Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Transplantasjon av fettvev-avledet stilk cellen ark å redusere lekkasje etter delvis Colectomy i en rotte modell

Published: August 11, 2018 doi: 10.3791/57213
Automatic Translation
1,2,3, 4, 5, 4, 1,6, 1, 5, 1,5
1Department of Clinical Sciences of Companion Animals, Faculty of Veterinary Medicine, Utrecht University, 2Department of Otorhinolaryngology, Erasmus MC University Medical Center, 3Department of Clinical Sciences and Public Health, Faculty of Veterinary Science, Mahidol University, 4Department of Surgery, Erasmus MC University Medical Center, 5Department of Orthopaedics, Erasmus MC University Medical Center, 6Hill's Pet Nutrition Inc.

Summary

Forberedelse og transplantasjon av fettvev avledet stilk cellen (ASC) ark på utilstrekkelig sutured colorectal forekomst i en rotte modell presenteres. Dette nye programmet viser at ASC ark kan redusere colorectal anastomose lekkasje.

Abstract

Anastomotisk lekkasje er en katastrofal komplikasjon etter colorectal surgery. Selv om dagens metoder for lekkasje forebygging har ulike nivåer av klinisk effekt, er de til nå imperfektum løsninger. Stilk cellen terapi bruker ASC ark kan gi en løsning på dette problemet. ASCs anses som lovende kandidater for å fremme vev healing på grunn av deres trophic og immunmodulerende egenskaper. Her gir vi metoder for å produsere høy tetthet ASC ark, som er transplanted til en tykk anastomose i en rotte modell å redusere lekkasje. ASCs dannet celle ark i thermo-responsive kultur retter som kan lett løsrevet. På dagen for transplantasjon, ble en delvis colectomy med en 5-Sutur colorectal anastomose utført. Dyrene ble umiddelbart transplantert med 1 ASC ark per rotte. ASC ark overholdt spontant anastomose uten noen lim, Sutur eller noen biomateriale. Dyr grupper ble ofret 3 og 7 dager postoperatively. Sammenlignet med transplantert dyr, var forekomsten av anastomotisk abscesser og lekkasje høyere i kontrollen dyr. I vår modell, transplantasjon av ASC ark etter colorectal anastomose var vellykket og knyttet til en lavere pris for lekkasje.

Introduction

Delvis colectomy med en primær anastomose er en brukte kirurgi som kan gjøres for mange sykdommer som påvirker kolon som tykktarmskreft, Crohns sykdom og divertikulitt1,2. Mest fryktede komplikasjon etter colorectal anastomose er anastomotisk lekkasje3. Selv om flere risikofaktorer forbundet med anastomotisk lekkasjer identifisert, fortsatt løsninger for å hindre lekkasje ukjent4,5.

Fettvev-avledet stromal celler (ASCs) er assosiert med anti-inflammatorisk og trophic6,7, noe som gjør disse cellene lovende kandidater for regenerativ Therapy8. Effektiviteten av ASCs å fremme vev helbredelse ble vist i ulike vev som Hjertemuskel, hud og spiserøret,9,,10,,11,,12,,13. Det er imidlertid noen rapporter om bruk av ASCs å fremme intestinal helbredelse. Lokale transplantasjon av ASCs til eksperimentelle colorectal forekomst via ASC-belagt biosutures eller serosal injeksjoner av ASCs viste enten ingen forbedring i healing14 hindre ikke anastomotisk lekkasje tross en gunstigere anastomotisk Healing15.

Lokale transplantasjon av ASCs i suspensjon eller kombinert med biologisk materiale kan være assosiert med utilstrekkelig celle oppbevaring eller en utilstrekkelig distribusjon av transplantert celler11. Cellen ark teknologi16,17 tilbyr en nyskapende læremetode ASC levering18,19. Derfor, i en tidligere studie, en ny tilnærming ble foreslått som ASCs organisert i en celle ark kan brukes på eksperimentell colorectal anastomose20. Denne studien viste at ASC ark transplantasjon er heldig inne slankende colorectal anastomose lekkasje etter delvis colectomy i en rotte modell. Denne artikkelen rapporter ASC ark forberedelse og kirurgisk transplantasjon teknikk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Subkutan abdominal fettvev ble innhentet fra menneskelige givere med godkjenning av medisinsk etiske komité (#MEC-2014-092), Erasmus MC University Medical Center, Rotterdam, Nederland. Alle dyreforsøk ble godkjent av den etiske komiteen av dyr eksperimentering, Erasmus MC University Medical Center, Rotterdam, Nederland (133-14-01).

1. menneskelige ASCs isolasjon og kultur

  1. Forberede 3 mL isolasjon medium 1 g av fettvev. Mix lav glukose Dulbecco er endret Eagle's medium (LG-DMEM) med 10 g/L storfe Serum Albumin (BSA) og 1 finans collagenase type 1.
  2. Analysere menneskelig subkutan abdominal fettvev (n = 8, alle kvinnelige, mener 40 år ± 9 år gammel) til små biter (0,5 cm) bruker et sterilt kirurgisk bladet størrelse 10, Adson-Brown tissue tang og Metzenbaum saks i et sterilt biologiske SafetyCabinet.
  3. Lagre dissekert vevet i et sterilt media lagringen glassflaske. Veie den totale mengden dissekert vev og starte fordøyelsen med forberedt isolasjon mediet (50 g av fettvev med 150 mL av isolasjon medium per flaske). Protokollen kan pauses her ved å lagre flasken med dissekert fettvev og isolasjon medium på 4 ° C på en berg-mikser over natten. Deretter prewarm flasken neste dag til romtemperatur 25 ° C i 15 min før du fortsetter med neste trinn.
    Merk: Subcutaneous abdominal fettvev ble innhentet som leftover materiale fra givere under brystet gjenoppbygging kirurgi med godkjenning av Erasmus MC medisinsk etiske komiteen (# MEC-200), og ifølge spillereglene: "riktig sekundær bruk av menneskelig vev"(< http://www.federa.org>). Leftover fettvev ble bare brukt fra givere som ikke velge ut til sekundær bruk.
  4. Fordøye dissekert fettvev i et sterilt media lagringen glassflaske i en shaker-inkubator ved 150 rpm og 37 ° C i 1 time.
  5. Dele fordøyd løsningen i 50 mL rør og sentrifuge rør i 10 min 390 x g.
  6. Forberede kultur medium: LG-DMEM med 10% fosterets bovin serum (FBS), 50 µg/mL gentamicin og 1,5 µg/mL ampothericin B.
  7. Etter sentrifugering, fjerne nedbryting og resuspend celle pellet i 20 mL kultur medium (LG-DMEM med 10% fosterets bovin serum (FBS), 50 µg/mL gentamicin og 1,5 µg/mL ampothericin B). Sentrifuge celler igjen for 5 min 390 x g og fjerne nedbryting.
  8. Resuspend celle pellets med 10 mL kultur medium (LG-DMEM med 10% FBS, 50 µg/mL gentamicin og 1,5 µg/mL ampothericin B) og filtrere celle suspensjon gjennom en 100 µm.
  9. Legger til 50 µL av 3% eddiksyre/methylene blåfarge løsning (for røde blodlegemer lysis) 50 µL av cellen suspensjon, bland løsningen og bruker 10 µL telle celler. Utføre celle telle med en hemocytometer. Deretter plate cellene på en tetthet av 40 000 celler/cm2 i kultur medium (LG-DMEM med 30% FBS, 50 µg/mL gentamicin og 1,5 µg/mL ampothericin B).
  10. Inkuber cellene på 37 ° C i en fuktig atmosfære med 5% CO2 for 24 timer.
  11. Etter inkubasjon, vask cellene med varm (37 ° C) fosfat buffered saltvann (PBS) å fjerne celle rusk og erstatte media med 10% FBS kultur medium med fersk lagt askorbinsyre-2-fosfat (25 µg/mL) og menneskelige rekombinant fibroblast vekst faktor 2 (FGF2, 1 ng/mL).
  12. Subkultur ASCs på 90% samløpet med standard 0,25% trypsin EDTA løsning (3 mL for en T175 kolbe). Etter 3-5 min, nøytralisere 0,25% trypsin EDTA løsningen med 10 mL kultur medium (LG-DMEM med 10% FBS, 50 µg/mL gentamicin og 1,5 µg/mL ampothericin B).
    Merk: Flyt cytometri analyse ved hjelp av vanlige ASC overflate markører og tri-lineage differensiering analyser var utført tidligere og avslørte at ASCs isolert bruker denne protokollen vises ASC spesielle egenskaper21,22.
  13. Vask cellene med 10 mL av kultur medium (LG-DMEM supplert med 10% FBS, 50 µg/mL gentamicin og 1,5 µg/mL ampothericin B) for en T175 kolbe og sentrifuge celler for 8 min på 250 x g. Fjern nedbryting og resuspend cellene i 1 mL av kultur medium. Telle celler med en hemocytometer.
  14. Plate cellene i T175 kultur flasker på en tetthet av 8000 celler/cm2.
  15. Fryse de gjenværende ASCs i flytende nitrogen med 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) i kultur medium før videre bruk.

2. ASC ark forberedelse

  1. Pre pels thermo-responsive kultur retter (3,5 cm diameter) med 1 mL av FBS, og plasser retter i en inkubator på 37 ° C i minst 30 min før cellen seeding.
  2. Trypsinize ASCs bruker standard 0,25% trypsin EDTA løsning for 3-5 minutter (3 mL for en T175 kultur kolbe). Hvis det er noen celle klumper etter trypsinization, kan du filtrere cellene gjennom en 100 µm før telling.
  3. Nøytralisere trypsin løsningen med LG-DMEM med 10% FBS (10 mL for en T175 kolbe) og sentrifuger celle suspensjon i 8 min på 250 x g. fjerne nedbryting og resuspend cellene i 1 mL av LG-DMEM med 10% FBS.
  4. Etter belegg thermo-responsive kultur retter med FBS, flytte retter fra inkubator til en oppvarming plate på 37 ° C og fjerne FBS fra parabolen.
  5. Frø ASCs 400.000 celler/cm2 (i alt, 3.52 × 106 celler fortynnet i 2 mL kultur medium per fat).
  6. Nøye distribuere cellene så jevnt som mulig ved å forsiktig svingende parabolen.
  7. Kultur ASC ark for 48 h på 37 ° C i en fuktig atmosfære med 5% CO2.
    Merk: Prøv å minimere åpne døren til inkubator etter seeding ASCs å forhindre temperatur dråper som kan forstyrre ASC ark formasjon eller forårsake tidlig avdeling dannet ASC ark.

3. delvise Colectomy og Colorectal anastomose

  1. Indusere og vedlikeholde mannlige Wistar rotter (veier mellom 250-350 g) med 1 L/min av isoflurane (1.5-5%)/oxygen innånding og injisere 0,05 mg/kg buprenorfin intramuskulært.
  2. Når dyrene er under narkose, vurdere bedøvende dybde med refleks testing. Vitamin A inneholder øye ointment gjelde øynene for å hindre tørrhet. Når anestesi anses tilstrekkelig for kirurgi, tas aseptisk forberede magen ved barbering hår og sprøyting det kirurgiske området to ganger med 70% etanol. Drapere magen med sterilt papir gardiner. Bruk en steril teknikk og opprettholde det sterile feltet under hele kirurgiske prosedyren.
  3. Gjøre en midtlinjen abdominal snitt på 5 cm sterilt kirurgisk bladet størrelse 10 og utvide innsnitt Metzenbaum saks. Identifisere og exteriorize kolon og pack kolon fra resten av bukhulen med saltvann fuktet gauzes. Identifisere høyre, midten og rett ut igjen kolikk arterier i mesentery, dissekere rundt hver fartøy bruker Halsted mygg og ligate hver individuelle fartøy med ikke-absorberbare flettet silke 4/0.
  4. Isolere colonic segmentet mellom 1,0 cm aborally til cecum og 0,5 cm over caudal hvem arterien. Mudderbunn gjennom sunn kolon med Metzenbaum saks. Etter eksisjon av colonic segmentet, samle proksimale og distale endene av tykktarmen ved å innføre to lange bomull vattpinner trans-anally gjennom distale kolon, og deretter i den proksimale kolon enden.
  5. Bruker et kirurgisk mikroskop, opprette en utilstrekkelig sutured ende-til-ende anastomose ved en-lag invertere suturing bruker 5 avbrutt suturer (ikke-absorberbare monofilament polyamid 8/0). Plasserer avbrutt bildet gjennom alle lagene i i tykktarm veggen og plasser knop-extraluminally.
  6. Del rotter tilfeldig i kontroll eller ASC ark gruppe.

4. ASC ark transplantasjon

  1. Tillate kultur retter å avkjøles til romtemperatur 40 min før i vivo transplantasjon, å lette ASC ark avdeling.
    Merk: Etter avdeling, ASC ark forminskes til ca 2 cm i diameter. ASC ark levedyktighet fortsatt høy for minst 3-6t etter avdeling20.
  2. Fjern kultur medium og erstatte det med 1 mL av serum gratis LG-DMEM.
  3. Forsiktig ta felger av ASC arket med atraumatiske tang og plasser parabolen-siden av ASC arket på anastomotisk linjen.
  4. Forsiktig strekke ut ASC ark ca. 0,25 cm over og under anastomotisk linjen atraumatiske tang og vikle arket rundt kolon. Løft kolon til wrap ASC arket rundt dorsal side.
    Merk: ASC ark følge spontant anastomotisk linjen, det er ikke nødvendig å bruke vev lim eller andre biomateriale. Kontrollgruppen mottar ikke noen ekstra behandling.
  5. Fjern bomull vattpinner og endre hansker og instrumenter. Erstatte kolon i magen. Lukk magen-linea alba med ett lag kjører suturer bruker absorberbare flettet polyglycolic syre 5/0. Sutur av subcutis og cutis sammen i ett lag kjører suturer bruker absorberbare flettet polyglycolic syre 5/0.

5. postoperativ evaluering og oppfølging

  1. Umiddelbart rehydrate dyrene med en subcutaneous injeksjon av 5 mL varmt saltvann postoperatively. Plasser dyrene under en varmelampe å opprettholde kroppstemperatur og overvåke vitale til dyr gjenvinne tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal recumbency.
    Merk: Dyr som ble operert ble ikke returnert til selskapet av andre dyr til helt frisk. Etter utvinning, kan du gratis tilgang til vann og vanlig rotte chow. For post-kirurgiske smertelindring, administrere 0,05 mg/kg buprenorfin subcutaneously hver 6-8 h for 3 dager. Ingen antibiotika ble administrert når som helst i denne studien.
  2. Få daglige klinisk evalueringer av velvære og vekt. Ved en svært lav velvære score eller alvorlig vekttap, burde dyr være euthanized av exsanguination via cardiac punktering mens fortsatt under anestesi.
  3. Postoperative dag 3 eller dag 7, bedøve rotter igjen med 1 L/min av isoflurane (1.5-5%)/oxygen innånding uten buprenorfin, og utføre en re-laparotomy med en U-formet snitt. Sjekk magen til tegnene på peritonitis, striktur, fibrøs adhesjon og tilstedeværelsen av abscesser. Score alvorlighetsgraden av adhesjon og svulst både i magen og anastomotisk området.
  4. Bestemme anastomotisk sprengning trykket ved insufflation luft i en lukket del av kolon inkludert anastomose. Registrere lufttrykket og plassen til ruptur når første air lekke som sprengning press.
  5. Fjerne tykktarmen fra hvert ofret dyr og fastsette cut segmentet av kolon - inneholder colorectal anastomose - med 4% bufret formaldehyd, etter av parafin innebygging og kutte kolon i 4 μm tykke snitt.
  6. Avlive dyrene mens under narkose rett etter samling av anastomose segmentet av exsanguination via cardiac punktering. Bekreft dyr død med fravær av bevegelse og en hjerterytme.
  7. Utføre histochemical stainings som Hematoxylin og Eosin og Picro Sirius rød og immunohistochemical stainings med antistoffer mot menneskelig mitokondriene, rotte endotelceller (anti-CD34) og celler i immunsystemet (CD3 +, CD163 +).
  8. Digital lysbilder for datastyrt analyse og sammenligne dyr gruppene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et flytskjema med denne studien viser både ASC ark kultur og prosedyren for kolon resection og anastomose er vist i figur 1. Figur 2 viser ASC ark mikroskopiske morfologi og makroskopisk utseendet på ASC arket under og etter brøkdel. Figur 3 viser de ulike trinnene i ASC ark løsgjøring og transplantasjon. Figur 4 viser tilstedeværelse av ASC arket anastomotisk linje og forebygging lekkasje 3 dager postoperatively.

Oppfølging periode tillatt for colorectal anastomose evaluering. Ulike vurderinger vises i figurer og tabell. Transplantert dyr gruppene sammenlignet med kontrollen dyr, og viste mindre hyppige anastomotisk dehiscence og lekkasje postoperativ dag 3 og mindre hyppige abscess dannelse postoperativ dag 7. Sammenlignet med kontrollen dyr, utvikle transplantert dyr ikke betydelig adhesjon eller striktur formasjon. Tabell 1 viser makroskopisk resultatene på slutten av oppfølging perioder i transplantert og ikke-transplanted dyr.

Figure 1
Figur 1: studere flytdiagram. A) ASCs ble isolert og utvidet før såing på thermo-responsive kultur retter. ASCs var sådd på en tetthet av 400 000 celler/cm2 og kultivert for 48 timer før transplantasjon. På dagen for transplantasjon, ASC ark var frittliggende ved at thermo-responsive kultur parabolen med avkjøles til romtemperatur for 30 min. B) av kirurgisk prosedyre; etter ligation av leverer fartøy utføres en delvis colectomy og colorectal anastomose. En ASC ark var pakket rundt anastomose i ASC ark gruppen; a) caecum, b) terminal ileum, c) anus. Skjematisk oversikt over den kirurgiske prosedyren ble delvis tilpasset med tillatelse fra Wu Z. et al. 24 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: ASC ark før og etter avdeling. A) ASC ark i thermo-responsive kultur retter etter 48 timer med kultur 40 x forstørrelse. ASC ark ble innhentet av dyrking ASCs kommersielle thermo-responsive kultur retter. B-C) ASC ark under (B) og etter avdeling (C). Når thermo-responsive kultur rettene var lov til å avkjøles til romtemperatur, frittliggende ASC arket spontant fra parabolen overflaten som en intakt ASC ark. Ingen enzymatisk behandling var nødvendig. Størrelsen på ASC arket redusert etter brøkdel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: ASC ark transplantasjon. A) skildring av ASC ark orientering i thermo-responsive kultur parabolen. 26 B) retning av ASC ark etter transplantasjon. Retten side av ASC arket ble plassert på serosal overflaten av anastomotisk linjen (anastomotisk linjen er angitt med kors). C) intra-operative utsikt over de ulike trinnene av transplantasjon. To atraumatiske tang ble brukt til å løfte opp ASC arket og vikle den rundt anastomotisk linje. Hvite pilene angir ASC plassering av stilark. Bilder av transplantasjon ble delvis tilpasset med tillatelse fra Sukho, P., et al. 20 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Colorectal anastomose makroskopisk og histologiske evaluering. A-B) sammenlignet med kontrollgruppen, makroskopisk observasjon viste redusert lekkasje og abscess dannelse på postoperativ dag 3 (A) og 7 (B), henholdsvis. Hvite pilene peker på anastomotisk område og svarte piler peker på transplanterte ASC ark. C) representant tverrsnitt av colorectal anastomose området i transplantert dyr med H & E. Ark strukturen kan identifiseres på webområdet anastomose opp til 7 dager postoperatively. Bildene ble delvis tilpasset med tillatelse fra Sukho, P., et al. 20 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Postoperativ dag 3 Postoperativ dag 7
Kontroll (%) ASC ark (%) p-verdi Kontroll (%) ASC ark (%) p-verdi
Peritonitis 1/14(7.1) 0/14(0) NS 0/15(0) 0/14(0) NS
Anastomotisk avbrudd 10/14(71.4) 2/14(14.3) 0,002 3/15(20) 2/14(14.3) NS
Striktur 2/14(14.3) 2/14(14.3) NS 2/15(13) 2/14(14.3) NS
Svulst på anastomose 14/14(100) 12/14(85.7) NS 10/15(66.7) 4/14(28.6) 0,04
Vedheft på anastomose 14/14(100) 14/14(100) NS 15/15(100) 14/14(100) NS
Abscess andre steder 11/14(78.5) 8/14(57.1) NS 6/15(40) 4/14(28.6) NS
Vedheft andre steder 8/14(57.1) 3/14(21.42) NS 9/15(60) 7/14(50) NS

Tabell 1: Postoperativ makroskopisk funn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Anastomotisk lekkasje er den mest alvorlige bivirkning etter kolon resection med en primær anastomose. Optimal teknikker for å forhindre anastomotisk avbrudd og lekkasje er fortsatt mangler. Lokal anvendelse av en rekke biologisk materiale er gjennomført, med varierende resultater25,26,27. Målet med cellen terapi er å lette tissue reparasjon av vev erstatning eller stimulering av lokale helbredelse gjennom paracrine sekret.

I denne rat modellen var ASC ark transplantasjon teknisk vellykket. Klinisk og histologiske evalueringer vist at effektiviteten av ASC arket redusere lekkasje etter kolon eksisjon med primære anastomose.

Transplantasjon av en ASC arket colorectal forekomst er en roman tilnærming i colorectal surgery. I denne studien, for første gang, ble en høy tetthet ASC ark transplantert. Valget for ASCs levert som cellen ark var basert på tidligere rapportert fordelene med cellen ark teknologi28,29 over konvensjonelle cellen transplantasjon teknikker. I tillegg var valget for ASCs basert på flere studier som har vist sin anti-inflammatorisk og trophic evner, spesielt i Hjertemuskel - og hud-helbredende11,12,19,32 .

ASC ark forberedelse og løsgjøring kan være utfordrende. I noen ASC givere, ASC ark løsrevet tidlig fra kultur parabol og foldet, slik at deres bruk. I denne studien ble den nøyaktige årsaken til dette problemet i disse bestemte donorer ikke identifisert. Siden et høyt inntak av kultur medium ble varslet i disse givere, ble det antatt at enkeltvarianter i spredning rate kan spille en viktig rolle. Serum belegg bistått i celle vedheft til overflaten. Med forsiktig distribusjon av cellene i kultur oppstod parabol og minimere åpning av inkubator døren etter seeding ASCs (hindre temperatur drops), mindre folding av ASC ark. På denne måten var ASC ark fra alle givere vellykket transplantert, bekrefter muligheten for teknikken.

På dagen for transplantasjon, de fleste ASC ark spontant frittliggende etter tillater thermo-responsive kultur parabolen med avkjøles til romtemperatur. Men et begrenset antall ark ikke helt fra. Forsiktig risting kultur parabol eller myk rødme på felgen med en pipette senere hjalp med komplett detachments.

For vellykket ASC ark transplantasjon til colorectal forekomst må flere viktige tiltak tas. Første, overdreven blod på webområdet anastomose skal fjernes for å sikre kontakten mellom ASC arket og serosal overflaten. Andre plasseres retten side av ASC arket på serosal overflaten av anastomose. Det er postulert at funksjonen celle ark etter innhøsting opprettholdes på grunn av bevaring av cellen overflaten proteiner og celle-til-celle krysset proteiner. I tillegg kan evne til ASC ark spontant følge serosal overflaten på kort tid ordnes av tilstedeværelsen av avsatt ECM som produseres under i vitro kultur19,20,21. Tredje, størrelsen på ASC arket og kolon diameter skal sammenlignes tillater fullstendig dekning av anastomose området. Når større flater må dekkes, betraktes bruk av flere ark.

Det er noen begrensninger i denne protokollen for ASC ark forberedelse og transplantasjon. Når benytter thermo-responsive kultur retter for å forberede ASC arket, bør temperaturen strengt opprettholdes på 37 ° C under hele prosessen å forhindre tidlig avdeling. Etter transplantasjon er ASC ark ukjent. Selv om tidligere viste at ASCs var levedyktig på 3 dager postoperatively, mitokondrie aktivitet av disse ASCs ble redusert på 7 dager postoperatively17. Cellen survival rate og dose effekten av transplantasjon er viktige spørsmål som må bli adressert i fremtiden studier. Helt observatør skjevhet kan ikke utelukkes siden ASC arket kan identifiseres macroscopically og mikroskopisk på postoperativ evalueringer. Selv om transplantert dyr ikke viser mer postoperativ kan vedheft formasjon forhold for å kontrollere dyr17, evaluering av colorectal anastomose bli hindret av tilstedeværelsen av disse intra-abdominal adhesjon.

En fordel med denne program teknikken er at det er enkelt og lett å utføre. Med bare en liten mengde av praksis og bruker universell atraumatiske tang, kunne intestinal kirurger bryte ASC arket rundt anastomose. I tillegg er kirurgi tid ikke sterkt berørt siden ASC ark umiddelbart følge vert vev. Videre, når du bruker ASC ark, ingen syntetiske biomateriale fortsatt i kroppen minimere risikoen for en fremmed kropp reaksjon.

Transplantert ASCs organisert i cellen ark vist sin evne til å redusere colorectal anastomose lekkasje. I lys av disse lovende resultater, fremtidige studier bør gjennomføres for å evaluere langsiktige virkninger både for terapeutisk og sikkerhetsmessige årsaker. Bortsett fra det har flere metoder blitt beskrevet for å endre terapeutiske effekter av ASC ark som inducing overuttrykte vaskulær endotelial vekstfaktor30. Disse metodene kan forbedre tissue reparasjon ved hjelp av ASC ark og bør vurderes i fremtiden studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at forskningen ble utført i fravær av noen kommersielle eller økonomiske forhold som kan tolkes som en potensiell interessekonflikt.

Acknowledgments

Forfatterne er Prof. Dr. S.E.R. Hovius, Dr. M.A.M. Mureau og alle kirurger av Institutt for Plastic Surgery for innsamling av subkutan fettvev. P. Sukho støttes av et stipend fra Nederland brorskap program (NFP-12/435), mens studien. Y.M. Bastiaansen-Jenniskens støttes av tilskudd fra nederlandsk leddgikt Foundation (LP11).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LG DMEM Gibco, Life technologies 22320022 ASC isolation and culture
Collagenase type I Gibco, Life technologies 17100-01 ASC Isolation
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9418 ASC Isolation
Fetal bovine serum Gibco, Life technologies 10270-106 FBS, ASC isolation and culture
3% acetic acid with methylene blue Stemcell Technologies 7060 ASC Isolation
Gentamicin Gibco, Life technologies 15750-037 ASC isolation and culture
Ampothericin B Gibco, Life technologies 15290-018 ASC isolation and culture
Shaker (Gallenkamp Environmental Shaker Model 10X 400) Akribis Scientific F240 ASC Isolation
Centrifuge Hettichlab Rotina380 ASC isolation and culture
Phosphate buffer saline Gibco, Life technologies 14190-094 PBS, ASC isolation and culture
Ascorbic acid-2-phosphate Sigma-Aldrich A8960 ASC isolation and culture
Human recombinant fibroblast growth factor 2 AbD Serotec AF-100-15 FGF2, ASC isolation and culture
Trypsin EDTA Gibco, Life technologies 25200-056 ASC culture
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2650-5x DMSO, ASC freezing
Thermo-responsive culture dishes Nunc Thermo scientific 174904 ASC sheet preperation
Non-absorbable braided silk 4/0 B Braun 21151042 surgery
Non-absorbable monofilament polyamide 8/0 B Braun G1118170 surgery
Absorbable braided polyglycolic acid 5/0 B Braun C1048207 surgery

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kawahara, H., et al. Single-incision laparoscopic right colectomy for recurrent Crohn's disease. Hepatogastroenterology. 57 (102-103), 1170-1172 (2010).
  2. Saia, M., Buja, A., Mantoan, D., Agresta, F., Baldo, V. Colon Cancer Surgery: A Retrospective Study Based on a Large Administrative Database. Surg Laparo Endo Per. 26 (6), e126-e131 (2016).
  3. Snijders, H. S., et al. Meta-analysis of the risk for anastomotic leakage, the postoperative mortality caused by leakage in relation to the overall postoperative mortality. Eur J Surg Oncol. 38 (11), 1013-1019 (2012).
  4. Daams, F., Luyer, M., Lange, J. F. Colorectal anastomotic leakage: aspects of prevention, detection and treatment. World J Gastroentero. 19 (15), 2293-2297 (2013).
  5. Testini, M., et al. Bovine pericardium patch wrapping intestinal anastomosis improves healing process and prevents leakage in a pig model. PLoS One. 9 (1), e86627 (2014).
  6. Kilroy, G. E., et al. Cytokine profile of human adipose-derived stem cells: expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors. J Cell Physiol. 212 (3), 702-709 (2007).
  7. Mussano, F., et al. Growth Factor Profile Characterization of Undifferentiated and Osteoinduced Human Adipose-Derived Stem Cells. Stem Cells Int. , 6202783 (2017).
  8. Hassan, W. U., Greiser, U., Wang, W. Role of adipose-derived stem cells in wound healing. Wound Repair Regen. 22 (3), 313-325 (2014).
  9. Shudo, Y., et al. Addition of mesenchymal stem cells enhances the therapeutic effects of skeletal myoblast cell-sheet transplantation in a rat ischemic cardiomyopathy model. Tissue Eng Pt A. 20 (3-4), 728-739 (2014).
  10. Otsuki, Y., et al. Adipose stem cell sheets improved cardiac function in the rat myocardial infarction, but did not alter cardiac contractile responses to beta-adrenergic stimulation. Biomed Res. 36 (1), 11-19 (2015).
  11. Hamdi, H., et al. Epicardial adipose stem cell sheets results in greater post-infarction survival than intramyocardial injections. Cardiovasc Res. 91 (3), 483-491 (2011).
  12. Cerqueira, M. T., et al. Human adipose stem cells cell sheet constructs impact epidermal morphogenesis in full-thickness excisional wounds. Biomacromolecules. 14 (11), 3997-4008 (2013).
  13. Perrod, G., et al. Cell Sheet Transplantation for Esophageal Stricture Prevention after Endoscopic Submucosal Dissection in a Porcine Model. PLoS One. 11 (3), e0148249 (2016).
  14. Pascual, I., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells in biosutures do not improve healing of experimental colonic anastomoses. Brit J Surg. 95 (9), 1180-1184 (2008).
  15. Yoo, J. H., et al. Adipose-tissue-derived Stem Cells Enhance the Healing of Ischemic Colonic Anastomoses: An Experimental Study in Rats. J Korean Soc Coloproctol. 28 (3), 132-139 (2012).
  16. Okano, T. Cell sheet engineering. Rinsho Shinkeigaku. 46 (11), 795-798 (2006).
  17. Chen, G., et al. Application of the cell sheet technique in tissue engineering. Biomed Rep. 3 (6), 749-757 (2015).
  18. Labbe, B., Marceau-Fortier, G., Fradette, J. Cell sheet technology for tissue engineering: the self-assembly approach using adipose-derived stromal cells. Methods Mol Biol. 702, 429-441 (2011).
  19. Sukho, P., et al. Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet Application for Tissue Healing In Vivo: A Systematic Review. Tissue Eng Part B-Re. , (2017).
  20. Sukho, P., et al. Effects of adipose stem cell sheets on colon anastomotic leakage in an experimental model: Proof of principle. Biomaterials. 140, 69-78 (2017).
  21. Verseijden, F., et al. Angiogenic capacity of human adipose-derived stromal cells during adipogenic differentiation: an in vitro study. Tissue Eng Pt A. 15 (2), 445-452 (2009).
  22. Sukho, P., et al. Effect of Cell Seeding Density and Inflammatory Cytokines on Adipose Tissue-Derived Stem Cells: an in Vitro Study. Stem Cell Rev. 13 (2), 267-277 (2017).
  23. Surface, N. U. Cell Harvesting by Temperature Reduction. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/AppNote-Nunc-UpCell-N20230.pdf (2008).
  24. Wu, Z., et al. Colorectal anastomotic leakage caused by insufficient suturing after partial colectomy: a new experimental model. Surg Infect (Larchmt). 15 (6), 733-738 (2014).
  25. Wu, Z., et al. Reducing colorectal anastomotic leakage with tissue adhesive in experimental inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 21 (5), 1038-1046 (2015).
  26. Servier. Smart servier medical art. , http://smart.servier.com (2017).
  27. Wu, Z., et al. Reducing anastomotic leakage by reinforcement of colorectal anastomosis with cyanoacrylate glue. Eur Surg Res. 50 (3-4), 255-261 (2013).
  28. Aysan, E., Dincel, O., Bektas, H., Alkan, M. Polypropylene mesh covered colonic anastomosis. Results of a new anastomosis technique. Int J Surg. 6 (3), 224-229 (2008).
  29. Suarez-Grau, J. M., et al. Fibrinogen-thrombin collagen patch reinforcement of high-risk colonic anastomoses in rats. World J Gastrointest Surg. 8 (9), 627-633 (2016).
  30. Kobayashi, J., Okano, T. Fabrication of a thermoresponsive cell culture dish: a key technology for cell sheet tissue engineering. Sci Technol Adv Mat. 11 (1), 014111 (2010).
  31. Elloumi-Hannachi, I., Yamato, M., Okano, T. Cell sheet engineering: a unique nanotechnology for scaffold-free tissue reconstruction with clinical applications in regenerative medicine. J Intern Med. 267 (1), 54-70 (2010).
  32. Miyahara, Y., et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nat Med. 12 (4), 459-465 (2006).
  33. Makarevich, P. I., et al. Enhanced angiogenesis in ischemic skeletal muscle after transplantation of cell sheets from baculovirus-transduced adipose-derived stromal cells expressing VEGF165. Stem Cell Res Ther. 6, 204 (2015).

Tags

Medisin problemet 138 Colectomy celle ark fettvev-avledet stilk celler cellen transplantasjon cellen terapi anastomose lekkasje forebygging i vivo
Transplantasjon av fettvev-avledet stilk cellen ark å redusere lekkasje etter delvis Colectomy i en rotte modell
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sukho, P., Boersema, G. S. A., Kops, … More

Sukho, P., Boersema, G. S. A., Kops, N., Lange, J. F., Kirpensteijn, J., Hesselink, J. W., Bastiaansen-Jenniskens, Y. M., Verseijden, F. Transplantation of Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet to Reduce Leakage After Partial Colectomy in A Rat Model. J. Vis. Exp. (138), e57213, doi:10.3791/57213 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter