolation
Fetal bovine serum Gibco, Life technologies 10270-106 FBS, ASC isolation and culture
3% acetic acid with methylene blue Stemcell Technologies 7060 ASC Isolation
Gentamicin Gibco, Life technologies 15750-037 ASC isolation and culture
Ampothericin B Gibco, Life technologies 15290-018 ASC isolation and culture
Shaker (Gallenkamp Environmental Shaker Model 10X 400) Akribis Scientific F240 ASC Isolation
Centrifuge Hettichlab Rotina380 ASC isolation and culture
Phosphate buffer saline Gibco, Life technologies 14190-094 PBS, ASC isolation and culture
Ascorbic acid-2-phosphate Sigma-Aldrich A8960 ASC isolation and culture
Human recombinant fibroblast growth factor 2 AbD Serotec AF-100-15 FGF2, ASC isolation and culture
Trypsin EDTA Gibco, Life technologies 25200-056 ASC culture
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2650-5x DMSO, ASC freezing
Thermo-responsive culture dishes Nunc Thermo scientific 174904 ASC sheet preperation
Non-absorbable braided silk 4/0 B Braun 21151042 surgery
Non-absorbable monofilament polyamide 8/0 B Braun G1118170 surgery
Absorbable braided polyglycolic acid 5/0 B Braun C1048207 surgery

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kawahara, H., et al. Single-incision laparoscopic right colectomy for recurrent Crohn's disease. Hepatogastroenterology. 57 (102-103), 1170-1172 (2010).
  2. Saia, M., Buja, A., Mantoan, D., Agresta, F., Baldo, V. Colon Cancer Surgery: A Retrospective Study Based on a Large Administrative Database. Surg Laparo Endo Per. 26 (6), e126-e131 (2016).
  3. Snijders, H. S., et al. Meta-analysis of the risk for anastomotic leakage, the postoperative mortality caused by leakage in relation to the overall postoperative mortality. Eur J Surg Oncol. 38 (11), 1013-1019 (2012).
  4. Daams, F., Luyer, M., Lange, J. F. Colorectal anastomotic leakage: aspects of prevention, detection and treatment. World J Gastroentero. 19 (15), 2293-2297 (2013).
  5. Testini, M., et al. Bovine pericardium patch wrapping intestinal anastomosis improves healing process and prevents leakage in a pig model. PLoS One. 9 (1), e86627 (2014).
  6. Kilroy, G. E., et al. Cytokine profile of human adipose-derived stem cells: expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors. J Cell Physiol. 212 (3), 702-709 (2007).
  7. Mussano, F., et al. Growth Factor Profile Characterization of Undifferentiated and Osteoinduced Human Adipose-Derived Stem Cells. Stem Cells Int. , 6202783 (2017).
  8. Hassan, W. U., Greiser, U., Wang, W. Role of adipose-derived stem cells in wound healing. Wound Repair Regen. 22 (3), 313-325 (2014).
  9. Shudo, Y., et al. Addition of mesenchymal stem cells enhances the therapeutic effects of skeletal myoblast cell-sheet transplantation in a rat ischemic cardiomyopathy model. Tissue Eng Pt A. 20 (3-4), 728-739 (2014).
  10. Otsuki, Y., et al. Adipose stem cell sheets improved cardiac function in the rat myocardial infarction, but did not alter cardiac contractile responses to beta-adrenergic stimulation. Biomed Res. 36 (1), 11-19 (2015).
  11. Hamdi, H., et al. Epicardial adipose stem cell sheets results in greater post-infarction survival than intramyocardial injections. Cardiovasc Res. 91 (3), 483-491 (2011).
  12. Cerqueira, M. T., et al. Human adipose stem cells cell sheet constructs impact epidermal morphogenesis in full-thickness excisional wounds. Biomacromolecules. 14 (11), 3997-4008 (2013).
  13. Perrod, G., et al. Cell Sheet Transplantation for Esophageal Stricture Prevention after Endoscopic Submucosal Dissection in a Porcine Model. PLoS One. 11 (3), e0148249 (2016).
  14. Pascual, I., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells in biosutures do not improve healing of experimental colonic anastomoses. Brit J Surg. 95 (9), 1180-1184 (2008).
  15. Yoo, J. H., et al. Adipose-tissue-derived Stem Cells Enhance the Healing of Ischemic Colonic Anastomoses: An Experimental Study in Rats. J Korean Soc Coloproctol. 28 (3), 132-139 (2012).
  16. Okano, T. Cell sheet engineering. Rinsho Shinkeigaku. 46 (11), 795-798 (2006).
  17. Chen, G., et al. Application of the cell sheet technique in tissue engineering. Biomed Rep. 3 (6), 749-757 (2015).
  18. Labbe, B., Marceau-Fortier, G., Fradette, J. Cell sheet technology for tissue engineering: the self-assembly approach using adipose-derived stromal cells. Methods Mol Biol. 702, 429-441 (2011).
  19. Sukho, P., et al. Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet Application for Tissue Healing In Vivo: A Systematic Review. Tissue Eng Part B-Re. , (2017).
  20. Sukho, P., et al. Effects of adipose stem cell sheets on colon anastomotic leakage in an experimental model: Proof of principle. Biomaterials. 140, 69-78 (2017).
  21. Verseijden, F., et al. Angiogenic capacity of human adipose-derived stromal cells during adipogenic differentiation: an in vitro study. Tissue Eng Pt A. 15 (2), 445-452 (2009).
  22. Sukho, P., et al. Effect of Cell Seeding Density and Inflammatory Cytokines on Adipose Tissue-Derived Stem Cells: an in Vitro Study. Stem Cell Rev. 13 (2), 267-277 (2017).
  23. Surface, N. U. Cell Harvesting by Temperature Reduction. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/AppNote-Nunc-UpCell-N20230.pdf (2008).
  24. Wu, Z., et al. Colorectal anastomotic leakage caused by insufficient suturing after partial colectomy: a new experimental model. Surg Infect (Larchmt). 15 (6), 733-738 (2014).
  25. Wu, Z., et al. Reducing colorectal anastomotic leakage with tissue adhesive in experimental inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 21 (5), 1038-1046 (2015).
  26. Servier. Smart servier medical art. , http://smart.servier.com (2017).
  27. Wu, Z., et al. Reducing anastomotic leakage by reinforcement of colorectal anastomosis with cyanoacrylate glue. Eur Surg Res. 50 (3-4), 255-261 (2013).
  28. Aysan, E., Dincel, O., Bektas, H., Alkan, M. Polypropylene mesh covered colonic anastomosis. Results of a new anastomosis technique. Int J Surg. 6 (3), 224-229 (2008).
  29. Suarez-Grau, J. M., et al. Fibrinogen-thrombin collagen patch reinforcement of high-risk colonic anastomoses in rats. World J Gastrointest Surg. 8 (9), 627-633 (2016).
  30. Kobayashi, J., Okano, T. Fabrication of a thermoresponsive cell culture dish: a key technology for cell sheet tissue engineering. Sci Technol Adv Mat. 11 (1), 014111 (2010).
  31. Elloumi-Hannachi, I., Yamato, M., Okano, T. Cell sheet engineering: a unique nanotechnology for scaffold-free tissue reconstruction with clinical applications in regenerative medicine. J Intern Med. 267 (1), 54-70 (2010).
  32. Miyahara, Y., et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nat Med. 12 (4), 459-465 (2006).
  33. Makarevich, P. I., et al. Enhanced angiogenesis in ischemic skeletal muscle after transplantation of cell sheets from baculovirus-transduced adipose-derived stromal cells expressing VEGF165. Stem Cell Res Ther. 6, 204 (2015).

Tags

Medicin fråga 138 kolektomi cellagret fettvävnad-derived stamceller stamcellstransplantation cellterapi anastomos läckage förebyggande i vivo
Transplantation av fettvävnad-Derived stamceller blad att minska läckage efter partiell kolektomi i en råtta modell
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sukho, P., Boersema, G. S. A., Kops, … More

Sukho, P., Boersema, G. S. A., Kops, N., Lange, J. F., Kirpensteijn, J., Hesselink, J. W., Bastiaansen-Jenniskens, Y. M., Verseijden, F. Transplantation of Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet to Reduce Leakage After Partial Colectomy in A Rat Model. J. Vis. Exp. (138), e57213, doi:10.3791/57213 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter