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Medicine

Transplantation de la feuille les cellules souches dérivées du tissu adipeux pour réduire les fuites après colectomie partielle dans un modèle de Rat

doi: 10.3791/57213 Published: August 11, 2018

Summary

La préparation et la transplantation de feuilles (ASC) les cellules souches dérivé du tissu adipeux sur les anastomoses colorectal insuffisamment suturées dans un modèle de rat est présenté. Cette nouvelle application montre que feuilles de NCP peuvent réduire les fuites d’anastomose colorectal.

Abstract

Une fuite anastomotique est une complication désastreuse après chirurgie colorectale. Bien que les méthodes actuelles pour la prévention de fuites ont différents niveaux d’efficacité clinique, ils sont jusqu'à présent imparfaites solutions. Thérapie de cellules souches en utilisant des feuilles de l’ASC pourrait constituer une solution à ce problème. CRA est considérés comme des candidats aussi prometteurs pour la promotion des tissus de guérison en raison de leurs propriétés trophiques et immunomodulatrices. Ici, nous fournissent des méthodes pour produire des feuilles de ASC haute densités, qui sont transplantés sur une anastomose colorectal dans un modèle de rat pour réduire les fuites. CRA formé de feuilles de cellule dans les récipients de culture thermo sensible qui pourraient facilement être enlevés. Le jour de la transplantation, une colectomie partielle avec une anastomose colorectal 5-suture a été réalisée. Animaux ont été transplantés immédiatement avec 1 feuille de NCP par rat. Feuilles de l’ASC ont adhéré spontanément à l’anastomose sans colle, suture ou tout biomatériau. Groupes d’animaux ont été sacrifiés 3 et 7 jours après l’opération. Par rapport aux animaux transplantés, l’incidence d’abcès anastomotiques et la fuite était plus élevé chez les animaux témoins. Dans notre modèle, la transplantation de feuilles ASC après colorectaux anastomose était réussie et associé à un débit de fuite inférieur.

Introduction

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Colectomie partielle avec une anastomose primaire est une intervention couramment pratiquée qui peut être faite pour de nombreuses maladies touchant le côlon telles que le cancer colorectal, maladie de Crohn et diverticulite1,2. Le plus redoutable complication après que anastomose colorectal est fuite anastomotique3. Bien que plusieurs facteurs de risque associés aux fuites anastomotiques ont été identifiées, des solutions pour prévenir les fuites restent inconnu4,5.

Cellules stromales dérivées de tissu adipeux (ASCs) sont associés aux propriétés anti-inflammatoires et trophiques6,7, qui rend ces cellules promettant des candidats pour les thérapies régénératives8. L’efficacité des CRA pour favoriser la guérison des tissus a été montrée dans différents tissus comme le muscle cardiaque, peau et oesophage9,10,11,12,13. Cependant, il y a peu de rapports sur l’utilisation des CRA pour favoriser la guérison intestinale. Locale transplantation des CRA à expérimentales anastomoses colorectal via biosutures ASC-enduit ou injections séreux des CRA ont montré ni aucune amélioration dans la guérison14 ou n’a pas empêché les fuites anastomotiques malgré un résultat plus favorable anastomotique 15la guérison.

Locale transplantation des CRA en suspension ou combinée avec des biomatériaux peut-être être associés à une rétention cellulaire insuffisante ou une répartition inadéquate des cellules transplantées11. Cellules feuille technologie16,17 propose une méthode innovante de NCP livraison18,19. Par conséquent, dans une étude antérieure, une nouvelle approche a été proposée dans lequel ASCs organisés dans une cellule feuille pourrait être appliquée sur expérimental colorectaux anastomose20. Cette étude a démontré que transplantation feuille ASC a réussi à réduire les fuites colorectaux anastomose après colectomie partielle dans un modèle de rat. Cet article rapporte ASC feuille préparation et technique de la transplantation chirurgicale.

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Protocol

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Du tissu adipeux sous-cutané abdominal proviennent de donneurs humains avec l’approbation du Comité d’éthique médicale (#MEC-2014-092), Erasmus MC University Medical Center, Rotterdam, Pays-Bas. Toutes les expériences animales ont été approuvées par le Comité éthique d’expérimentation animale, centre médical universitaire Erasmus MC, Rotterdam, Pays-Bas (133-14-01).

1. culture et l’isolement de l’ASCs humaines

  1. Préparer 3 mL de milieu d’isolement pour 1 g de tissu adipeux. Mix faible concentration de glucose Dulbecco de milieu Eagle modification (LG-DMEM) avec 10 g/L Bovine Serum albumine (BSA) et collagénase de 1 g/L de type 1.
  2. Disséquer les humains du tissu adipeux sous-cutané abdominal (n = 8, toutes les femmes, moyenne d’âge 40 ± 9 ans) en petits morceaux (0,5 cm) à l’aide d’une lame chirurgicale stérile taille 10, les forceps tissue Adson-Brown et les ciseaux de Metzenbaum dans un stérile SafetyCabinet biologiques.
  3. Stocker le tissu découpé dans un flacon de verre stériles médias. Peser la quantité totale de tissu disséqué et commencer la digestion par le milieu d’isolement préparés (50 g de tissu adipeux avec 150 mL de milieu d’isolement par bouteille). Le protocole peut être suspendu ici en stockant la bouteille avec le disséqué le tissu adipeux et le milieu d’isolement à 4 ° C sur un mélangeur à rouleaux du jour au lendemain. Ensuite, préchauffer la bouteille le lendemain à la température ambiante 25 ° C pendant 15 min avant de passer à l’étape suivante.
    NOTE : Le tissu adipeux sous-cutané abdominal a été obtenu comme matière restante des donateurs devant subir une chirurgie de reconstruction mammaire avec l’approbation de la Commission éthique Erasmus MC médicale (# MEC-200) et selon le Code de conduite : « bonne utilisation secondaire de tissus humains » (< http://www.federa.org>). Retailles de tissu adipeux servait seulement de donneurs qui ne pas opt-out à usage secondaire.
  4. Digérer le tissu adipeux disséqué dans un flacon de verre stériles médias dans un shaker-incubateur à 150 tr/min et 37 ° C pendant 1 h.
  5. Diviser la solution digérée en tubes de 50 mL et centrifuger les tubes pendant 10 min à 390 x g.
  6. Préparer le milieu de culture : LG-DMEM additionné de 10 % sérum fœtal (SVF), 50 gentamicine µg/mL et 1,5 µg/mL ampothericin B.
  7. Après la centrifugation, éliminer le surnageant et Resuspendre le culot dans 20 mL de milieu de culture (LG-DMEM additionné de 10 % sérum fœtal (SVF), 50 gentamicine µg/mL et 1,5 µg/mL ampothericin B). Centrifuger les cellules à nouveau pendant 5 min à 390 x g et éliminer le surnageant.
  8. Resuspendre le culot cellulaire avec 10 mL de milieu de culture (LG-DMEM additionné de 10 % FBS, 50 gentamicine µg/mL et 1,5 µg/mL ampothericin B) et la suspension cellulaire filtrer sur un filtre de 100 µm.
  9. Ajouter 50 µL de solution de 3 % d’acide acétique/méthylène bleu (par lyse des globules rouges) dans 50 µL de la suspension cellulaire, mélanger la solution et 10 µL permet de compter les cellules non vides. Effectuer des cellules avec un hémocytomètre. Puis plaque les cellules à une densité de 40 000 cellules/cm2 dans le milieu de culture (LG-DMEM supplémenté avec 30 % FBS, 50 gentamicine µg/mL et 1,5 µg/mL ampothericin B).
  10. Incuber les cellules à 37 ° C dans une atmosphère humide avec 5 % de CO2 pendant 24 h.
  11. Après l’incubation, laver les cellules avec du phosphate tiède (37 ° C) solution saline tamponnée (PBS) pour enlever les débris cellulaires et remplacer les médias avec milieu de culture pour le BF 10 % avec fraîchement ajouté phosphate-2-acide ascorbique (25 µg/mL) et la croissance de fibroblastes recombinante humaine le facteur 2 (FGF2, 1 ng/mL).
  12. CRA de sous-culture à confluence de 90 % à l’aide de la solution d’EDTA trypsine standard 0,25 % (3 mL pour une fiole T175). Après 3-5 min, neutraliser la solution d’EDTA trypsine 0,25 % avec 10 mL de milieu de culture (LG-DMEM additionné de 10 % FBS, 50 gentamicine µg/mL et 1,5 µg/mL ampothericin B).
    NOTE : Flow cytometry analyse à l’aide de marqueurs de surface communes ASC et différenciation de la lignée tri essais a eu lieu auparavant et a révélé que ASCs isolement à l’aide de ce protocole affichée ASC spécificités21,22.
  13. Laver les cellules avec 10 mL de milieu de culture (LG-DMEM additionné de 10 % FBS, gentamicine 50 µg/mL et 1,5 µg/mL ampothericin B) pour une fiole T175 et centrifuger les cellules pendant 8 min à 250 x g. Retirez le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 mL de milieu de culture. Compter les cellules avec un hémocytomètre.
  14. Plaque de cellules dans les flacons de culture T175 à une densité de 8 000 cellules/cm2.
  15. Congeler l’ASCs restants dans l’azote liquide avec 10 % de diméthylsulfoxyde (DMSO) en milieu de culture avant d’utiliser.

2. ASC feuille préparation

  1. Manteau pré Pétri thermo-sensible (3,5 cm de diamètre) avec 1 mL de FBS, puis placez la vaisselle dans un incubateur à 37 ° C pendant au moins 30 min avant l’ensemencement de la cellule.
  2. Trypsinize ASC à l’aide de solution de EDTA étalon 0,25 % trypsine pendant 3-5 min (3 mL pour un flacon de culture T175). S’il y a tout amas cellulaire après trypsinisation, filtrer les cellules à travers un filtre 100µm avant le dépouillement.
  3. Neutraliser la solution de trypsine avec LG-DMEM supplémenté de 10 % SVF (10 mL pour une fiole T175) et centrifuger la suspension cellulaire pendant 8 min à 250 x g. éliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 mL de LG-DMEM supplémenté de 10 % FBS.
  4. Après avoir enduit le thermo-responsive Pétri avec FBS, déplacer les plats de l’incubateur d’une plaque chauffante à 37 ° C et retirer le plat FBS.
  5. CRA de semences à 400 000 cellules/cm2 (au total, 3,52 × 106 cellules dilués dans 2 mL de milieu de culture par plat).
  6. Avec soin de distribuer aussi régulièrement que possible les cellules en balançant doucement le plat.
  7. Feuilles de NCP culture pendant 48 h à 37 ° C dans une atmosphère humide avec 5 % de CO2.
    NOTE : Essayez de réduire au minimum l’ouverture de la porte de l’incubateur après l’ensemencement ASCs pour éviter les baisses de température qui peuvent interférer avec la formation de feuille de NCP ou causer le détachement prématuré des feuilles formées de NCP.

