Summary
यहां, हम अलग और murine पेरिटोनियल मस्तूल कोशिकाओं की खेती के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । हम भी उनके कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए दो प्रोटोकॉल का वर्णन: intracellular मुक्त Ca के एक फ्लोरोसेंट इमेजिंग2 + एकाग्रता और एक दानेदार बनाना जारी β-hexosaminidase के वर्णमिति ठहराव के आधार पर परख ।
Abstract
मस्तूल कोशिकाओं (MCs), प्रतिरक्षा प्रणाली के एक भाग के रूप में, कई रोगजनकों के खिलाफ और एलर्जी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की दीक्षा में मेजबान बचाव में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । क्रॉस के माध्यम से MCs के सक्रियकरण सतह IgE उच्च संबध IgE रिसेप्टर (FcεRI) के लिए बाध्य, के रूप में अच्छी तरह के रूप में कई अन्य रिसेप्टर्स की उत्तेजना के माध्यम से, मुक्त intracellular Ca के उदय शुरू2 + स्तर ([ca2 +]मैं) भड़काऊ और एलर्जी मध्यस्थों की रिहाई को बढ़ावा देता है । इन संकेतन रास्ते में शामिल आणविक घटकों की पहचान MC समारोह के विनियमन को समझने के लिए महत्वपूर्ण है । इस आलेख में, हम पेरिटोनियल लेवेज और पेरिटोनियल MCs (PMCs) की खेती द्वारा murine संयोजी ऊतक प्रकार MCs के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । इस पद्धति द्वारा विभिंन नॉकआउट माउस मॉडलों से MCs की संस्कृतियों MC संकेतन रास्ते में शामिल प्रोटीन की पहचान के लिए एक उपयोगी दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करते हैं । इसके अलावा, हम भी एक के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन एक सेल फ्रा-2 ca के ठहराव के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक के रूप में इमेजिंग के 2+ MCs में संकेतन प्रतिदीप्ति-आधारित मॉनिटरिंग [ca2 +]मैं एक विश्वसनीय और आमतौर पर इस्तेमाल किया दृष्टिकोण है अध्ययन सीए2 + स्टोर संचालित कैल्शियम प्रविष्टि है, जो MC सक्रियण के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है सहित संकेत घटनाओं, । MC दानेदार के विश्लेषण के लिए, हम एक β-hexosaminidase रिलीज परख का वर्णन । β-hexosaminidase संस्कृति माध्यम में जारी की मात्रा MCs में वर्णित सभी तीन अलग स्रावी उपसेट के लिए एक दानेदार मार्कर के रूप में माना जाता है. β-hexosaminidase आसानी से quantified में एक colorigenic सब्सट्रेट के साथ अपनी प्रतिक्रिया द्वारा किया जा सकता है microtiter प्लेट वर्णमिति परख । यह अत्यधिक reproducible तकनीक लागत प्रभावी है और कोई विशेष उपकरणों की आवश्यकता है । कुल मिलाकर, प्रदान की प्रोटोकॉल MCs ठेठ MC सतह मार्करों व्यक्त की एक उच्च उपज दर्शाता है, ठेठ रूपात्मक और MCs के phenotypic सुविधाओं को प्रदर्शित करने, और 2 सीए में reproducible के लिए अत्यधिक secretagogues प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन+- इमेजिंग और दानेदार परख ।
Introduction
MCs जन्मजात और प्राप्त प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के दौरान एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं । विशेष रूप से, MCs बैक्टीरिया और परजीवी के रूप में रोगजनकों की हत्या में भाग लेते हैं, और भी संभावित विषाक्त अंतर्जात पेप्टाइड्स या विष के घटकों को नीचा (समीक्षा के लिए Galli एट अल. २००८1) देखें । जन्मजात और अनुकूल उन्मुक्त में MCs की शारीरिक भूमिका गरम बहस का विषय है. इसलिए, विभिंन एम सी की कमी माउस मॉडल के साथ प्रदर्शन के अध्ययन में कई डेटा विसंगतियों एलर्जी2से परे MCs के प्रतिरक्षा कार्यों का एक व्यवस्थित पुनः मूल्यांकन की आवश्यकता है । परिपक्व MCs ज्यादातर ऊतकों और ऐसे त्वचा, फेफड़े, और पेट के रूप में अंगों में स्थानीयकृत रहे हैं, और आमतौर पर रक्त में छोटी संख्या में ही पाए जाते हैं । MCs ऐसे MC progenitors के रूप में टेम पुरोगामी, से प्राप्त है, और लगभग सभी संवहनी ऊतकों के microenvironments में उनके भेदभाव और परिपक्वता को पूरा1। टी सेल व्युत्पंन फैक्टर interleukin (IL)-3 चुनिंदा व्यवहार्यता, प्रसार को बढ़ावा देता है, और अपने टेम progenitors3से माउस MCs के एक pluripotent जनसंख्या के भेदभाव । स्टेम सेल फैक्टर (एससीएफ) ऊतकों में संरचनात्मक कोशिकाओं द्वारा उत्पादित और एम सी विकास, अस्तित्व, प्रवास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और4समारोह । व्यक्तिगत MCs के गुण विभिन्न टीज़र या proteoglycans को संश्लेषित और संग्रहीत करने की क्षमता के आधार पर अलग हो सकते हैं. चूहों में, तथाकथित संयोजी ऊतक-प्रकार MCs श्लैष्मिक MCs से उनके शारीरिक स्थानीयकरण, आकृति विज्ञान, और हेपरिन की सामग्री के अनुसार प्रतिष्ठित हैं और5.
MCs में, नि: शुल्क cytosolic Ca की वृद्धि+ 2 + ([ca2 +]मैं) और eicosanoids के उत्पादन के लिए अपरिहार्य है, के रूप में अच्छी तरह के रूप में साइटोकिंस के संश्लेषण और प्रतिलेखन कारकों के सक्रियकरण के लिए antigen के जवाब में और विभिन्न secretagogues6. इन उत्तेजनाओं का एक प्रमुख अनुप्रवाह लक्ष्य phospholipase सी है, जो hydrolyzes phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate को diacylglycerol (तमंचा) और inositol 1, 4, 5-trisphosphate है । तमंचा सक्रिय करता है प्रोटीन कळेनासे सी और IP3 की विज्ञप्ति आयनों Ca2 + endoplasmic जालिका से । इन दुकानों की कमी प्लाज्मा झिल्ली सीए2 + चैनलों के माध्यम से सीए2 + आमद सक्रिय, कैल्शियम प्रविष्टि संचालित स्टोर करने के लिए अग्रणी (SOCE). इस प्रक्रिया को सीए2 +-सेंसर, stromal इंटरेक्शन अणु-1 (Stim1) के संपर्क के माध्यम से पैदा होता है, endoplasmic जालिका में Orai17 के साथ-साथ परिवर्तनीय रिसेप्टर संभावित विहित (TRPC) चैनल के सक्रियकरण के माध्यम से प्रोटीन (समीक्षा के लिए देखें Freichel एट अल । २०१४8) प्लाज्मा झिल्ली में ।
इन चैनलों की शारीरिक भूमिका का अध्ययन करने के लिए, कई औषधीय (चैनल ब्लॉकर्स के आवेदन) या आनुवंशिक दृष्टिकोण आम तौर पर इस्तेमाल कर रहे हैं । उत्तरार्द्ध मामले में, प्रोटीन अभिव्यक्ति का दमन लक्ष्यीकरण mRNA (पछाड़ना) या जीनोमिक डीएनए संपादन के साथ वैश्विक या ऊतक एक एक्सॉन कोडिंग एक एक चैनल की उपइकाई के गठन (नॉकआउट) के विशिष्ट9 विलोपन के साथ हासिल की है । इन चैनलों के लिए पर्याप्त विशिष्टता के साथ एक अवरोधक की उपलब्धता सीमित है । इसके अलावा, पछाड़ना दृष्टिकोण का उपयोग कर अपने effectivity के सावधान नियंत्रण की आवश्यकता है, जैसे, पश्चिमी दाग विश्लेषण, और कई मामलों में लक्षित चैनल प्रोटीन के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी की अनुपलब्धता से प्रभावित है । इस प्रकार, नॉकआउट माउस मॉडलों का उपयोग अभी भी इस तरह के विश्लेषण के लिए सोने के मानक के रूप में माना जाता है । एक पसंदीदा इन विट्रो में एम सी कार्यों की जांच के लिए मॉडल PMCs की खेती है कि एक पूरी तरह से परिपक्व आबादी के रूप में अलग हो सकता है vivo पूर्व (के रूप में से इन विट्रो में MCs अंतर करने के लिए विरोध किया, जैसे, अस्थि मज्जा कोशिकाओं)10 . के रूप में अस्थि मज्जा व्युत्पंन MCs (BMMCs) है, जो भी सामांयतः इन विट्रो मेंMC समारोह का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है की तुलना में, FcεRI और बीटा hexosaminidase रिलीज की उत्तेजना बढ़ जाती है 8 गुना और १००-PMCs में गुना, क्रमशः । इस अनुच्छेद में, हम अलगाव और murine PMCs है, जो संवर्धन के 2 सप्ताह के बाद प्राप्त करने की अनुमति देता है की एक विधि का वर्णन शुद्ध संयोजी ऊतक प्रकार MCs की एक उच्च संख्या, आगे विश्लेषण के लिए पर्याप्त है ।
विकास और आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम संकेतक के आवेदन में हाल ही में प्रगति के बावजूद, उनके उपयोग अभी भी जीन के वितरण में कठिनाइयों के द्वारा सीमित है कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए, विशेष रूप से, उच्च विशेष कोशिकाओं में ऐसे प्राथमिक संस्कृति MCs के रूप में । इसके अलावा, के लिए फ्लोरोसेंट संकेतकों के इस समूह [Ca2 +]मैं माप अभी भी एक उच्च गतिशील रेंज के साथ ratiometric रंगों का अभाव है । इन कारणों के लिए, ratiometric के लिए पसंदीदा विधि [Ca2 +]मैं माप अभी भी फ्लोरोसेंट डाई "फ्रा-2"11का उपयोग है ।
वर्तमान में, MC सक्रियण और दानेदार के मूल्यांकन के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया दृष्टिकोण β-hexosaminidase गतिविधि का माप है । β-hexosaminidase, एक एलर्जी मध्यस्थ, एम सी granules घटक है कि सह है में से एक है MCs12से लगातार अनुपात में हिस्टामिन के साथ जारी है । β-hexosaminidase आसानी से हो सकता है और सही ढंग से एक विशेष सब्सट्रेट, जो एक colorigenic उत्पाद है कि आसानी से एक microplate वर्णमिति परख में detectable है की एक औसत दर्जे का मात्रा पैदा करता है के साथ अपनी प्रतिक्रिया के माध्यम से मापा जाता है । इस अनुच्छेद में, उत्तेजनाओं की एक किस्म के जवाब में PMCs दानेदार के विश्लेषण के लिए इस तकनीक का एक आवेदन की सूचना दी है ।
उच्च संबध plasmalemmal IgE रिसेप्टर (FcɛRI) के एकत्रीकरण एक बहुमुखी intracellular संकेतन मार्ग MCs में सक्रिय करता है, आसपास के स्रावी अंतरिक्ष में extracellular granules सामग्री की रिहाई के लिए अग्रणी । विशिष्ट प्रतिजन के अलावा, कई अन्य उत्तेजनाओं इम्यूनोमॉड्यूलेटरी मध्यस्थों की एक विविध सरणी, जैसे पूरक anaphylatoxins जारी करने के लिए सक्रिय कर सकते हैं MCs (जैसे, C3a और C5a)13, vasoconstrictor पेप्टाइड endothelin 1 (ET1)14 , साथ ही कई cationic पदार्थ और pseudoallergic प्रतिक्रियाओं उत्तेजक दवाओं (जैसे, icatibant)15 MRGPRX216के लिए बाध्यकारी द्वारा । MRGPR-प्रेरित MCs दानेदार में शामिल Intracellular संकेतन रास्ते खराब FcɛRI-मध्यस्थता Intracellular संकेतन की तुलना में के रूप में विशेषता हैं; इन रास्ते ही गहन अध्ययन किया जा करने के लिए पिछले कुछ वर्षों के दौरान17 रिसेप्टर पहचान16के बाद शुरू कर दिया. मोटे तौर पर, प्लाज्मा झिल्ली आयन MRGPRX2 उत्तेजना के बाद कैल्शियम प्रवेश में शामिल चैनलों को समझा जा रह रहे हैं । इसलिए, वर्तमान लेख भी intracellular कैल्शियम संकेतन और MRGPR एगोनिस्ट के साथ उत्तेजित MCs की दानेदार बनाना पर केंद्रित है ।
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Protocol
सभी पशु प्रक्रियाओं की देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए जर्मन कानून के दिशा निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया (आधिकारिक रूप से कार्ल्सृहे क्षेत्रीय परिषद द्वारा अनुमोदित) ।
1. पीएमसी अलगाव और Intraperitoneal लेवेज द्वारा खेती
| 1 | बर्फ |
| 2 | 10 मिलीलीटर सीरिंज |
| 3 | 27 जी सुई |
| 4 | 20 ग्राम सुई |
| 5 | स्टायरोफोम ब्लॉक और पिंस |
| 6 | संग्रह ट्यूबों (५० मिलीलीटर प्लास्टिक केंद्रापसारक ट्यूबों) |
| 7 | ७०% इथेनॉल |
| 8 | RPMI मध्यम (पूर्व ठंडा और बर्फ पर रखा) |
| 9 | पीएमसी मीडियम: RPMI मीडियम + 20% FCS (भ्रूण काफ सीरम) + 1% पेनिसिलिन Streptomycin सॉल्यूशन (Pen-Strep) |
| 10 | Dulbecco के फास्फेट बफर खारा-DPBS (बिना सीए2 + और 2 मिलीग्राम+) |
| 11 | संस्कृति की कुप्पी (25 सेमी) |
| 12 | विकास कारकों स्टॉक समाधान (IL-3:1 μg/μL; एससीएफ: २.५ μg/ |
| 13 | सीरम वैज्ञानिक पिपेट (10 मि.) |
| 14 | पिपेट सुझाव बाँझो (२० – २०० µ l) |
| 15 | Hemocytometer |
| 16 | बेंच केंद्रापसारक |
| 17 | कैंची और संदंश |
| 18 | चूहों के लिए सह2 चैंबर |
| 19 | खुले बाँझ हूड |
| 20 | बंद बाँझ डाकू |
| 21 | सेल मशीन (३७ ° c और 5% सह2) |
| 22 | स्थानान्तरण पिपेट (20 – 200 µ l) |
तालिका 1: चरण 1 के लिए सामग्री ।
-
intraperitoneal लेवेज द्वारा पीएमसी अलगाव
- सेल अलगाव से पहले, 1 तालिकामें सूचीबद्ध सामग्री तैयार करते हैं ।
- पीएमसी अलगाव के लिए 8 से 14 सप्ताह पुराने पुरुष चूहों का प्रयोग करें । सह2 साँस लेना द्वारा एक माउस Euthanize, और सजगता के नुकसान से मौत की पुष्टि. ७०% इथेनॉल के साथ माउस स्प्रे और एक फोम ब्लॉक पर इसे ठीक पिन का उपयोग (पृष्ठीय ओर नीचे) । माउस की ventral त्वचा कुंद धार कैंची का उपयोग कर निकालें । पेरिटोनियल गुहा को हानिकारक से बचें ।
नोट: हम आमतौर पर एक C57BL/6N तनाव आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ चूहों के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग करें । - बर्फ के 7 मिलीलीटर-शीत RPMI मध्यम और पेरिटोनियल गुहा में हवा के 5 मिलीलीटर एक 10 मिलीलीटर एक 27 जी सुई के साथ सुसज्जित सिरिंज का उपयोग कर सुई । ध्यान से सुई को योनि में धकेलें और किसी भी अंगों को छिद्रित न करें । एक अंग वेध के जोखिम को कम करने के लिए epididymal वसा के क्षेत्र में एक स्थान का उपयोग करें ।
- इंजेक्शन के बाद, RPMI माध्यम में पेरिटोनियल कोशिकाओं को अलग करने के लिए 1 मिनट के लिए माउस हिला । नहीं हिला माउस भी दृढ़ता से, आंतरिक अंगों को नुकसान पहुंचाने और रक्त के साथ पेरिटोनियल गुहा दूषित से बचने के लिए ।
- एक नया 20 ग्राम प्रवेशनी के साथ लैस द्वारा 10 मिलीलीटर सिरिंज का पुनः प्रयोग । फोम ब्लॉक झुकाव और धीरे से दूसरी तरफ से मध्यम आकांक्षा आसान बनाने के लिए बेंच पर दोहन से एक तरफ भीतरी अंगों शिफ्ट । एक 20 ग्राम सुई डालें, ऊपर बेवल, और भीतरी अंगों द्वारा कॉलेस्ट्रॉल से बचने के लिए धीरे से तरल पदार्थ महाप्राण (~ ०.५ एमएल/ जितना संभव हो उतना द्रव लीजिए (आमतौर पर 5-6 मिलीलीटर).
- सिरिंज से सुई निकालें और बर्फ पर एक संग्रह ट्यूब में एकत्र सेल निलंबन स्थानांतरण. एक नमूना ट्यूब छोड़ अगर वहाँ दिखाई रक्त दूषित है ।
- 5 मिनट के लिए ~ ३०० x g पर सेल निलंबन के साथ ट्यूबों केंद्रापसारक । के तहत एक बाँझ डाकू महाप्राण supernatant । प्रत्येक माउस के लिए, ठंड के 4 मिलीलीटर में नमूना छर्रों गठबंधन (4-10 डिग्री सेल्सियस) पीएमसी माध्यम और एक 25 सेमी2 संस्कृति कुप्पी करने के लिए सेल निलंबन हस्तांतरण. वृद्धि कारकों IL-3 और एससीएफ अंतिम सांद्रता 10 एनजी/एमएल और 30 एनजी/एमएल, क्रमशः जोड़ें । एक मशीन (३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2) और अगली प्रक्रिया तक ~ ४८ h के लिए मशीन में कोशिकाओं से युक्त कुप्पी प्लेस ।
-
पीएमसी संस्कृति
- 2 दिन (~ ४८ एच अलगाव के बाद): मध्यम परिवर्तन
- supernatant और गैर-अनुयाई कोशिकाओं (एरिथ्रोसाइट्स और मृत कोशिकाओं) को हटाने के लिए, कुप्पी के किनारे पर एक पाश्चर पिपेट टिप रखकर मध्यम से महाप्राण और कुप्पी पकड़कर लगभग क्षैतिज रूप में धारण करें. माउस प्रति पूर्व गर्म पीएमसी मध्यम के 4 मिलीलीटर जोड़ें । वृद्धि कारकों IL-3 जोड़ें (10 एनजी/एमएल) और एससीएफ (30 एनजी/ एक मशीन (३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2) में कोशिकाओं से युक्त कुप्पी रखें ।
- 9 दिन: सेल बंटवारे
- सेल संस्कृति कुप्पी से एक ५० मिलीलीटर प्लास्टिक केंद्रापसारक ट्यूब में सेल निलंबन स्थानांतरण । कुप्पी को तीन बार धो लें 10 मिलीलीटर पूर्व गर्म (३७ डिग्री सेल्सियस) Dulbecco के फॉस्फेट-बफर खारा (DPBS), एक ही ५० मिलीलीटर प्लास्टिक केंद्रापसारक ट्यूब में अलग कोशिकाओं के साथ सेल निलंबन इकट्ठा । एक hemocytometer द्वारा सेल एकाग्रता गिनती, और कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना ।
- 5 मिनट के लिए ~ ३०० x g पर सेल निलंबन केंद्रापसारक और supernatant महाप्राण । पूर्व गर्म पीएमसी मध्यम (३७ डिग्री सेल्सियस) में गोली पुनर्प्राप्त करने के लिए सेल एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 1 x 106 कोशिकाओं/ एक नया 25 सेमी2 संस्कृति कुप्पी के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण । fibroblasts पालन के साथ पुरानी कुप्पी को नीचे की ओर छोड़ें ।
- वृद्धि कारकों IL-3 जोड़ें (10 एनजी/एमएल) और एससीएफ (30 एनजी/एमएल), और एक मशीन में कोशिकाओं से युक्त कुप्पी जगह (३७ ° c और 5% CO2) ।
- दिन 12 – 15: सेल माप
- FcɛRI रिसेप्टर्स की उत्तेजना के साथ किसी भी प्रयोग की योजना बनाई है, मानक संस्कृति माध्यम में IgE विरोधी DNP के ३०० एनजी/एमएल के साथ रातोंरात कोशिकाओं का इलाज । चरण 2 या चरण 3 के साथ आगे बढ़ें ।
- 2 दिन (~ ४८ एच अलगाव के बाद): मध्यम परिवर्तन
2. PMCs में Fluorometric Intracellular नि: शुल्क कैल्शियम एकाग्रता माप
- माप करने से पहले, तालिका 2में सूचीबद्ध सामग्री तैयार करें । इसके अलावा, एक इमेजिंग सेटअप से मिलकर तैयार: औंधा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप; उद्देश्य: 40X/ फ्रा 2 फिल्टर सेट; सीसीडी कैमरा; उत्तेजना प्रकाश स्रोत; इमेजिंग अधिग्रहण कार्यक्रम; ग्रेविटी फेड समाधान आवेदन प्रणाली ।
| 1 | पीएमसी (12-15 दिन पुराना) 1 x 106 कोशिकाओं/ |
| 2 | Concanavalin एक |
| 3 | फ्रा-2 AM |
| 4 | Pluronic एफ-१२७ २०% समाधान |
| 5 | कवर फिसल जाता है चश्मा दौर; ø 25 मिमी; नंबर 1 |
| 6 | DNP-HSA (dinitrophenol-ह्यूमन सीरम एल्ब्युमिन) स्टॉक समाधान |
| 7 | Anti-DNP-एंटीबॉडी (IgE) शेयर समाधान |
| 8 | फ्लैट नीचे प्लेट (12 कुओं) |
| 9 | यौगिक 48/80 स्टॉक समाधान |
| 10 | अच्छी तरह से कवर इमेजिंग मंडलों |
| 11 | Hemocytometer |
| 12 | स्थानान्तरण पिपेट (20 – 200 µ l) |
तालिका 2: चरण 2 के लिए सामग्री ।
-
फ्रा-2 इमेजिंग तैयारी
- एक hemocytometer का उपयोग कर एक सेल गिनती प्रदर्शन और 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल के लिए सेल एकाग्रता समायोजित करें । PMCs कालोनियों को धीरे से pipetting (3-5 बार) के साथ सेल सस्पेंशन को 1 मिलीलीटर पिपेट टिप से विभाजित करें ।
- एक ca2 +-युक्त HEPES बफ़र्ड नमक समाधान (ca2 +-HBSS) १३५ mm NaCl, 6 मिमी KCl, 2 मिमी CaCl2, १.२ मिमी MgCl2, 10 मिमी HEPES, और 12 मिमी ग्लूकोज से बना तैयार करें । 3 एम NaOH के साथ ७.४ करने के लिए पीएच समायोजित करें ।
- एक बाँझ डाकू के तहत प्रत्येक 25 मिमी दौर कवर कांच पर concanavalin एक समाधान (०.१ मिलीग्राम/एमएल में एच2ओ) के pipetting 1 ड्रॉप द्वारा concanavalin एक लेपित स्लाइड तैयार करें । के लिए कवर पर बूंदों को छोड़ दें ंयूनतम 1 मिनट के लिए फिसल जाता है, तो एक पिपेट के साथ समाधान के सबसे दूर है और जाने के कवर ४५ मिनट के लिए हवा-सूखा फिसल जाता है । ध्यान से concanavalin प्रेस एक इलाज कवर रबर इमेजिंग चैंबर पर फिसल जाता है ( सामग्री की तालिकादेखें) जब तक वे माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग चैंबर प्राप्त करने के लिए देते हैं ।
नोट: पाली-L-Lysine लेपित स्लाइड्स एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । - dimethyl sulfoxide (DMSO) में फ्लोरोसेंट सीए2 + डाई फ्रा-2 (1 मिमी) को भंग । प्रकाश से संरक्षित इस समाधान स्टोर ।
- फ्रा-2 Ca में स्टॉक समाधान 2+-HBSS 5 µ मीटर की एक अंतिम एकाग्रता के लिए "लोड हो रहा है बफर तैयार करने के लिए" पतला । DMSO में 20% pluronic एफ-१२७ के 5 µ l/एमएल के साथ अनुपूरक ।
- पीएमसी सेल सस्पेंशन के ५०० µ l के साथ "लोडिंग बफर" के ५०० µ l को मिलाएं । पिपेट इमेजिंग चैंबर में मिश्रण और 20 के लिए कोशिकाओं गर्मी-अंधेरे में कमरे के तापमान पर 30 मिनट ।
- उत्तेजना प्रोटोकॉल के अनुसार विभिंन समाधानों के साथ ग्रेविटी फेड आवेदन प्रणाली की स्थापना की । पूरक 2 सीए के ४० एमएल के साथ सिरिंज 1+-HBSS समाधान, 2 सिरिंज की ४० मिलीलीटर के साथ 2+-HBSS समाधान से युक्त १०० एनजी/एमएल DNP, 3 सिरिंज के साथ ४० एमएल के सीए2 +-HBSS समाधान युक्त ५० µ g/एमएल यौगिक 48/80, 4 सिरिंज के साथ ४० एमएल के नाममात्र सीए2 +-मुक्त HBSS समाधान, और 5 सिरिंज के साथ नाममात्र की ४० मिलीलीटर सीए2 +-मुक्त-HBSS समाधान युक्त 2 µ m Thapsigargin.
- उस पर विसर्जन तेल की एक छोटी सी बूंद रखकर एक 40X उच्च एपर्चर तेल विसर्जन उद्देश्य तैयार करें ।
- उल्टे माइक्रोस्कोप के मंच पर आवेदन प्रणाली माउंट । आवेदन प्रणाली में लोड कोशिकाओं के साथ इमेजिंग चैंबर रखो और यह रिकॉर्डिंग के दौरान आंदोलन को रोकने के लिए सुरक्षित । संचारित प्रकाश को चालू करें और कक्षों को ध्यान दें ।
- कोशिकाओं कुल्ला 2 सीए के साथ तीन बार+-HBSS बफर गुरुत्वाकर्षण खिलाया आवेदन प्रणाली का उपयोग कर ।
- फ्रा-2 de-esterification के लिए 5 मिनट के लिए सीए2 +-HBSS में कोशिकाओं की मशीन ।
- कोशिकाओं एक और समय इमेजिंग शुरू करने से पहले कुल्ला, किसी भी संभावित लीक फ्लोरोसेंट डाई हटाने के लिए ।
-
सेल इमेजिंग
- भौतिक प्राप्ति मोड में इमेजिंग प्राप्ति प्रोग्राम प्रारंभ करें । सेटअप विंडो खोलें, और ध्यान और इष्टतम अधिग्रहण समय (जो ३४० एनएम और ३८० एनएम के साथ उत्तेजना के लिए ही होना चाहिए और आम तौर पर 50 के बीच पर्वतमाला-150 ms) समायोजित करें ।
नोट: डाई के photobleaching से बचने के लिए किसी भी प्रकाश के लिए फ्रा-2 लोड सेल के जोखिम को कम. - कोई संदर्भ चित्र छवि, और कक्षों को रुचि के क्षेत्रों (ROI) के रूप में चिह्नित करें. पिछले रॉय को किसी ऐसे क्षेत्र में चिह्नित करें जहां कोई कक्ष मौजूद न हो और इसे पृष्ठभूमि के रूप में परिभाषित करे ।
- सेटअप को पूरा करें और 5 s प्राप्ति दर के साथ माप प्रारंभ करें ।
नोट: कोशिकाओं को एकांतर से ३४० एनएम और ३८० एनएम के उत्तेजना प्रकाश के साथ प्रकाशित किया जाएगा, और उत्सर्जित प्रतिदीप्ति (> 510 एनएम) सीसीडी कैमरे का उपयोग कर एकत्र किया जाएगा । प्रतिदीप्ति की छवियों F340 एनएम और प्रिंटर f380 एनएम के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अनुपात (F340 एनएम/प्रिंटर f380 एनएम) तीन खिड़कियों में प्रदर्शित किया जाएगा संकेत देता है । व्यक्तिगत ROIs प्रतिदीप्ति तीव्रता माध्य मूल्यों के समय पाठ्यक्रम के चार्ट भी लगातार प्रदर्शित किया जाएगा । - प्रयोग के डिजाइन के अनुसार उचित चक्र संख्या में समाधान जोड़ें:
- [Ca2 +] के प्रतिजन प्रेरित उंनयन को मापने के लिएमैं, के रूप में चित्रा 2ए, बी3 में सचित्र, 20 चक्र के बाद सिरिंज 2 समाधान लागू करते हैं, और १५० चक्र के बाद रिकॉर्डिंग बंद करो ।
- को मापने के लिए 48/80-प्रेरित उंनयन की [Ca2 +]मैं,के रूप में चित्रा 2सीमें सचित्र, 20 चक्र के बाद सिरिंज 3 समाधान लागू करते हैं, और १५० चक्र के बाद रिकॉर्डिंग बंद करो ।
- के उन्नयन को मापने के लिए [Ca2 +]मैं SOCE द्वारा पैदा की, के रूप में चित्रा 2डीमें सचित्र, 10 चक्र के बाद सिरिंज 4 समाधान लागू, ७० चक्र के बाद सिरिंज 5 समाधान लागू, १२० चक्र के बाद सिरिंज 4 समाधान लागू, १५० चक्र के बाद सिरिंज 1 समाधान लागू करें, और २२० चक्र के बाद रिकॉर्डिंग बंद करो.
- माप परिष्करण के बाद, के साथ और पृष्ठभूमि सुधार के बिना दोनों उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के लिए मापा तीव्रता से युक्त एक अनुपात तालिका में परिणाम कन्वर्ट, साथ ही साथ और हर रॉय के लिए पृष्ठभूमि सुधार के बिना अनुपात मूल्यों और हर माप समय बिंदु । अधिग्रहण कार्यक्रम में, लगातार बटन प्रेस: "शुरू कटर", "मार्क सभी", "कंवर्ट सभी", "फिजियोलॉजी मापन", "ठीक है," ठीक है. " फ़ाइलों को तालिकाओं और छवि स्टैक्स के रूप में सहेजें ऑफ़-लाइन विश्लेषण के लिए ।
- भौतिक प्राप्ति मोड में इमेजिंग प्राप्ति प्रोग्राम प्रारंभ करें । सेटअप विंडो खोलें, और ध्यान और इष्टतम अधिग्रहण समय (जो ३४० एनएम और ३८० एनएम के साथ उत्तेजना के लिए ही होना चाहिए और आम तौर पर 50 के बीच पर्वतमाला-150 ms) समायोजित करें ।
3. PMCs में बीटा-hexosaminidase रिलीज माप
| 1 | पीएमसी (12-15 दिन पुराना) 1 x 106 कोशिकाओं/ |
| 2 | Anti-DNP-एंटीबॉडी (IgE) शेयर समाधान |
| 3 | DNP-HSA स्टॉक समाधान |
| 4 | यौगिक 48/80 स्टॉक समाधान |
| 5 | Ionomycin |
| 6 | ९६-अच्छी तरह से प्लेट, वी के आकार का नीचे |
| 7 | ९६-अच्छी तरह से प्लेटें, फ्लैट नीचे |
| 8 | प्लास्टिक केंद्रापसारक ट्यूबों (15 मिलीलीटर) |
| 9 | सीरम वैज्ञानिक पिपेट |
| 10 | सेल मशीन (३७ ° c और 5% सह2) |
| 11 | बेंच केंद्रापसारक |
| 12 | ऑप्टिकल घनत्व माप के लिए Microtiter प्लेट रीडर |
| 13 | मल्टीचैनल पिपेट (20 – 200 μL) |
| 14 | Hemocytometer |
तालिका 3: चरण 3 के लिए सामग्री ।
- माप से पहले, 3 तालिकामें सूचीबद्ध सामग्री तैयार करते हैं ।
नोट: β-hexosaminidase के बाद MCs से जारी उनकी उत्तेजना hydrolyzes पी-nitrophenyl-एसिटाइल-डी-glucosamine (pNAG) में पी-nitrophenol और एन-एसिटाइल-डी-glucosamine. नमूना में β-hexosaminidase की मात्रा पी-nitrophenol कि गठन किया जाएगा की राशि के लिए आनुपातिक है । "बंद करो समाधान" के एक उच्च पीएच वातावरण में, पी-nitrophenol पूरी तरह से deprotonated पी-nitrophenolat के रूप में मौजूद है और ४०५ एनएम पर इसके प्रकाश अवशोषक द्वारा पता लगाया जा सकता है । - १३० मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, १.४ मिमी CaCl2, 1 मिमी MgCl2, 10 मिमी HEPES, ५.६ मिमी ग्लूकोज, और BSA ०.१% युक्त Tyrode के समाधान तैयार करें । 3 एम NaOH के साथ ७.४ करने के लिए पीएच समायोजित करें ।
- Tyrode के समाधान के लिए ट्राइटन X-१०० का 1% वॉल्यूम जोड़कर lysis समाधान तैयार करें ।
- २०० mM glycine से बना बंद समाधान तैयार है और NaOH के साथ १०.७ के लिए पीएच समायोजित करें ।
- pNAG समाधान तैयार करें (4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside) समाधान ०.४ एम साइट्रिक एसिड में pNAG भंग करके 4 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए.
- परख के लिए आवश्यक कोशिकाओं की मात्रा की गणना (डुप्लिकेट में परख प्रदर्शन) । प्रति कुआं २००,००० PMCs का उपयोग करें । (Tyrode के समाधान के रूप में किसी भी secretagogues के बिना नकारात्मक नियंत्रण के रूप में 2 कुओं का उपयोग करें DNP या यौगिक 48/80) और 2 कुओं के रूप में सकारात्मक नियंत्रण (Tyrode समाधान के साथ 10 µ m Ionomycin) हर जीनोटाइप के लिए.
- एक 15 मिलीलीटर प्लास्टिक केंद्रापसारक ट्यूब में कोशिकाओं स्थानांतरण, Tyrode के समाधान के साथ 15 मिलीलीटर के लिए मात्रा को समायोजित, और 4 मिनट के लिए २०० x g पर केंद्रापसारक । एक पाश्चर पिपेट के साथ supernatant निकालें और Tyrode के समाधान में कोशिकाओं को पुनः स्थगित 2 x 106 कोशिकाओं एमएल.
- एक ९६-अच्छी तरह से वी नीचे अच्छी तरह से प्लेट के लिए प्रति अच्छी तरह से सेल निलंबन के १०० µ एल स्थानांतरण । एक अच्छी तरह से या तो उत्तेजना या नियंत्रण समाधान के 25 µ एल जोड़ें (pipetting योजना के अनुसार चित्रा 3एमें सचित्र) । ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2पर ४५ मिनट के लिए कोशिकाओं की मशीन ।
- 5 मिनट के लिए बर्फ पर ९६-अच्छी तरह से थाली रखकर प्रतिक्रिया बंद करो । फिर, 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को १२० x gपर 4 मिनट के लिए केंद्रापसारक स्थानांतरण १२० एक फ्लैट-नीचे ९६ अच्छी तरह से प्लेट के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर supernatant के µ एल और यह बर्फ पर जगह है । सावधानी से सेल छर्रों को छूने से बचने, लेकिन पूरी तरह से supernatant महाप्राण.
- जोड़ें १२५ µ lysis बफर के एल सेल छर्रों के लिए । कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेल छर्रों मशीन और दोहराया pipetting (लगभग 5 बार) द्वारा गर्मी के बाद उन्हें reसस्पेंड ।
- पिपेट एक नए फ्लैट के नीचे ९६-अच्छी तरह से प्लेट के आवश्यक कुओं में pNAG समाधान (4 मिमी) के 25 µ एल । प्रत्येक supernatant से 25 µ l को जोड़ कर तैयार pNAG समाधान के साथ ही प्रत्येक कोशिका के 25 µ l को lysate.
- ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए प्रतिक्रिया बैचों की मशीन । मशीन के बाद, पिपेट १५० बंद समाधान के µ एल एक अच्छी तरह से प्रतिक्रिया को रोकने के लिए ।
- एक microplate पाठक स्वत: पृष्ठभूमि घटाव के लिए संदर्भ ६३० एनएम के साथ ४०५ एनएम में स्थापित एक दोहरे तरंग दैर्ध्य का उपयोग कर के साथ थाली का विश्लेषण । अधिग्रहण कार्यक्रम में, बॉक्स "संदर्भ" टिक और "अवशोषक" कार्यक्रम तत्व मेनू में, ड्रॉप डाउन सूची से "६३० एनएम" का चयन करें । यदि नमूनों की ऑप्टिकल घनत्व बहुत अधिक है, को मापने से पहले जांच की एक उपयुक्त कमजोर पड़ने तैयार ।
- निम्न समीकरण के अनुसार β-hexosaminidase रिलीज़ के प्रतिशत की गणना करें:
जहां रिलीज [%] विशिष्ट बीटा-hexosaminidase रिलीज का प्रतिशत है, एक [supernatant] पृष्ठभूमि supernatant के अवशोषण सही है, और एक [lysate] पृष्ठभूमि ठीक इसी सेल lysate के अवशोषण है ।
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Representative Results
PMCs 3 जंगली प्रकार चूहों से अलग थे (C57BL/6N) intraperitoneal लेवेज द्वारा और आगे RPMI माध्यम में प्रसंस्कृत 20% FCS और 1% कलम के साथ पूरक-Strep वृद्धि कारकों की उपस्थिति में (IL-3 पर 10 एनजी/एमएल और एससीएफ में बाँझ humidified शर्तों के तहत 30 एनजी/ ३७ ° c और 5% कं2। मध्यम सेल अलगाव के बाद 2 और 9 दिनों में बदल गया था । सेल आकृति विज्ञान पारेषण प्रकाश उद्योग इमेजिंग का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था ( चित्र 1A, Bदेखें) । सेल कंट्रास्ट और दानेदार अच्छा सेल व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया । इन शर्तों के तहत संवर्धन के 2 सप्ताह के बाद, १.५ x 107 कोशिकाओं की एक सजातीय जनसंख्या प्राप्त की थी । कोशिकाओं के प्रवाह cytometry विश्लेषण के साथ विरोधी IgE एंटीबॉडी संयुग्मित के साथ दाग FITC और एंटी सी किट एंटीबॉडी संयुग्मित पीई के साथ FITC सकारात्मक और ९९.८% पीई सकारात्मक कोशिकाओं का ९८.६% पता चला (चित्रा 1सी) । ९८.५% प्रसंस्कृत कोशिकाओं के FITC और पीई के लिए डबल सकारात्मक थे (चित्रा 1सी), परिपक्व MCs की विशिष्ट सुविधाओं का प्रदर्शन ।
प्राप्त कोशिकाओं के आगे कार्यात्मक विश्लेषण के लिए, fluorometric [Ca2 +]मैं फ्रा का उपयोग कर माप-2 फ्लोरोसेंट संकेतक प्रदर्शन किया गया । फ्रा-2 भरी हुई कोशिकाओं को एकांतर से प्रबुद्ध थे ३४० एनएम और ३८० एनएम उत्तेजना प्रकाश हर 5 एस और प्रतिदीप्ति > 510 एनएम एक सीसीडी कैमरा का उपयोग कर पंजीकृत किया गया था । प्रतिदीप्ति (F340/प्रिंटर f380) का अनुपात लगातार नजर आ रहा था । DNP (१०० एनजी/एमएल) पीएमसी के लिए IgE विरोधी के ३०० एनजी/एमएल के साथ रात भर की मशीन DNP के एक स्पष्ट पदोंनति पैदा की [Ca2 +]मैं स्तर है, जो धीरे से कई मिनट से अधिक अपनी आधी अधिकतम करने के लिए खोखली (चित्रा 2ए, बी) । सेल प्रतिक्रियाओं की परिवर्तनशीलता अपेक्षाकृत कम थी (चित्रा 2ए, बी) । ५० µ जी के साथ MRGPRB2 रिसेप्टर्स की उत्तेजना/एक ही समय प्रोटोकॉल के साथ भी काफी वृद्धि हुई [Ca2 +] फ्रामें मैं -2-प्रतिक्रिया का एक बहुत ही मतलब है आयाम के साथ PMCs भरी हुई (चित्रा 2सी) । PMCs में SOCE के विश्लेषण के लिए, एक "फिर से जोड़" प्रोटोकॉल लागू किया गया था: माप की शुरुआत के बाद 10 चक्र, बाहरी Ca2 + हटा दिया गया था, और चक्र के दौरान 70 – 120, Thapsigargin (2 µ m), endoplasmic जालिका ATPase के एक अवरोधक था intracellular Ca के घट के लिए आवेदन किया2 + स्टोर और SOCE के अधिक से अधिक सक्रियण के लिए. क्षणिक [ca2 +]मैं ऊंचाई प्रतिबिंबित ca 2 + intracellular ca से रिलीज + एक नाममात्र सीए2+ में स्टोर-मुक्त स्नान समाधान (चित्रा 2डी) । बाह्य ca 2+ एकाग्रता १५० चक्र के बाद 2 मिमी को बहाल करने के एक प्रमुख वृद्धि हुई [ca2 +]मैं SOCE चैनलों (चित्रा 2डी) के माध्यम से सीए2 + आमद के कारण स्तर. ca 2+ प्रतिक्रिया के इस घटक दृढ़ता से 10 µ एम जीएसके 7975A, एक CRAC अवरोधक के रूप में जाना जाता है की उपस्थिति में बाधा थी, जबकि ca2 + रिलीज intracellular ca से2 + स्टोर अपरिवर्तित बनी (चित्रा 2डी ).
अगले चरण में, हम FcɛRI उच्च अपनत्व रिसेप्टर्स या MRGPRB2 रिसेप्टर्स की उत्तेजना के crosslinking पर दानेदार से गुजरना करने के लिए अलग PMCs की क्षमता का परीक्षण किया. इस प्रयोजन के लए अ ß य-hexosaminidase जारी परख की गई । कोशिकाओं को एक V-नीचे ९६-अच्छी तरह से थाली में जोड़ा गया (2 x 105 कोशिकाओं/अच्छी तरह से) और ३७ डिग्री सेल्सियस पर ४५ मिनट के लिए चित्रा 3ए में सचित्र योजना के अनुसार प्रेरित किया । प्लेट केंद्रापसारक और supernatant के हटाने के बाद, छर्रों लीजड ड थे । व्यक्तिगत supernatants और गोली lysates के अ ß य-hexosaminidase सामग्री को ३७ ° c पर 1 ज की मशीन के दौरान pNAG के साथ उनकी प्रतिक्रियाओं द्वारा विश्लेषित किया गया । प्रतिक्रिया उत्पादों की मात्रा का पता लगाया गया colorimetrically और जारी किए गए अ ß य-hexosaminidase के प्रतिशत की गणना की गई ( चित्र 3Bदेखें) । सहज रिलीज बहुत कम था (1%), जबकि 10 µ एम Ionomycin और यौगिक 48/80 पर ५० µ जी/एमएल के रूप में मजबूत दानेदार उत्तेजना के लिए प्रतिक्रियाओं ४०% से अधिक थे और ६०%, क्रमशः । DNP उत्तेजना के लिए दानेदार जवाब खुराक 10 की एकाग्रता सीमा से अधिक निर्भर थे-300 एनजी/ एक साथ, इन डेटा स्पष्ट रूप से अलग PMCs की एक अच्छी कार्यात्मक स्थिति संकेत मिलता है ।
चित्रा 1 : प्राथमिक संस्कृति murine जंगली प्रकार के लक्षण वर्णन PMCs और प्रवाह cytometry विश्लेषण का उपयोग कर प्रदर्शन किया । (A, B) प्रतिनिधि छवियों intraperitoneal लेवेज द्वारा सेल अलगाव के बाद 25 सेमी2 प्लास्टिक की कुप्पी 1 ज में PMCs के 20X plasDIC उद्देश्य का उपयोग कर प्राप्त (ए) और संवर्धन (बी) के दिन 9 पर । सही निचले कोने में स्केल सलाखों के संकेत १०० µm । (ग) उपर्युक्त प्रोटोकॉल के अनुसार PMCs का प्रवाह cytometry विश्लेषण (कल्चर्ड 12 दिन) एंटीबॉडी संयुग्मित (Fluorescein) और एंटी-सी-किट के साथ एंटी-IgE Isothiocyanate FITC के साथ सह-दाग Phycoerythrin (पीई) के साथ एंटीबॉडी संयुग्मित । सेल घनत्व साजिश चार चक्रों में विभाजित है: Q1, पीई ऊपर autofluorescence स्तर/FITC नीचे autofluorescence स्तर; Q2, PE ऊपर autofluorescence स्तर/FITC ऊपर autofluorescence स्तर; Q3, PE नीचे autofluorescence स्तर/FITC नीचे autofluorescence स्तर; Q4, PE नीचे autofluorescence स्तर autofluorescence स्तर से ऊपर FITC/ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2 : [Ca2 +] की रिकॉर्डिंग मैं फ्रा में-2 भरी हुई PMCs जंगली प्रकार चूहों से पृथक । [Ca 2 + ]मैं प्रतिदीप्ति F340/प्रिंटर f380 अनुपात के रूप में प्रस्तुत किया । (ए) के प्रतिनिधि अंश [सीए2 +]मैं व्यक्तिगत PMCs के समय पाठ्यक्रम (n = ३८) DNP के साथ उत्तेजित (१०० एनजी/ (ख) DNP के समय पाठ्यक्रम (१०० एनजी/एमएल)-पैदा [सीए2 +]मैं तरक्की । प्रत्येक डेटा बिंदु इंगित करता है कि कक्ष A में सचित्र ३८ व्यक्तिगत कक्षों से प्राप्त अर्थ मान PMCs ३०० एनजी/IgE विरोधी DNP के साथ रात भर इलाज कर रहे थे । (ग) यौगिक 48/80-प्रेरित [Ca2 +]मैं PMCs में उंनयन (n = ६०) के माध्य मूल्यों का समय पाठ्यक्रम । (घ) का मतलब मूल्यों का समय पाठ्यक्रम [ca 2+]मैं intracellular ca 2 के दौरान परिवर्तन+-स्टोर के 2 µ एम Thapsigargin (टीजी) के आवेदन से प्रेरित घट में नाममात्र ca2 +-मुक्त समाधान, स्टोर द्वारा पीछा किया संचालित कैल्शियम की आमद के बाद पुन: 2 मिमी Ca2 + नियंत्रण समूह (n = ४४) में स्नान समाधान में PMCs (काले चौकों) और स्नान समाधान (नीले चौकों) में जीएसके 7975A के 10 µ मीटर की उपस्थिति में (n = ४१) । B, C, और D में, त्रुटि पट्टियां मानक त्रुटि का माध्य दिखाएं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3 : बीटा-hexosaminidase रिलीज़ वर्णमिति मल्टी-वेल माप जंगली प्रकार चूहों से अलग PMCs के साथ प्रदर्शन किया. (क) ९६ की उत्तेजना योजना-अच्छी तरह से बीटा-hexosaminidase परख प्रदर्शन के लिए प्लेट pipetting; परिणाम पैनल में प्रस्तुत कर रहे हैं B. "Spontan" किसी भी secretagogues के अलावा बिना Tyrode के समाधान के pipetting से मेल खाती है; IM = Ionomycin; सीपी 48/80 = यौगिक 48/80. (ख) बार ग्राफ Ionomycin (आईएम), dinitrophenol-मानव सीरम एल्ब्युमिन (DNP) और यौगिक 48/80 (सीपी 48/80) के साथ उत्तेजना के बाद बेसल शर्तों (Spont) के तहत ß-hexosaminidase रिहाई के प्रतिशत illustrating, संकेत सांद्रता के साथ । परख नकल में प्रदर्शन किया गया था; त्रुटि पट्टियां माध्य की मानक त्रुटि दिखाती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
mc मॉडल को सफलतापूर्वक mc दानेदार, chemotaxis, आसंजन, साथ ही साथ स्पष्ट intracellular संकेतन transduction mc सक्रियण में शामिल रास्ते का अध्ययन किया जा सकता है । कुछ शोधकर्ता मानव MCs मॉडलों का उपयोग करते हैं, जैसे कि अमर रेखाओं (LAD2 and HMC1) या गर्भनाल रक्त जनक कोशिकाओं से व्युत्पंन मानव MCs (CD133 +) और परिधीय रक्त जनक कोशिकाओं (CD34 +) । दूसरों को ऐसे अमर (चूहे basophilic ल्यूकेमिया RBL-2H3 एम सी लाइन) या प्राथमिक प्रसंस्कृत (माउस अस्थि मज्जा-व्युत्पंन MCs BMMCs, PMCs) मॉडल के रूप में एक एम सी मॉडल को कुतर पसंद करते हैं । Murine प्राथमिक MCs के लिए कई "नॉक आउट" माउस मॉडल, जो विशेष रूप से जीन और इनकोडिंग प्रोटीन के शारीरिक कार्यों की खोज करने के लिए सोने के मानक दृष्टिकोण रहे है में MC समारोह का विश्लेषण किया जा सकता है । पर्याप्त selectivity और शक्ति के लिए औषधीय उपकरणों के घाटे इस विधि एम सी सक्रियण18द्वारा संकेत transduction के तंत्र की जांच के लिए विशेष रूप से मूल्यवान बनाता है । Murine PMCs संयोजी ऊतक phenotype है कि एक परिपक्व आकृति विज्ञान और उच्च दानेदार प्रदर्शित करता है । वे BMMCs की तरह FcεRI के प्रतिजन crosslinking करने के लिए ही अच्छी तरह से जवाब नहीं है, लेकिन यह भी endothelin 1 या यौगिक ४८ के रूप में कई अतिरिक्त रिसेप्टर्स के एगोनिस्ट द्वारा सक्रिय कर रहे हैं. हालांकि, PMCs की उपज आमतौर पर काफी कम के रूप में BMMCs की तुलना में है और आमतौर पर एक पश्चिमी दाग या किसी अंय तकनीक है कि कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता है प्रदर्शन करने के लिए पर्याप्त नहीं है । PMCs के अलगाव और शुद्धि के लिए कई तकनीकों का वर्णन किया गया है । उदाहरण के लिए, Percoll ग्रैडिएंट केंद्रापसारक कोशिकाओं की एक उच्च शुद्धता उपज के लिए सूचित किया गया था19; हालांकि, इस तकनीक के साथ प्राप्त कोशिकाओं की संख्या आमतौर पर अपेक्षाकृत कम है । यहां बताए गए प्रोटोकॉल में सबसे अहम कदम पेरिटोनियल गुहा से सेल सस्पेंशन की आकांक्षा है । नमूना के रक्त संदूषण से परहेज और मध्यम संभव की अधिक से अधिक मात्रा aspirating उच्च शुद्धता के PMCs की एक उच्च संख्या प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं । कुछ माउस उपभेदों के साथ, एक अधिक से अधिक पीएमसी संख्या केवल एक छोटा (11-12 दिन) संवर्धन अवधि के द्वारा प्राप्त की है । इन कक्षों को एक लंबा समय के लिए culture स्थितियों में छोड़ने केवल कक्ष संख्या की कमी करने के लिए लीड ।
वर्तमान अध्ययन में, हम एक सरल परिपक्व MCs कि यह माउस पेरिटोनियल गुहा से एक अत्यधिक शुद्ध एम सी आबादी प्राप्त करने के लिए संभव बनाता है के अलगाव के लिए उपयुक्त प्रोटोकॉल का वर्णन । प्राप्त कोशिकाओं को एक उच्च एकरूपता और प्रदर्शन ठेठ एम सी सुविधाओं, विशिष्ट मार्कर रिसेप्टर्स (किट और FcεRI) की अभिव्यक्ति के रूप में की विशेषता है । इन कोशिकाओं को स्पष्ट रूप से प्रदर्शित MC विशेषता को दानेदार बनाना और उनके [Ca2 +वृद्धि]मैं FcɛRI और MRGPR सक्रियण के जवाब में ।
एम सी संकेत कसकर [ca 2 से संबंधित है+]मैं intracellular स्टोर और सीए2 + प्लाज्मा झिल्ली चैनलों के माध्यम से प्रवेश से2 + रिलीज ca द्वारा निर्धारित स्तर । [Ca2 +] मैं उंनयन intracellular संकेतन रास्ते की एक जटिल है कि एम सी दानेदार बनाना ट्रिगर सक्रिय करता है । अन्य गैर उत्तेजित कोशिकाओं में के रूप में, मुख्य सीए2 + MCs में आमद मार्ग ca2 +-स्टोर की कमी से सक्रिय SOCE है. इस संकेतन मार्ग में शामिल चैनलों की पहचान MC फ़ंक्शन के विनियमन को समझने के लिए महत्वपूर्ण है । SOCE मार्ग के आणविक घटकों की पहचान के लिए, microfluorometric फ्लोरोसेंट सीए2 + संकेतक और "पैच-क्लैंप" electrophysiological दृष्टिकोण का उपयोग तकनीक एक प्रमुख भूमिका निभाई है । हालांकि, [ca2 +] के उंनयनमैं स्तर ca2 + रिलीज और SOCE का योग है । 2 सीए के इन दो चरणों+ जुड़ाव भेदभाव करने के लिए, तथाकथित "ca2 + फिर से जोड़" प्रोटोकॉल (समीक्षा के लिए बर्ड एट अल २००८20) पहले विकसित किया गया था । इस प्रोटोकॉल में, बाहरी नमक समाधान एक सामान्य [ca2 +]ओ (1-2 मिमी) एक नाममात्र कै2 +-मुक्त समाधान करने के लिए युक्त से बंद है । इन शर्तों के तहत कोशिकाओं thapsigargin के साथ इलाज कर रहे है खाली Ca2 + स्टोर और इस तरह पूरी तरह से सक्रिय SOCE । extracellular ca2 +के अभाव में, thapsigargin उपचार क्षणिक [ca2 +]मैं उंनयन, सीए 2+ आयनों intracellular ca से2 + स्टोर के एक रिलीज को परिलक्षित करती है । extracellular ca 2 के पुन: जोड़+ की वृद्धि की ओर जाता है [ca2 +]मैं SOCE का प्रतिनिधित्व करते हैं । इस लेख में, हम MCs में SOCE के लक्षण वर्णन के लिए इस दृष्टिकोण के सफल उपयोग प्रस्तुत करते हैं । मॉनिटर करने के लिए [Ca2 +]मैं बदलता है, फ्रा-2 एक कैल्शियम सूचक के रूप में इस्तेमाल किया गया था । इसके acetoxymethyl फॉर्म में फ्रा-2 को आसानी से PMCs में लोड किया जा सकता है । इस ratiometric डाई का उपयोग न केवल आयाम की तुलना की अनुमति देता है [ca2 +]मैं उंनयन, लेकिन यह भी बेसल में मतभेद [ca2 +]मैं स्तर है, जो जंगली प्रकार का विश्लेषण के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है/ कक्षों. आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट रंजक के साथ तुलना में, फ्रा-2 के मुख्य नुकसान में से एक अलग सेलुलर organelles में उच्च संचय और cytoplasmic प्रतिदीप्ति के इस तरह के संक्रमण है ।
फ्रा-2 इमेजिंग एक दोहरी उत्तेजना तकनीक की आवश्यकता है । आमतौर पर, यह तकनीकी रूप से बहुत से उपयोग करने के लिए आसान है दोहरी उत्सर्जन तकनीक है कि न केवल एक ट्रिगर प्रकाश स्रोत के उपयोग की आवश्यकता है लेकिन इसके अतिरिक्त एक फिल्टर पहिया या उत्सर्जन प्रकाश पथ में एक छवि अलगानेवाला की भागीदारी । वर्णित प्रोटोकॉल Ca के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है2 + अंय गैर उत्तेजित कोशिकाओं की इमेजिंग ।
MCs की एक प्रमुख विशेषता इलेक्ट्रॉन घने स्रावी granules, जो मध्यस्थों और इम्यूनोमॉड्यूलेटरी पदार्थों की बड़ी मात्रा के साथ भर रहे है की उनकी उच्च सामग्री है । एम सी सक्रियकरण की एक तेजी से रिलीज की ओर जाता है । इन विट्रो में MC दानेदार का विश्लेषण करने के लिए कई दृष्टिकोण उपलब्ध हैं, radiolabeled सेरोटोनिन का पता लगाने सहित, हिस्टामिन एंटीबॉडी का उपयोग कर पता लगाने (एलिसा), और प्लाज्मा झिल्ली की सतह की वृद्धि का पता लगाने का उपयोग electrophysiological "पैच-दबाना" सेल समाई माप । वर्तमान समाचार पत्र में, हम बहु का उपयोग परख के एक व्यावहारिक आवेदन का वर्णन-अच्छी तरह से वर्णमिति का पता लगाने में इन विट्रो जारी β-hexosaminidase. यह परख β-hexosaminidase hydrolyze टर्मिनल n-एसिटाइल-d-hexosamine अवशेषों n-एसिटाइल-β-d-hexosaminides21की क्षमता पर आधारित है । β-hexosaminidase हिस्टामिन के साथ, लेकिन यह भी Cathepsin डी या TNF के रूप में अन्य मध्यस्थों के साथ सह-जारी किया गया है और इस प्रकार स्रावी12,22में MCs बुलबुले के कई प्रकार से दानेदार बनाना के लिए सहसंबंधी के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
वर्णित तकनीक में, PMCs अलग secretagogues के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर उत्तेजित थे, supernatants के एक आकलन के साथ ही β-hexosaminidase सब्सट्रेट के साथ उनकी प्रतिक्रियाओं के द्वारा hexosaminidase सामग्री की छर्रों के बाद. सब्सट्रेट, 4-Nitrophenyl एन-एसिटाइल-β-डी-glucosaminide के रूप में इस्तेमाल किया गया था । यह एन-एसिटाइल-डी-glucosamine और पी-nitrophenol को hydrolyzed था । पी-nitrophenol की मात्रा ४०५ एनएम पर प्रकाश अवशोषक द्वारा colorimetrically quantified की गई थी । अ ß य-hexosaminidase जारी परख के कुछ संशोधनों में, 4-methylumbelliferil-N-एसिटाइल-बीटा-glucosamine को सब्सट्रेट के रूप में प्रयोग किया जाता है । एंजाइमी hydrolysis के बाद, पदार्थ एक fluorometrically पता लगाने वाला यौगिक उत्पन्न करता है । हम जारी करने का प्रतिशत, कुल सामग्री के लिए सामान्यीकृत के रूप में दानेदार बनाना की हद तक व्यक्त की है । यह हमारे विभिंन सेल की तैयारी के बीच अलग सेल नंबर और उनके दानेदार सामग्री द्वारा शुरू की परिवर्तनशीलता से बचने के लिए अनुमति दी । हम एक सहज रिलीज घटाना नहीं था (MCs secretagogues के अभाव में मनाया) नेट से उत्तेजित दानेदार बनाना, के बाद से एक सहज रिलीज अलग MC व्यवहार्यता का एक संकेतक के रूप में अपने महत्व के कारण की सूचना दी थी । परख परिणामों में उच्च परिवर्तनशीलता से बचने के लिए, यह बहुत ध्यान से उत्तेजित कोशिकाओं के केंद्रापसारक के बाद supernatants और छर्रों अलग महत्वपूर्ण है । यह भी वर्णमिति माप प्रदर्शन करने से पहले बहु अच्छी तरह से प्लेटों में किसी भी बुलबुले के गठन से बचने के लिए आवश्यक है । वर्णित विधि की एक महत्वपूर्ण सीमा है कि परिणाम एक निरपेक्ष मूल्य के रूप में नहीं प्रतिनिधित्व किया है, लेकिन जारी मध्यस्थ के प्रतिशत के रूप में ।
जारी सेरोटोनिन या हिस्टामिन के प्रत्यक्ष पता लगाने के तरीकों के विपरीत, रिपोर्ट परख बहुत अधिक लागत प्रभावी है और कोई विशेष उपकरणों की आवश्यकता है । इसके अलावा, वर्णित तकनीक अत्यधिक reproducible है, एक रेडियोधर्मी प्रयोगशाला में प्रदर्शन करने की जरूरत नहीं है, और महंगा एंटीबॉडी की खरीद की आवश्यकता नहीं है । इसलिए, यह अधिक महंगा है और मुश्किल तकनीकों के लिए एक उत्कृष्ट विकल्प हो सकता है ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक जूलिया Geminn को मास्ट सेल की तैयारी और संवर्धन में तकनीकी सहायता के लिए स्वीकार करना चाहेंगे । यह काम Transregional सहयोगी अनुसंधान केंद्र (TR-SFB) 152 द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI Medium | Thermo Scientific | 21875034 | |
| DPBS | Sigma-Aldrich | 14190144 | |
| FCS | Thermo Scientific | R92157 | |
| IL-3 | R&D Systems | 403-ML | |
| SCF | Thermo Scientific | PMC2115 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C2272 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fischer Scientific | F1221 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| DNP-HSA | Sigma-Aldrich | A6661 | |
| Anti-DNP-Antibody | Sigma-Aldrich | D-8406 | |
| Penstrep | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Compound 48/80 | Sigma-Aldrich | C2313 | |
| 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | X100 | |
| 4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside | Sigma-Aldrich | N9376 | |
| CoverWell Imaging Chamber | Sigma-Aldrich | GBL635051 | |
| 96-Well plate, v-shaped bottom | Corning | 3896 | |
| 96-Well plates, flat bottom | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Microtiter plate reader with "i-control" software | Tecan | Nano Quant, infinite M200 Pro | |
| Flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I9657 | |
| 50 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Culture Flasks (25 cm) | Greiner Bio-One | 69160 | |
| Cover slips glasses round; ø 25 mm; No. 1 | Menzel | CB00250RA1 | |
| Hemocytometer | VWR | 631-0696 | |
| Inverted Microscope | Zeiss | Observer Z1 | |
| Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil | Zeiss | 440260-9900 | |
| HC Filter Set Fura 2 | AHF | H76-521 | |
| CCD Camera | Zeiss | AxioCam MRm | |
| Monochromatic Light Source | Sutter Instruments | Lambda DG-4 | |
| Imaging Acquisition Program | Zeiss | AxioVision 4.8.2 | |
| Gravity fed solution application system | Custom Made | 4-channel | |
| 15 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Bench Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R |
References
- Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity. Nat Rev Immunol. 8 (6), 478-486 (2008).
- Feyerabend, T. B., et al. Cre-mediated cell ablation contests mast cell contribution in models of antibody- and T cell-mediated autoimmunity. Immunity. 35 (5), 832-844 (2011).
- Razin, E., Cordon-Cardo, C., Good, R. A. Growth of a pure population of mouse mast cells in vitro with conditioned medium derived from concanavalin A-stimulated splenocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (4), 2559-2561 (1981).
- Galli, S. J., Zsebo, K. M., Geissler, E. N. The kit ligand, stem cell factor. Adv Immunol. 55, 1-96 (1994).
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