3. partielle colectomie et colorectaux anastomose

  1. Induire et maintenir des rats Wistar mâles (pesant entre 250-350 g) avec 1 L/min d’isoflurane (inhalation de 1.5-5%)/oxygen et injecter la buprénorphine 0,05 mg/kg par voie intramusculaire.
  2. Une fois que les animaux sont sous anesthésie générale, évaluer la profondeur anesthésique, un test de réflexe. Appliquer pommade ophtalmique contenant de vitamine A sur les yeux pour prévenir le dessèchement. Lorsque l’anesthésie est considéré comme suffisant pour la chirurgie, préparer aseptiquement l’abdomen en rasant les poils et pulvériser la zone chirurgicale deux fois avec l’éthanol à 70 %. Drapé de l’abdomen avec papier stérile drape. Utilisez une technique aseptique et maintenir un champ stérile pendant toute l’intervention chirurgicale.
  3. Faire une incision abdominale médiane de 5 cm avec une taille de lame chirurgicale stérile 10 et prolonger l’incision avec des ciseaux de Metzenbaum. Identifier et extérioriser le côlon et emballer le colon du reste de la cavité abdominale avec des gazes humides salines. Identifier le milieu droit et gauche artères coliques dans le mésentère, carrément disséquer autour de chaque navire à l’aide de moustique Halsted et ligaturer individuels de chaque bateau avec 4/0 soie tressé non résorbable.
  4. Isoler le segment colique entre 1,0 cm aborally pour le caecum et 0,5 cm au-dessus de l’artère mésentérique caudale. Transect par le biais de côlon sain à l’aide de ciseaux de Metzenbaum. Après la résection du segment colique, réunir les extrémités proximales et distales du côlon en introduisant deux écouvillons en coton long trans-anale dans le côlon distal, puis dans l’extrémité du côlon proximal.
  5. À l’aide d’un microscope chirurgical, créer une anastomose bout à bout insuffisamment suturée en une couche inversant la suture à l’aide de sutures interrompus 5 (polyamide 8/0 de monofilament non résorbable). Placer les sutures interrompus à travers toutes les couches de la paroi du côlon et l’extraluminairernent de noeuds.
  6. Diviser les rats aléatoirement en contrôle ou groupe de feuille de NCP.

4. ASC feuille Transplantation

  1. Laissez les récipients de culture se refroidir à température ambiante 40 min avant la transplantation in vivo , afin de faciliter le détachement de feuille de NCP.
    Remarque : Après le détachement, feuilles de l’ASC se réduire à environ 2 cm de diamètre. Viabilité de feuille ASC reste élevée pendant au moins 3 à 6 h après le détachement de20.
  2. Enlever le milieu de culture et de la remplacer avec 1 mL de sérum gratuitement LG-DMEM.
  3. Doucement, prenez les jantes de la feuille de l’ASC avec une pince atraumatique et placer le côté plat de la feuille de l’ASC sur le dessus de la ligne anastomotique.
  4. Soigneusement Etends de l’ASC feuille environ 0,25 cm au-dessus et au-dessous de la ligne anastomotique à l’aide de la pince atraumatique et enrouler la feuille autour du côlon. Soulevez le côlon jusqu'à envelopper la feuille ASC autour de la face dorsale.
    NOTE : Feuilles de NCP adhèrent spontanément à la ligne anastomotique, il n’y a pas besoin d’utiliser de la colle tissu ou tout autre biomatériau. Le groupe de contrôle ne reçoit pas de traitement supplémentaire.
  5. Retirer les cotons-tiges et changer les gants et les instruments. Remplacez le signe deux-points dans l’abdomen. Fermer l’abdomen-linea alba avec une couche d’en cours d’exécution à l’aide de sutures résorbables tressées polyglycolique acide 5/0. L’hypoderme de suture et le cutis ensemble en une seule couche d’en cours d’exécution à l’aide de sutures résorbables tressées polyglycolique acide 5/0.

5. suivi et évaluation post-opératoire

  1. Immédiatement, réhydrater les animaux avec une injection sous-cutanée de 5 mL de solution saline tiède après l’opération. Placer les animaux sous une lampe de chaleur pour maintenir la température du corps et de surveiller les signes vitaux jusqu'à ce que les animaux reprendre conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternal.
    NOTE : Les animaux qui ont subi une intervention chirurgicale ont été pas retournés à la société des autres animaux jusqu'à ce que complètement guéri. Après récupération, laisser libre accès à l’eau et chow rat ordinaire. Pour le soulagement de la douleur post-opératoire, administrer la buprénorphine 0,05 mg/kg par voie sous-cutanée toutes les 6-8 h pendant 3 jours. Sans traitements antibiotiques ont été administrés à tout moment dans cette étude.
  2. Obtenir des évaluations cliniques quotidiennes de bien-être et de poids. Dans le cas d’un score très faible de bien-être ou des pertes de poids, les animaux doit être euthanasiés par exsanguination par ponction cardiaque tandis que toujours sous anesthésie.
  3. Le jour postopératoire 3 ou jour 7, anesthésier les rats avec 1 L/min d’isoflurane (inhalation de 1.5-5%)/oxygen sans la buprénorphine et effectuer une re-laparotomie avec une incision en forme de U. Vérifier l’abdomen pour les signes de péritonite, sténose, adhérences fibreuses et la présence d’abcès. Marquer la gravité des adhérences et abcès tant dans l’abdomen et à la zone anastomotique.
  4. Déterminer la pression de rupture anastomotique par l’insufflation d’air dans un segment fermé du côlon dont l’anastomose. Enregistrer la pression atmosphérique et l’endroit de la rupture lorsque le premier air de fuite sous la pression de rupture.
  5. Retirer le côlon de chaque animal sacrifié et fixer le segment Coupe du côlon - contenant l’anastomose colorectal - avec 4 % tamponnée de formaldéhyde, suite de paraffine incorporation et coupant le côlon en coupes épaisses de 4 μm.
  6. Euthanasier les animaux alors que sous anesthésie directement après le prélèvement du segment anastomose par exsanguination par ponction cardiaque. Confirmer l’animale mort avec l’absence de respiration mouvement et un battement de coeur.
  7. Effectuer des salissures histochimiques comme l’hématoxyline et éosine et Picro Sirius rouge et salissures immunohistochimie avec des anticorps dirigés contre les mitochondries humaines, cellules endothéliales rat (anti-CD34) et du système immunitaire (CD3 +, CD163 +).
  8. Numériser les diapositives pour analyse informatisée et de comparer les groupes d’animaux.

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Representative Results

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Un organigramme de cette étude décrivant les ASC fiche culture et la procédure de la résection du côlon et anastomose est illustré à la Figure 1. La figure 2 illustre la morphologie microscopique des ASC feuille et l’aspect macroscopique de la feuille de l’ASC pendant et après le détachement. La figure 3 montre les différentes étapes du détachement de feuille d’ASC et de la transplantation. La figure 4 montre la présence de la feuille de l’ASC à la ligne anastomotique et la prévention de fuites 3 jours après l’opération.

La période de suivi autorisée pour évaluation colorectaux anastomose. Les différentes évaluations figurent dans le tableau et les figures. Par rapport aux animaux témoins, les groupes d’animaux transplantés ont montré moins de déhiscence anastomotique fréquente et fuite postopératoire jour 3 et la formation d’abcès fréquents jour postopératoire 7. Par rapport aux animaux témoins, animaux transplantés n’ont pas développé des adhérences ou formation de sténose. Le tableau 1 montre les résultats macroscopiques à la fin de la période de suivi chez les transplantés et non transplantés.

Figure 1
Figure 1 : organigramme étude. A) ASC ont été isolés et élargi avant d’ensemencer sur Pétri thermo sensible. CRA ont été injectées à une densité de 400 000 cellules/cm2 et mis en culture pendant 48 h avant la transplantation. Le jour de la transplantation, feuille de l’ASC ont été détachées en permettant à la boîte de Petri thermo sensible se refroidir à température ambiante pendant 30 min. B) régime d’intervention chirurgicale ; après une ligature d’approvisionner les navires une colectomie partielle et colorectaux anastomose est réalisée. Une feuille de l’ASC était enroulée autour de l’anastomose dans le groupe de feuille ASC ; caecum a), b) iléum, anus c). L’aperçu schématique de l’approche chirurgicale a été en partie adapté avec autorisation de Z. Wu et al. 24 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : feuille de NCP avant et après détachement. A) feuille ASC en Pétri thermo sensible après 48 h de grossissement x 40 culture. Feuilles de l’ASC ont été obtenus en cultivant l’ASCs sur commercial Pétri thermo sensible. B-C) feuille de NCP au cours de (B) et après détachement (C). Lorsque les récipients de culture thermo sensibles pouvaient se refroidir à température ambiante, la feuille de l’ASC spontanément détaché de la surface du plat comme une feuille de NCP intacte. Aucun traitement enzymatique n’était nécessaire. La taille de la feuille de l’ASC réduite après le détachement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : transplantation de feuille ASC. A) représentation d’orientation feuille ASC dans la boîte de Petri thermo sensible. Fiche d’Orientation du sac 26 B) après la transplantation. Le côté plat de la feuille de l’ASC a été placé sur le dessus de la surface séreuse de la ligne anastomotique (ligne anastomotique est indiqué d’une croix). C) peropératoires vues des différentes étapes de la transplantation. Deux pinces atraumatiques servaient à soulever vers le haut de la feuille de l’ASC et enroulez-la autour de la ligne anastomotique. Les flèches blanches indiquent emplacement ASC de la feuille. Les images de la transplantation ont été en partie adaptés avec la permission de Sukho, P., et al. 20 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : évaluation de macroscopiques et histologiques colorectaux anastomose. A-B) comparativement au groupe témoin, observation macroscopique montre réduit les fuites et abcès formation à jour postopératoire 3 (A) et 7 (B), respectivement. Flèches blanches point à zone anastomotique et flèches noires point à feuilles de NCP transplantés. C) représentant les sections du site colorectaux anastomose chez les animaux transplantés coloré H & E. La structure de la feuille pourrait être identifiée sur le site de l’anastomose jusqu'à 7 jours après l’opération. Les images ont été en partie adaptés avec la permission de Sukho, P., et al. 20 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Jour post-opératoire 3 Jour post-opératoire 7
Contrôle (%) Feuille de l’ASC (%) p-valeur Contrôle (%) Feuille de l’ASC (%) p-valeur
Péritonite 1/14(7.1) 0/14(0) NS 0/15(0) 0/14(0) NS
Rupture anastomotique 10/14(71.4) 2/14(14.3) 0,002 3/15(20) 2/14(14.3) NS
Sténose 2/14(14.3) 2/14(14.3) NS 2/15(13) 2/14(14.3) NS
Abcès à anastomose 14/14(100) 12/14(85.7) NS 10/15(66.7) 4/14(28.6) 0,04
Adhésion à l’anastomose 14/14(100) 14/14(100) NS 15/15(100) 14/14(100) NS
Abcès ailleurs 11/14(78.5) 8/14(57.1) NS 6/15(40) 4/14(28.6) NS
Adhérence ailleurs 8/14(57.1) 3/14(21.42) NS 9/15(60) 7/14(50) NS

Tableau 1 : Résultats macroscopiques post-opératoire.

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Discussion

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Une fuite anastomotique est l’évènement perturbateur plus grave après la résection du côlon avec une anastomose primaire. Techniques optimales pour éviter les fuites et rupture anastomotique manquent encore. L’application locale d’un tableau des biomatériaux a été réalisée, avec des résultats25,26,27. Le but des thérapies cellulaires est de faciliter la réparation des tissus de remplacement de tissus ou de la stimulation de la cicatrisation locale par le biais de la sécrétion paracrine.

Dans ce modèle de rat, transplantation de feuille ASC était techniquement réussie. Les évaluations cliniques et histologiques ont démontré l’efficacité de la feuille de l’ASC à réduire les fuites après la résection du côlon avec anastomose primaire.

La transplantation d’une feuille de l’ASC d’anastomoses colorectal est une nouvelle approche en chirurgie colorectale. Dans cette étude, pour la première fois, une feuille de NCP haute densitée a été transplantée. Le choix pour l’ASCs livré sous forme de tableau cellule reposait sur les avantages précédemment signalés de cellule feuille technologie28,29 par des techniques de transplantation cellulaire conventionnel. En outre, le choix de l’ASCs reposait sur plusieurs études qui ont démontré leurs capacités anti-inflammatoires et trophiques, en particulier dans le muscle cardiaque-peau-guérison et11,12,19,32 .

Détachement et préparation de feuille de NCP peuvent être difficiles. Dans certains donateurs de l’ASC, feuilles de l’ASC détache prématurément de la boîte de Petri et plié, empêchant leur utilisation. Dans cette étude, ne constituait pas la cause exacte de ce problème dans ces bailleurs de fonds spécifiques. Car une forte consommation de milieu de culture a été notifiée à ces donateurs, on a supposé que les variations individuelles dans le taux de prolifération peuvent jouer un rôle important. Revêtement de sérum assistée dans l’adhésion cellulaire à la surface. Ainsi que de distribution minutieuse des cellules dans la culture plat et minimisant l’ouverture de la porte de l’incubateur après l’ensemencement ASCs (prévenir les baisses de température), moins le pliage des feuilles NCP s’est produite. De cette façon, feuilles de l’ASC de tous les donateurs ont été transplantés avec succès, confirmant la faisabilité de la technique.

Le jour de la transplantation, la plupart des feuilles ASC spontanément détaché après avoir laissé la boîte de Petri thermo sensible se refroidir à température ambiante. Cependant, un nombre limité de feuilles ne pas entièrement détacher. Agitant doucement de la boîte de Petri ou rinçage doux à la jante à l’aide d’une pipette a finalement aidé à complets détachements.

Pour transplantation réussie de feuille ASC d’anastomoses colorectal, plusieurs étapes critiques doivent être abordées. Tout d’abord, trop de sang sur le site de l’anastomose devrait être retiré pour assurer le contact entre la feuille de l’ASC et la surface séreuse. Deuxièmement, le côté plat de la feuille de l’ASC doit être placé sur la surface séreuse de l’anastomose. On émet l’hypothèse que la fonction des feuilles de la cellule après la récolte est maintenue en raison de la préservation des protéines de surface de cellules et des protéines de jonction cellule-cellule. En outre, la capacité des feuilles de l’ASC à adhérer spontanément à la surface séreuse en peu de temps pourrait être facilitée par la présence d’ECM déposé qui est produite au cours de la culture in vitro19,20,21. En troisième lieu, la taille de la feuille de l’ASC et le diamètre du côlon doit être comparable pour permettre une couverture complète de l’emplacement de l’anastomose. Quand de plus grandes surfaces doivent être satisfaits, on peut considérer l’utilisation de plusieurs feuilles.

Il existe certaines limitations du présent protocole pour la préparation de feuille ASC et de la transplantation. Lorsque vous utilisez Pétri thermo sensibles pour préparer la feuille de l’ASC, la température doit strictement être maintenue à 37 ° C durant tout le processus pour éviter le détachement précoce du dispositif. Après la transplantation, le taux de survie de feuille de NCP est inconnu. Bien que des expériences antérieures ont montré que ASCs étaient viables à 3 jours après l’opération, l’activité mitochondriale des ces CRA a été diminuée à 7 jours après l’opération17. La cellule survie taux de dose effet et de la transplantation sont importantes questions qui doivent être adressées à l’avenir des études. Biais de l’observateur ne peut pas être totalement écartée puisque la feuille de NCP peut être identifiée macroscopiquement et microscopiquement à évaluations post-opératoire. Bien que les animaux transplantés n’a pas montré plus postopératoire formation d’adhérences comparée pour contrôler les animaux17, l’évaluation de l’anastomose colorectal peut être entravée par la présence de ces adhérences intra-abdominales.

Un avantage de cette technique d’application est qu’il est simple et facile à exécuter. Avec seulement un peu de pratique et à l’aide de pinces universelles atraumatique, chirurgiens intestinales devraient pouvoir enrouler la feuille autour de l’anastomose de NCP. En outre, moment de la chirurgie n’est pas grandement affecté puisque les feuilles de l’ASC immédiatement adhèrent aux tissus de l’hôte. En outre, lorsque vous utilisez des feuilles de NCP, aucun biomatériau synthétique ne demeure dans le corps, réduisant au minimum le risque d’une réaction à corps étranger.

ASCs transplantés organisés en fiches de cellule démontré leur capacité à réduire les fuites d’anastomose colorectal. Compte tenu de ces résultats prometteurs, futurs doivent être menées afin d’évaluer les effets à long terme des thérapeutiques et des raisons de sécurité. En outre, plusieurs méthodes ont été décrites pour modifier les effets thérapeutiques des feuilles d’ASC comme induisant une surexpression du facteur de croissance endothélial vasculaire30. Ces méthodes peuvent améliorer la réparation des tissus en utilisant des feuilles de l’ASC et envisager à l’avenir des études.

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Disclosures

Les auteurs déclarent que la recherche a été effectuée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.

Acknowledgments

Les auteurs sont reconnaissants aux Prof. Dr. S.E.R. Hovius, Dr m.a.M. Mureau et tous les chirurgiens du département de chirurgie plastique de la collection du tissu adipeux sous-cutané. Sukho P. est soutenu par une subvention du programme The Netherlands Fellowship (NFP-12/435), pendant le déroulement de l’étude. Y.M. Bastiaansen-Jenniskens est pris en charge par des subventions de la Fondation néerlandaise de l’arthrite (LP11).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LG DMEM Gibco, Life technologies 22320022 ASC isolation and culture
Collagenase type I Gibco, Life technologies 17100-01 ASC Isolation
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9418 ASC Isolation
Fetal bovine serum Gibco, Life technologies 10270-106 FBS, ASC isolation and culture
3% acetic acid with methylene blue Stemcell Technologies 7060 ASC Isolation
Gentamicin Gibco, Life technologies 15750-037 ASC isolation and culture
Ampothericin B Gibco, Life technologies 15290-018 ASC isolation and culture
Shaker (Gallenkamp Environmental Shaker Model 10X 400) Akribis Scientific F240 ASC Isolation
Centrifuge Hettichlab Rotina380 ASC isolation and culture
Phosphate buffer saline Gibco, Life technologies 14190-094 PBS, ASC isolation and culture
Ascorbic acid-2-phosphate Sigma-Aldrich A8960 ASC isolation and culture
Human recombinant fibroblast growth factor 2 AbD Serotec AF-100-15 FGF2, ASC isolation and culture
Trypsin EDTA Gibco, Life technologies 25200-056 ASC culture
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2650-5x DMSO, ASC freezing
Thermo-responsive culture dishes Nunc Thermo scientific 174904 ASC sheet preperation
Non-absorbable braided silk 4/0 B Braun 21151042 surgery
Non-absorbable monofilament polyamide 8/0 B Braun G1118170 surgery
Absorbable braided polyglycolic acid 5/0 B Braun C1048207 surgery

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Transplantation de la feuille les cellules souches dérivées du tissu adipeux pour réduire les fuites après colectomie partielle dans un modèle de Rat
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Sukho, P., Boersema, G. S. A., Kops, N., Lange, J. F., Kirpensteijn, J., Hesselink, J. W., Bastiaansen-Jenniskens, Y. M., Verseijden, F. Transplantation of Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet to Reduce Leakage After Partial Colectomy in A Rat Model. J. Vis. Exp. (138), e57213, doi:10.3791/57213 (2018).More

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