Summary
여기, 우리는 격리 하 고 murine 복 막 돛대 세포 배양 프로토콜을 제시. 우리는 또한 그들의 기능 특성에 대 한 두 개의 프로토콜 설명: 출시 된 β-hexosaminidase의 색도계 정량화를 기반으로 하는 무료 세포내 캘리포니아2 + 농도와 degranulation 분석 결과 형광 영상.
Abstract
돛대 세포 (MCs), 면역 체계의 일환으로 여러 병원 균에 대 한 호스트를 방어 하 고 알레르기 면역 반응의 개시에 중요 한 역할을 재생 합니다. IgE 바인딩된 높은 선호도 IgE 수용 체 (FcεRI), 뿐만 아니라 다른 여러 가지 수용 체의 자극 표면의 cross-linking를 통해 MCs의 활성화 시작 무료 세포내 캘리포니아2 + 레벨의 상승 ([캘리포니아2 +]난) 그는 염증 및 알레르기 중재자의 출시를 촉진합니다. 분자 성분이 신호 경로에 관련 된 식별은 엠씨 기능의 규칙을 이해 하는 데 중요 합니다. 이 문서에서는, 우리는 murine 결합 조직 유형 복 막 게 하 여 MCs의 고립과 복 MCs (PMCs)의 재배에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법론에 의해 다양 한 녹아웃 마우스 모델에서 MCs의 문화 MC 신호 경로에 관련 된 단백질의 식별에 유용한 접근 방식을 나타냅니다. 또한, 우리 또한 단일 셀 Fura-2는 신뢰할 수 있는 Ca2 + MCs. 형광 기반 모니터링 [캘리포니아2 +]내가 신호의 정량화에 대 한 중요 한 기술으로 이미징에 대 한 프로토콜을 설명 하 고 일반적으로 사용 하는 접근 캘리포니아2 + 신호 이벤트, MC 활성화에 대 한 최대 중요성 이다 칼슘 저장소 운영 항목을 포함 하 여 공부 합니다. MC degranulation의 분석에 대 한 β-hexosaminidase 자료 분석 결과 설명합니다. 모든 3 개의 다른 분 비 하위 집합에 대해 MCs. β-hexosaminidase에서 설명한 degranulation 마커 colorigenic 기판에와 그것의 반응에 의해 쉽게 정해질 수 β-hexosaminidase 문화 매체에 발표의 양을 간주 됩니다 한 결정 플레이트 색도계 분석 이 높은 재현 기술은 비용 효율적인 고 특수 장비를 요구 한다. 전반적으로, 제공 된 프로토콜 높은 수확량을 보여줍니다 일반적인 MC 표면 마커를 표현 하는 MCs의 MCs의 일반적인 형태학 및 phenotypic 기능을 표시 하 고 캘리포니아2 +-secretagogues에 대 한 높은 재현성 응답 시연 이미징 및 degranulation 분석 실험입니다.
Introduction
MCs 타고 난과 획득 면역 반응 동안에 저명한 역할을 한다. 특히, MCs 병원 균, 기생충, 박테리아 등의 살해에 참여 하 고 또한 잠재적으로 유독한 내 인 성 펩 티 드 또는 구성 요소 (검토 Galli 외. 20081참조)에 대 한 venoms의 저하. 타고 난 및 적응형 면역에 MCs의 생리 적 역할 열띤된 논쟁의 주제 이다. 따라서, 다른 MC 불충분 한 마우스 모델을 사용 하 여 수행 하는 연구에서 수많은 데이터 불일치 알레르기2넘어 MCs의 면역 기능의 체계적인 재평가 필요 합니다. 성숙한 MCs 조직 및 피부, 폐, 창 자, 등 장기에 지역화 주로 고 있다 일반적으로 혈액에 작은 숫자에만. MCs MC 창시자, 등 조 혈 선구자에서 파생 하 고 그들의 차별화 및 거의 모든 vascularized 조직1는 microenvironments에서 성숙. 선택적으로 T-세포 파생 요소 인터 루 킨 (IL)-3에 그들의 조 혈 창시자3에서 생존, 확산, 그리고 마우스 MCs의 만능 인구의 승진 시킨다. 줄기 세포 요소 (SCF) 구조 세포 조직에 의해 생산 되 고 MC 개발, 생존, 마이그레이션, 및 기능4에서 중요 한 역할. 개별 MCs의 속성은 그들의 능력을 합성 하 고 다양 한 프로 테아 제 또는 proteoglycans 저장에 따라 달라질 수 있습니다. 마우스에 소위 결합 조직 형 MCs는 그들의 해부학 지역화, 형태학, 헤 파 린 및 프로 테아 제5의 내용에 따라 점 막 MCs에서 구별 된다.
MCs의 증가 무료 cytosolic 캘리포니아2 + ([캘리포니아2 +]난)은 필수 degranulation 및 eicosanoids의 생산을 위한 뿐만 아니라 cytokines의 합성과 항 원에 대 한 응답에서 녹음 방송 요인의 활성화 및 다양 한 secretagogues6. 이러한 자극의 주요 다운스트림 목표 hydrolyzes diacylglycerol (DAG) 및 이노 시 톨 1,4,5-trisphosphate phosphatidylinositol 4, 5 bisphosphate phospholipase C, 이다. DAG는 단백질 키 니 아 제 C를 활성화 하 고 IP3 바인딩과 그물에서 캘리포니아2 + 이온을 출시 하였습니다. 이러한 저장소의 고갈 캘리포니아2 + 원형질 막 캘리포니아2 + 채널, 저장 운영된 칼슘 항목 (SOCE)로 이어지는 통해 유입을 활성화 합니다. 이 과정은 캘리포니아2 +의 상호 작용을 통해 되 살려-센서, stromal 상호 작용 분자-1 (Stim1), Orai17 뿐만 아니라 일시적인 수용 체 잠재력 정식 (TRPC) 채널의 활성화를 통해 떠다니고 그물에 (자세한 리뷰 참조 Freichel 그 외 여러분 단백질 20148) 원형질 막에.
공부 하는 여러 약물이 채널의 생리 적인 역할 (채널 차단제의 응용 프로그램) 또는 유전 접근 일반적으로 사용 됩니다. 후자의 경우, 단백질 발현의 억제 mRNA (최저)를 대상으로 하 여 이루어집니다 또는 genomic DNA 코딩 기 공 채널 (녹아웃)의 소 단위를 형성 하는 exon의 전역 또는 조직 관련9 삭제 편집. 이 채널에 대 한 충분 한 특이성으로 차단기의 가용성은 제한 됩니다. 또한, 최저 접근 필요, 예를 사용 하 여 그 유효성의 주의 제어., 서쪽 오 점 분석, 그리고 많은 경우에 대상된 채널 단백질을 위한 특정 항 체의 불가능에 의해 방해 된다. 따라서, 녹아웃 마우스 모델의 사용은 여전히 이러한 분석에 대 한 황금 표준으로 간주 됩니다. 엠씨 기능 조사에 대 한 선호 체 외에 모델은 격리 된 비보 전 완전히 성숙한 인구로 서 수 있는 PMCs의 재배 (에서 예를 들어 생체 외에서 MCs 차별 반대., 골 수 세포)10 . 골 수 파생 된 MCs (BMMCs), 또한 일반적으로 엠씨 기능에서 생체 외에서FcεRI와 베타-hexosaminidase 자극을 공부 하는 데 사용 되는 비교 릴리스는 8-fold 고 약에 증가 PMCs, 각각. 이 문서에서는, 우리 격리 하는 방법 및 재배 murine PMCs의 2 주 높은 수가 순수 결합 조직 배양의 MCs, 추가 분석에 대 한 충분 한 입력을 얻을 수 있는 설명 합니다.
개발 및 인코딩된 유전자 칼슘 표시기의 응용 프로그램에서 최근 진행에도 불구 하 고 그들의 사용은 여전히 제한 대상 세포에 유전자의 납품에 어려움에 의해 특히, 기본 교양된 MCs 같은 고도로 전문화 된 세포에서. 또한, 형광 지표 측정을 위해 [캘리포니아2 +]나 의이 그룹은 아직 높은 동적 범위와 비율 염료가 없다. 이러한 이유로, 비율 [캘리포니아2 +]나 측정에 대 한 선호 하는 방법 아직도 형광 염료 "Fura-2"11의 사용 이다.
현재, 가장 일반적으로 사용 되는 접근 MC 활성화의 평가 degranulation β-hexosaminidase 활동의 측정 이다. Β-hexosaminidase, 알레르기 중재자, MCs12에서 일정 비율에 히 스타 민을 공동 출시는 MC과 립 구성 요소 중 하나입니다. Β-hexosaminidase 쉽게 그리고 정확 하 게 측정할 수 microplate 색도계 분석 실험에서 쉽게 감지 colorigenic 제품의 측정 수량을 생산 하는 특정 기질과의 반응을 통해. 이 문서에서는, PMCs degranulation 다양 한 자극에 대 한 응답에서의 분석에 대 한이 기술의 응용 프로그램이 보고 됩니다.
높은 선호도 plasmalemmal IgE 수용 체 (FcɛRI)의 집계 MCs에 주변 세포 외 공간에 분 비과 립 콘텐츠 출시로 이어지는 다양 한 세포내 신호 전달 경로 활성화 합니다. 특정 항 원 뿐만 아니라 다른 많은 자극 immunomodulatory 중재자, 보완 anaphylatoxins 등의 다양 한 배열을 풀어 MCs를 활성화할 수 있습니다 (예., C3a와 C5a)13, vasoconstrictor 펩 티 드 endothelin 1 (ET1)14 , 잘 수많은 양이온 물질 및 pseudoallergic 반응을 자극 하는 약물 (예., icatibant) MRGPRX216에 바인딩하여15 . MRGPR 유도 MCs degranulation에 관련 된 세포내 신호 통로 저조한 FcɛRI 중재 세포내 신호; 비교 특징 이러한 경로 단지 수용 체 식별16후17 지난 몇 년 동안 집중적으로 공부를 시작 했다. 크게, 원형질 막 이온 채널 칼슘 항목 뒤에 MRGPRX2 자극에에서 관련 된 이해 남아 있다. 따라서, 현재 문서는 또한 세포내 칼슘 신호에 초점을 맞추고 및 MCs의 degranulation MRGPR 촉진제와 자극.
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Protocol
모든 동물 절차 관리 및 실험실 동물 (카를스루에 지역 위원회에 의해 승인)의 사용에 대 한 독일 입법 지침에 따라 수행 했다.
1. PMC 고립과 재배 복 게에 의해
| 1 | 얼음 |
| 2 | 10 mL 주사기 |
| 3 | 27 G 바늘 |
| 4 | 20 G 바늘 |
| 5 | 스티로폼 블록 및 핀 |
| 6 | 컬렉션 튜브 (50ml 플라스틱 원심 관) |
| 7 | 70% 에탄올 |
| 8 | RPMI 매체 (냉장 하 고 얼음에 보관 중) |
| 9 | PMC 매체: RPMI 매체 + 20 %FCS (송아지 태아 혈 청) + 1% 페니실린 스 솔루션 (펜-연쇄 상) |
| 10 | Dulbecco의 인산 염-(캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +) 없이 DPBS 버퍼링 |
| 11 | 문화 플라스 크 (25 cm) |
| 12 | 성장 인자 재고 솔루션 (IL-3: 1 μ g/μ; SCF: 2.5 μ g/mL) |
| 13 | 혈 청 학적인 펫 (10 mL) |
| 14 | 펫 팁 불 임 (20-200 µ L) |
| 15 | Hemocytometer |
| 16 | 벤치 원심 분리기 |
| 17 | 가 위와 집게 |
| 18 | 마우스에 대 한 CO2 챔버 |
| 19 | 살 균 오픈 후드 |
| 20 | 닫힌된 살 균 후드 |
| 21 | 셀 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2) |
| 22 | 펫 (20-200 µ L) 전송 |
표 1: 1 단계에 대 한 자료입니다.
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PMC 격리 복 게
- 셀 격리 전에 표 1에 나열 된 재료를 준비 합니다.
- 8 14 주 된 남성 마우스를 사용 하 여 PMC 격리에 대 한. CO2 흡입에 의해 마우스를 안락사 고 반사의 손실에 의해 죽음을 확인 합니다. 70% 에탄올으로 마우스를 살포 하 고 핀 (지 느 러 미 쪽 아래)를 사용 하 여 거품 블록에 그것을 해결. 무딘 가장자리가 위를 사용 하 여 마우스의 복 부 피부를 제거 합니다. 복 막 구멍을 손상 하지 마십시오.
참고: 우리가 일반적으로이 프로토콜을 사용 마우스 C57BL/6N 스트레인 유전 배경으로 합니다. - 7 mL 차가운 RPMI 매체의 및 27 G 니 들을 갖춘 10 mL 주사기를 사용 하 여 복 막 구멍에 있는 공기의 5 ml를 주사. 복 막에 신중 하 게 바늘을 밀어 하 고 어떤 장기를 꿰뚫기 하지 마십시오. Epididymal 지방 지역에 자리를 사용 하 여 기관 구멍 뚫 기의 위험을 줄이기 위해.
- 주입 후 RPMI 매체에 복 막 세포 분리를 1 분 동안 마우스를 흔들어. 할 동요 마우스 너무 강력 하 게, 내부 장기 손상 및 혈액과 복 막 구멍을 오염 방지 하기 위해.
- 새로운 20 G 정 장착 하 여 10 mL 주사기를 다시 사용 합니다. 거품 블록을 기울이기 고 부드럽게 중간 포부를 보다 쉽게 다른 측면에서 벤치에 활용 하 여 1 개의 측에 내부 장기를 이동 합니다. 20 G 바늘을 삽입, 베벨 및 액체는 복 부를 부드럽게 그리고 천천히 발음 (~0.5 mL/s)를 내부 기관에 의해 막힘을 방지. (일반적으로 5-6 mL) 가능한 많은 액체를 수집 합니다.
- 주사기에서 바늘을 제거 하 고 얼음에 컬렉션 튜브에 수집 된 세포 현 탁 액을 전송. 보이는 혈액 오염 경우 샘플 튜브를 삭제 합니다.
- 5 분 ~ 300 x g 에서 셀 서 스 펜 션 튜브 원심 살 균 후드 아래는 상쾌한 발음. 각 마우스에 대 한 감기 (4-10 ° C)의 4 ml 샘플 펠 릿 결합 PMC 매체와 전송 25 cm2 문화 플라스 크에 세포 현 탁 액. 추가 최종 농도 10 ng/mL에 성장 요인 IL-3 및 SCF 30 ng/mL, 각각. 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2)에 있는 셀을 포함 하는 플라스 크를 배치 하 고 절차까지 ~ 48 h에 대 한 품 어.
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PMC 문화
- 주 2 (격리 후 ~ 48 h): 중간 변경
- 제거 하려면 표면에 뜨는 및 비 점착 세포 (적혈구 및 죽은 세포), 플라스 크의 가장자리에 파스퇴르 피 펫 팁을 배치 하 고 플라스 크를 거의 수평으로 들고 여 플라스 크에서 매체를 발음. 마우스 당 미리 따뜻하게 PMC 매체의 4 mL를 추가 합니다. 추가 성장 요인 IL-3 (10 ng/mL) 및 SCF (30 ng/mL). 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2)에 있는 셀을 포함 하는 플라스 크를 놓습니다.
- 주 9: 셀 분
- 50 mL 플라스틱 원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액 셀 문화 플라스 크에서 전송. 세 번 10 mL 사전 예 열 (37 ° C) Dulbecco의 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS)와 플라스 크를 씻고, 동일한 50 mL에서 분리 된 세포와 세포 현 탁 액을 수집 플라스틱 원심 관. hemocytometer에 의해 셀 농도 계산 하 고 셀의 총 수를 계산.
- ~ 300 x g 5 분 동안에 세포 현 탁 액을 원심 고는 상쾌한 발음. 셀 농도 1 x 106 셀/mL를 미리 데워 PMC 매체 (37 ° C)에 펠 릿을 복구 합니다. 새로운 25 cm2 문화 플라스 크에 세포 현 탁 액을 전송 합니다. 바닥에 고착 하는 섬유 아 세포와 오래 된 플라스 크를 삭제 합니다.
- 추가 성장 요인 IL-3 (10 ng/mL) 및 SCF (30 ng/mL), 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2)에 있는 셀을 포함 하는 플라스 크를 놓습니다.
- 12-15 일: 측정 셀
- FcɛRI 수용 체의 자극으로 어떤 실험을 계획 하는 경우 표준 문화 매체에 ige의 안티-DNP의 300 ng/mL와 하룻밤 셀을 pretreat. 2 단계와 3 단계를 진행 합니다.
- 주 2 (격리 후 ~ 48 h): 중간 변경
2. fluorometric 세포내 무료 칼슘 농도 측정 PMCs에
- 측정을 하기 전에 표 2에 나열 된 재료를 준비 합니다. 또한,의 구성 하는 이미징 설치 준비: 거꾸로 형광 현미경; 목표: 40 X / 1.3 기름; Fura 2 필터 설정; CCD 카메라; 여기 광원; 영상 수집 프로그램; 중력 공급 솔루션 응용 프로그램 시스템.
| 1 | PMC (12-15 일) 1 x 106 셀/mL |
| 2 | Concanavalin A |
| 3 | Fura-2 오전 |
| 4 | Pluronic F-127 20% 솔루션 |
| 5 | 커버 슬립 안경 라운드; ø 25 m m; 제 1 |
| 6 | DNP HSA (dinitrophenol-인간 혈 청 알 부 민) 재고 솔루션 |
| 7 | 안티-DNP-항 체 (IgE) 재고 솔루션 |
| 8 | 플랫 바닥 플레이트 (12 정) |
| 9 | 복합 48/80 재고 솔루션 |
| 10 | 잘 이미징 챔버 커버 |
| 11 | Hemocytometer |
| 12 | 펫 (20-200 µ L) 전송 |
표 2: 2 단계에 대 한 자료입니다.
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Fura-2 이미지 준비
- 세포 수는 hemocytometer를 사용 하 여 수행 하 고 셀 농도 1 x 106 셀/mL를 조정. (3-5 회)는 세포 현 탁 액 1 mL 피 펫 팁을 부드럽게 pipetting으로 PMCs 식민지를 분할.
- 준비는 캘리포니아2 +-소금 솔루션 버퍼링 HEPES 포함 (캘리포니아2 +-HBSS) 135 mM NaCl, 6 m m KCl, 2mm CaCl2, 1.2 m m MgCl2, 10 mM HEPES, 및 12 mM 포도 당으로 구성. 3 M NaOH와 7.4에 pH를 조정 합니다.
- 준비 concanavalin A 각 25 m m에 pipetting concanavalin A 솔루션 (0.1 mg/mL에서 H2O) 1 방울에 의해 코팅된 슬라이드 라운드 살 균 후드 커버 유리. 적어도 1 분 동안 커버 슬립에 방울을 두고 그 피 펫 및 하자 커버 미끄러져 건조 45 분 신중 하 게 고무 챔버 이미징에 concanavalin A 처리 커버 전표를 눌러에 대 한 솔루션의 대부분을 제거 ( 재료의 표참조)까지 그들은 현미경 이미징 챔버를 연결 합니다.
참고: 폴 리-L-리 신 코팅 슬라이드 대신 사용할 수 있습니다. - 형광 Ca2 + 염료 Fura-2 녹 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에서 오전 (1 mM). 빛에서 보호 하는이 솔루션을 저장 합니다.
- Fura 2 희석 캘리포니아2 +에서 오전 재고 솔루션-HBSS "로딩 버퍼"를 준비 하기 위해 5 µ M의 최종 농도에. DMSO에 20% pluronic F-127의 5 µ L/mL와 함께 보충.
- PMC 세포 현 탁 액의 500 µ L로 "로딩 버퍼" 믹스 500 µ L. 이미징 챔버로 혼합물을 플라스틱 하 고 어둠 속에서 실 온에서 20-30 분에 대 한 셀을 품 어.
- 응용 프로그램 시스템 자극 프로토콜에 따라 서로 다른 솔루션을 공급 하는 중력을 설정 합니다. 주사기 1 캘리포니아2 +-HBSS 솔루션의 40 mL와 함께 보충, 2 캘리포니아2 +-HBSS 포함 된 솔루션 100 ng/mL DNP의 40 mL 주사기, 주사기 캘리포니아2 +-HBSS 솔루션에 포함 된 50 µ g/mL 복합 48/80의 40 mL로 3, 4의 40 mL 주사기 명목상 캘리포니아2 +-무료-HBSS 솔루션, 5에 명목상으로 캘리포니아의2 +40 mL 주사기 및-무료-HBSS 솔루션 2 µ M 포함 된 Thapsigargin.
- 그것에 침수 기름의 작은 방울을 배치 하 여 40 X 높은 조리개 기름 침수 목표를 준비 합니다.
- 거꾸로 한 현미경의 스테이지에서 응용 프로그램 시스템을 탑재 합니다. 응용 프로그램 시스템에 로드 된 세포 이미징 챔버를 넣고 녹음 하는 동안 움직임을 방지 하기 위해 보안. 전송 된 라이트 켜고 셀 초점.
- 캘리포니아2 +-HBSS 버퍼 중력 먹인 응용 프로그램 시스템을 사용 하 여 세 번 셀 린스 합니다.
- 캘리포니아2 +세포를 품 어-HBSS Fura-2에 대 일 분 대 한 오전 드 에스테 르 화.
- 린스는 세포는 이미징 시작 하기 전에 한 번 더, 잠재적으로 제거를 유출 형광 성 염료.
-
세포 이미징
- 생리 적 획득 모드에서 이미지 수집 프로그램을 시작 합니다. 설치 창을 열고 포커스와 최적의 수집 시간 조절 (340와 여기에 대 한 동일 해야하는 nm 및 380 nm 및 일반적으로 50-150 ms 사이의 범위).
참고: Fura-2의 노출을 최소화 모든 빛을 염료의 photobleaching을 피하기 위해 로드 셀. - 참고 그림을 이미지 하 고 관심 (ROI)의 영역으로 셀을 표시 합니다. 셀에 존재 하 고 배경으로 정의 지역에서 마지막 투자 수익을 표시 합니다.
- 설치를 완료 하 고 5 s 수집 속도 측정을 시작 합니다.
참고: 셀 것 이다 될 또는 조명 340의 여기 빛 nm 및 380 nm, 그리고 방출된 형광 (> 510 nm) CCD 카메라를 사용 하 여 수집 됩니다. 이미지 비율 (F340 nm/F380 nm) 뿐만 아니라 형광 신호 F340 nm와 F380 nm의 3 개의 창에 표시 됩니다. 개별 ROIs 형광 강도의 시간 과정의 차트 의미 값 또한 지속적으로 표시 됩니다. - 실험의 디자인에 따라 적절 한 주기 수에 솔루션을 추가:
- [캘리포니아2 +]나, 항 원 유도 측정 상승 하려면 그림 2, 2B에서 볼 수 있듯이 20, 주기와 주기 150 후 기록 중지 후 주사기 2 솔루션을 적용 합니다.
- [캘리포니아2 +] 48/80 복합 유도 고도 측정, i,C, 그림 2그림으로 20, 주기와 주기 150 후 기록 중지 후 주사기 3 솔루션을 적용 합니다.
- D 그림 2볼 수 있듯이 [캘리포니아2 +]내가 SOCE에 의해 evoked의 고도 측정, 주기 10 후 주사기 4 솔루션을 적용, 사이클 70 후 주사기 5 솔루션을 적용, 주기 120, 후 주사기 4 솔루션을 적용 사이클 150, 후 주사기 1 솔루션을 적용 하 고 사이클 220 후 녹음을 중지.
- 마친 후 측정, 변환 결과 배경 보정 없이 여기 파장 뿐만 아니라 비율 값와 모든 투자 수익에 대 한 배경 보정 없이 측정된 농도 포함 하는 비율 테이블 그리고 모든 측정 시간 점입니다. 수집 프로그램에서 연속적으로 버튼을 눌러: "시작 커터", "모두 표시", "모든 변환", "생리학 측정", "좋아,"확인". 테이블 및 오프 라인 분석을 위해 이미지 스택 파일을 저장.
- 생리 적 획득 모드에서 이미지 수집 프로그램을 시작 합니다. 설치 창을 열고 포커스와 최적의 수집 시간 조절 (340와 여기에 대 한 동일 해야하는 nm 및 380 nm 및 일반적으로 50-150 ms 사이의 범위).
3. 베타-hexosaminidase 릴리스 측정 PMCs에
| 1 | PMC (12-15 일) 1 x 106 셀/mL |
| 2 | 안티-DNP-항 체 (IgE) 재고 솔루션 |
| 3 | DNP HSA 재고 솔루션 |
| 4 | 복합 48/80 재고 솔루션 |
| 5 | Ionomycin |
| 6 | 96 잘 접시, v 자형 하단 |
| 7 | 96 잘 접시, 플랫 바닥 |
| 8 | 플라스틱 원심 관 (15 mL) |
| 9 | 혈 청 학적인 펫 |
| 10 | 셀 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2) |
| 11 | 벤치 원심 분리기 |
| 12 | 광학 밀도 측정을 위한 결정 플레이트 리더 |
| 13 | 멀티 채널 피 펫 (20-200 μ) |
| 14 | Hemocytometer |
표 3: 3 단계에 대 한 자료입니다.
- 측정, 이전 표 3에 나열 된 재료를 준비 합니다.
참고: β-hexosaminidase 그들의 자극 후 MCs에서 출시 된 p-nitrophenol 및 N-아 세 틸-D-글루코사민으로 p-nitrophenyl-아 세 틸-D-글루코사민 (pNAG) hydrolyzes. 샘플에서 β-hexosaminidase 양은 형성 될 것 이다 p-nitrophenol의 크기에 비례 이다. "중지 솔루션"의 높은 pH 환경에서 p-nitrophenol 완전히 deprotonated p-nitrophenolat으로 존재 하 고 405에서의 빛 흡수도 의해 검출 될 수 있다 nm. - 130 mM NaCl, KCl 5mm, 1.4 m m CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 5.6 m m 포도 당, 및 BSA 0.1%를 포함 하는 Tyrode의 솔루션을 준비 합니다. 3 M NaOH와 7.4에 pH를 조정 합니다.
- 1% 트라이 톤 X-100 양의 Tyrode의 솔루션에 추가 하 여 세포의 용 해 솔루션을 준비 합니다.
- 200mm 글리신의 구성 중지 솔루션을 준비 하 고 NaOH와 10.7에 pH를 조정.
- 4 m m의 최종 농도를 0.4 M 구 연산 산 성 pNAG를 용 해 하 여 pNAG 솔루션 (4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside) 솔루션을 준비 합니다.
- 분석 결과에 필요한 세포의 양을 계산 (중복에서 분석 결과 수행). 잘 당 200000 PMCs를 사용 합니다. 2 웰 스를 사용 하 여 부정적인 컨트롤 (Tyrode의 솔루션 없이 DNP 같은 어떤 secretagogues 또는 복합 48/80)와 긍정적인 컨트롤로 2 우물 (10 µ M와 Tyrode의 솔루션 Ionomycin) 모든 유전자에 대 한.
- 15 mL 플라스틱 원심 분리기 튜브에 세포를 전송, Tyrode의 솔루션, 15 mL를 볼륨을 조정 하 고 4 분 파스퇴르 피 펫과 상쾌한을 제거 하 고 resuspend Tyrode의 솔루션 2 x 106 셀에 셀에 대 한 200 x g 에서 원심 /mL입니다.
- 96-잘 V-아래 잘 접시에 잘 당 세포 현 탁 액의 100 µ L를 전송. ( 그림 3Apipetting 계획)에 따라 각 잘을 자극 또는 제어 솔루션의 25 µ L를 추가 합니다. 37 ° C, 5% CO2시 45 분에 대 한 셀을 품 어.
- 5 분 동안 얼음에 96 잘 접시를 두어서 반응을 중지 합니다. 그런 다음 판 120 x g에서 4 분 4 ° C에서 원심. 평면-바닥 96 잘 접시에 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 상쾌한의 120 µ L를 전송 하 고 얼음에 두십시오. 신중 하 게 셀 펠 릿을 만지지 마십시오 하지만 완전히는 상쾌한 발음.
- 셀 펠 릿에 세포의 용 해 버퍼의 125 µ L를 추가 합니다. 실 온에서 5 분 동안 셀 펠 릿을 품 어와 반복 pipetting (약 5 시간)으로 부 화 후 그들을 resuspend.
- 새로운 평면 아래 96 잘 접시의 필요한 우물에 pNAG 솔루션 (4mm)의 25 µ L 플라스틱 준비 된 pNAG 솔루션으로 각 세포 lysate의 25 µ L를 각 상쾌한에서 25 µ L를 추가 합니다.
- 37 ° c.에서 1 h 반응 일괄 처리 품 어 부 화, 후 각 잘 반응을 중지 중지 솔루션의 150 µ L 플라스틱.
- 405에 듀얼-파장 설정을 사용 하 여 microplate 리더와 함께 접시를 분석 자동 배경 빼기에 대 한 참조 630 nm nm. 수집 프로그램에서 똑 딱 상자 "참조" 및 "흡 광도" 프로그램 요소 메뉴에서 선택 "630 nm" 드롭 다운 목록에서. 샘플의 광학 밀도 너무 높은 경우에, 측정 전에 프로브 적절 한 희석을 준비 합니다.
- 다음 방정식에 따르면 β-hexosaminidase 방출의 비율을 계산:
[상쾌한] 배경 이다 출시 [%]는 특정 베타-hexosaminidase 릴리스의 %, 상쾌한의 흡수를 수정 하 고 [lysate] 배경 수정 해당 세포 lysate의 흡수.
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Representative Results
PMCs 복 게 여 3 야생 타입 마우스 (C57BL/6N) 으로부터 격리 되었고 추가 보충 RPMI 매체에 교양 20 %FCS 1% 펜-Strep 메 마른에서 성장 인자 (IL-3 10 ng/mL) 및 30 ng/mL에서 SCF의 습도 조건에서 37 ° C, 5% CO2. 매체는 셀 격리 후 2, 9 일에 변경 되었습니다. 셀 형태 전송 사용 하 여 분석 DIC 이미징 빛 ( 그림 1A, B참조). 셀 대비 및 세분성 좋은 세포 생존 능력을 설명 했다. 2 주 후이 조건 하에서 배양, 균질 인구 107 셀 x 1.5의 얻은 것입니다. 공동 FITC와 함께 활용 하는 안티-IgE 항 체와 스테인드 전지와 PE와 함께 활용 하는 안티-c-키트 항 체의 흐름 cytometry 분석 FITC 양수와 99.8 %PE 긍정적인 세포 (그림 1C)의 98.6% 밝혔다. 98.5 배양된 세포의 % 더블 긍정적 FITC와 PE그림 1(C), 성숙한 MCs의 일반적인 기능을 시연 했다.
얻은 셀의 추가 기능 분석에 대 한 fluorometric [캘리포니아2 +]나 측정 Fura 2 형광 표시기를 사용 하 여 수행 했다. Fura 2 로드 셀 또는 340와 조명 했다 nm 및 380 nm 여기 모든 5 s와 형광 빛 > 510 nm CCD 카메라를 사용 하 여 등록 되었다. 형광 (F340/F380)의 비율을 지속적으로 모니터링 했다. DNP의 응용 프로그램 (100 ng/mL) 300 ng/mL IgE의와 하룻밤 incubated PMC를 안티-DNP 갖는 [캘리포니아2 +]나 수준, 천천히 부패 절반 최대에 (그림 2A, B) 몇 분 동안 뚜렷한 상승. 세포 응답의 다양성은 상대적으로 낮은 (그림 2A, B). 같은 시간 프로토콜 50 µ g/mL의 복합 48 80와 MRGPRB2 수용 체의 자극은 크게 [캘리포니아2 +]i Fura 2 로드 PMCs 응답 (그림 2C)의 매우 비슷한 평균 진폭에 증가. PMCs에 SOCE의 분석, "다시 추가" 프로토콜 적용 했다: 10, 측정의 시작 후 외부 Ca2 + 제거 되었습니다 주기와 동안 70-120, Thapsigargin 주기 (2 µ M), 바인딩과 그물 ATPase의 억제제는 세포내 캘리포니아2 + 점포의 고갈에 대 한 SOCE의 최대한 활성화에 대 한 적용합니다. 변이 [캘리포니아2 +]나 상승 반영에서 세포내 캘리포니아2 + 저장소에 있는 Ca2 + 릴리스는 명목상으로 캘리포니아2 +-무료 목욕 솔루션 (그림 2D). [캘리포니아2 +]i 수준의 Ca2 + SOCE로 (그림 2D)를 통해 서 유입으로 인해 눈에 띄는 증가 귀착되 었 다 주기 150 후 2 m m 외부 캘리포니아2 + 농도 복원 합니다. 캘리포니아2 + 응답의이 구성 요소는 강하게 10 µ M GSK 7975A, 존재 저해 반면 Ca2 + 세포내 캘리포니아2 + 매장에서 출시 남아 변경 되지 않습니다 (그림 2D CRAC 차단기로 알려진 ).
다음 단계에서 우리는 FcɛRI 높은 친 화력 수용 체의 가교 또는 MRGPRB2 수용 체의 자극에 따라 degranulation을 격리 PMCs의 능력 테스트. 이 위해 ß-hexosaminidase 자료 분석 결과 수행 되었다. 셀 브 하단 96 잘 접시 (2 x 105 셀/잘)에 추가 하 고 그림 3A 37 ° c.에서 45 분에 대 한 계획에 따라 자극 했다 접시는 centrifuged 하 고는 상쾌한의 제거 후, 펠 릿 lysed 했다. 37 ° c.에 1 h 인큐베이션 기간 동안 pNAG와 그들의 반응에 의해 개별 supernatants 및 펠 릿 lysates의 ß-hexosaminidase 콘텐츠를 분석 반응 제품의 금액 colorimetrically 감지 하 고 출시 ß-hexosaminidase의 비율 ( 그림 3B참조) 계산 했다. 자발적인 버전은 매우 낮은 (1%), 반면 응답 10 µ M 같은 강한 degranulation 자극에 Ionomycin와 복합 48/80 50 µ g/mL에서 했다 40%와 60%, 각각. DNP 자극 degranulation 응답 했다 복용량-의존 10-300 ng/mL의 농도 범위. 함께, 이러한 데이터는 명확 하 게 분리 PMCs의 좋은 기능 상태를 나타냅니다.
그림 1 : 기본의 교양 murine 야생 타입 PMCs DIC 현미경 및 흐름 cytometry 분석을 사용 하 여 수행. (A, B) 대표 이미지 복 게 (A)와 자란 (B)의 9 날에 셀 격리 후 25 cm2 플라스틱 플라스 크 1 h에서에서 교양 PMCs의 20 X plasDIC 목표를 사용 하 여 얻은. 오른쪽 아래 모서리 표시 100 µ m (C) 흐름 cytometry 분석 PMCs (위의 설명된 프로토콜에 따라 교양된 12 일)의 공동 Fluorescein Isothiocyanate (FITC)와 안티-c-키트 활용 된 안티-IgE 항 체와 스테인드 규모 막대 항 체 활용 Phycoerythrin (PE)와 함께. 셀 밀도 플롯 4 개의 사분면으로 분할 됩니다: q 1, autofluorescence 수준/FITC autofluorescence 수준; 아래 위에 PE Q2, 해발 autofluorescence; autofluorescence 수준/FITC 위에 PE Q3, PE autofluorescence 수준/FITC autofluorescence 수준; 아래 아래 Q4, PE autofluorescence 수준/FITC autofluorescence 위 아래 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 의 기록 [Ca2 +] 난 Fura 2 로드 PMCs 강포한 유형 쥐에서 분리. [Ca 2 + ]나 형광 F340/F380 비율으로. [캘리포니아2 +]내가 시간 과정의 개별 PMCs의 (A) 대표적인 흔적 (n = 38) DNP와 자극 (100 ng/mL). (B) DNP의 시간 과정 (100 ng/mL)-[캘리포니아2 +]난 고도 불러 일으켰다. 모든 데이터 요소 패널 A.에 38 개별 셀에서 얻은 평균값을 나타냅니다. PMCs는 했다 청소용 하룻밤 IgE 안티-DNP의 300 ng/mL와 함께. (C) 복합 48/80 유도의 평균값의 시간 과정 [캘리포니아2 +]나 상승 PMCs에 (n = 60). (D) [캘리포니아2 +]나 변경 동안 세포내 캘리포니아2 +의 평균값의 시간 과정-2 µ M의 응용 프로그램에 의해 유도 된 고갈 저장에 명목상으로 캘리포니아2 +Thapsigargin (Tg)-무료 뒤에 저장소 솔루션 2 m m Ca2 + 제어 그룹에서 목욕 솔루션에 다시 추가 후 칼슘 유입 운영 (n = 44) PMCs (검은 사각형)와 목욕 솔루션 (파란색 사각형)에서 GSK 7975A의 10 µ M의 존재 (n = 41). B, C 및 D, 오차 막대 표시의 평균 표준 오차. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 베타-hexosaminidase 릴리스 PMCs 강포한 유형 쥐에서 격리를 수행 하는 색도계 멀티 잘 측정. (A) 베타-hexosaminidase 분석 결과; 수행 pipetting 96 잘 접시의 자극 계획 결과 B. "Spontan"의 어떤 secretagogues;의 추가 없이 Tyrode의 솔루션 pipetting에 해당 하는 패널에 표시 됩니다. 임 = Ionomycin; Cp 48/80 = 복합 48/80. (B) 막대 표시 농도와 Ionomycin (IM), dinitrophenol-인간 혈 청 알 부 민 (DNP)와 복합 48/80 (Cp 48/80) 자극 후 기저 조건 (Spont)에서 ß-hexosaminidase 릴리스의 보여주는 비율 그래프. 분석 결과 중복;에서 수행 되었다 오차 막대는 뜻의 표준 오류 표시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
MC 모델 MC degranulation, chemotaxis, 접착, 또한 세포내 신호 변환 통로 MC 활성화에 명료로 공부를 성공적으로 사용할 수 있습니다. 일부 연구 자들은 불멸 하 게 선 (LAD2 HMC1) 등 인간의 MCs 사용 인간의 MCs 모델, 코드에서 파생 된 조상 세포 (CD133 +)와 주변 혈액 조상 세포 (CD34 +) 혈액. 다른 선호 하는 설치류와 같은 불후의 명작 MC 모델 (쥐 basophilic 백혈병 RBL-2 H 3 MC 선) 또는 기본 교양 (마우스 뼈 골 수 유래 MCs BMMCs, PMCs) 모델. 수많은 "녹아웃" 마우스 모델, 특정 유전자와 인코딩된 단백질의 생리 기능 탐험에 골드 표준 접근에에서 엠씨 기능 분석 murine 기본 MCs는 사용할 수 있습니다. 충분 한 선택도 및 힘을 위한 약리 도구의 적자 MC 활성화18여 신호 변환의 메커니즘의 조사를 위해 특히 귀중 한이 방법을 만듭니다. 성숙한 형태 및 높은 세분성을 전시 하는 결합 조직 형의 murine PMCs는. 그들은 응답 하지 않습니다만 잘 BMMCs, 같은 FcεRI의 항 원 가교 하지만 또한 endothelin 1 등 몇 가지 추가 수용 체 또는 복합 48의 촉진제에 의해 활성화 됩니다. 그러나,는 PMCs의 수익률 일반적으로 BMMCs의 그것에 비해 상당히 낮은 이며 일반적으로 서쪽 오 점 또는 세포의 많은 수를 요구 하는 다른 기술을 수행 하기 위해 충분 한 아니다. 몇 가지 기술은 분리와 PMCs의 정화에 대 한 설명 했습니다. 예를 들어 Percoll 그라데이션 원심 셀19;의 높은 순도를 보고 되었다 그러나,이 기술을 취득 하는 셀의 수는 상대적으로 낮은 일반적으로. 여기에 설명 된 프로토콜, 가장 중요 한 단계에서는 복 막 구멍에서 세포 현 탁 액의 포부입니다. 혈액 샘플의 오염을 방지 하 고 최대한 양의 중간 가능한 발음 PMCs의 고 순도의 높은 숫자를 얻기 위해 필수적입니다. 일부 마우스 변종과 함께 최대한 PMC 수만 가져온 단축된 (11-12 일)에 의해 자란 기간. 세포 수의 감소에만 긴 시간 리드에 대 한 문화 조건에 이러한 셀을 떠나.
현재에서 연구, 우리가 설명 하는 간단한 프로토콜 마우스 복 막 구멍에서 매우 순수한 MC 인구를 가능 하 게 성숙한 MCs의 분리에 적합. 얻은 셀과 높은 동질성 특징은 전형적인 엠씨 기능, 특정 마커 수용 체 (키트 및 FcεRI)의 표현 등을 전시. 이 세포는 명확 하 게 degranulate 하 그들의 [캘리포니아2 +]내가 FcɛRI 및 MRGPR 정품 인증에 대 한 응답에서을 증가 MC 특성 전시.
엠씨 [캘리포니아2 +]i 수준 Ca2 + 세포내 상점 및 캘리포니아2 + 원형질 막 채널을 통해 항목에서 자료에 의해 결정에 밀접 하 게 관련 된 신호. [캘리포니아2 +] 나 고도 그 방 아 쇠 MC degranulation 세포내 신호 통로의 복잡 한를 활성화합니다. 고르기가 아닌 다른 셀에서 주요 캘리포니아2 + 유입 통로 MCs에는 캘리포니아2 +의 고갈에 의해 활성화 하는 SOCE-저장. 이 신호 통로에 관련 된 채널의 식별은 엠씨 기능의 규칙을 이해 하는 데 중요 합니다. SOCE 통로의 분자 성분의 식별을 위해 형광 캘리포니아2 + 지표 및 "패치 클램프" electrophysiological 접근 microfluorometric 기술 저명한 역할을 했다 있다. 그러나, [캘리포니아2 +]나 레벨 상승 캘리포니아2 + 릴리스 및 SOCE의 합계입니다. 이러한 두 단계의 Ca2 + 동원 차별, (검토 참조 새 외. 200820)에 대 한 소위 "캘리포니아2 + 다시 추가" 프로토콜 이전 개발 되었습니다. 이 프로토콜에서 외부 소금 솔루션 정상 [캘리포니아2 +]오 (1-2 m m)를 포함 한 전환 되는 명목상으로 캘리포니아2 +-무료 솔루션. 이러한 조건에서 셀 빈 캘리포니아2 + 매장 활성화 하 고 따라서 완전히 SOCE thapsigargin와 함께 처리 됩니다. Extracellular 캘리포니아2 +의 부재, thapsigargin 치료 끝 과도 [캘리포니아2 +]나 고도, 캘리포니아2 + 이온의 세포내 캘리포니아2 + 매장에서 릴리스를 반영. 다시 추가 extracellular 캘리포니아2 + [캘리포니아2 +]나 대표는 SOCE의 증가에 지도 한다. 이 문서에서는, 우리는 MCs에서 SOCE 특성에 대 한이 접근의 성공적인 활용 제시. [캘리포니아2 +]나 변화를 모니터링 하려면 Fura 2 칼슘 표시기로 사용 되었다. Acetoxymethyl 형태로 Fura 2 PMCs에 쉽게 로드할 수 있습니다. 이 비율 염료의 사용 뿐만 아니라 [캘리포니아2 +]나 도, 하지만 또한 기저 [캘리포니아2 +]나 수준에, 차이의 진폭의 비교를 특히 야생 타입/녹아웃을 분석 하기 위한 중요 한 수 있습니다. 셀입니다. Fura-2의 주요 단점 중 하나 유전자 인코딩된 형광 염료와 비교해 다른 세포질 세포 및 그로 인하여 그것의 높은 축적 세포질 형광의 오염 이다.
Fura-2 영상 듀얼 여기 기술이 필요합니다. 일반적으로, 그것은 기술적으로 훨씬 트리거된 광원의 사용 뿐만 아니라 그러나 또한 필터 휠 또는 방출 빛 경로에 이미지 분배기의 참여를 필요로 하는 듀얼 방출 기술 보다 사용 하기 쉽게. 캘리포니아2 + 이미징 고르기가 아닌 다른 셀의 설명 된 프로토콜을 사용할 수 있습니다.
MCs의 주요 기능은 전자 밀도 분 비과 립, 중재자 및 immunomodulatory 물질의 다량으로 채워진다는의 그들의 높은 콘텐츠입니다. MC 활성화 미리 형성 된과 립 화합물의 빠른 릴리스 이끌어 낸다. MC degranulation에서 시험관에서 분석 하는 몇 가지 방법을 사용할 수 있습니다, 방사선된 세로토닌의 검출, 히 스타 민 검출 (ELISA), 항 체를 사용 하 여 및 플라즈마 멤브레인 표면 사용의 증가의 탐지를 포함 하 여 electrophysiological "패치 클램프" 셀 커패시턴스 측정 합니다. 현재 신문에서 우리는 β-hexosaminidase에 생체 외에서 발표의 멀티 잘 색도계 감지를 사용 하 여 분석 결과의 실용적인 응용 프로그램을 설명 합니다. 이 분석 결과 터미널 N은 β-hexosaminidase 수에 따라-아 세 틸-D-hexosamine 잔류물 n에서-아 세 틸-β-D-hexosaminides21. Β-hexosaminidase 히 스타 민 뿐만 아니라 다른 중재자 Cathepsin D 등 TNF와 공동 출시 하 고 따라서 degranulation MCs12,22분 비 소포의 여러 종류에서에 상관으로 사용할 수 있습니다.
설명 기법, PMCs는 다른 secretagogues, β-hexosaminidase 기판와 그들의 반응에 의해 supernatants의 추정 β-hexosaminidase 내용의 펠 릿에 의해 뒤 37 ° C에서 자극 했다. 기판으로 4-Nitrophenyl N-아 세 틸-β-D-glucosaminide 사용 되었다. 그것은 N-아 세 틸-D-글루코사민 및 p-nitrophenol를 분해 했다. P-nitrophenol의 금액은 405에서 빛 흡 광도 의해 계량 colorimetrically nm. ß-hexosaminidase 자료 분석 결과, 4의 일부 수정에서-methylumbelliferil-N-아 세 틸-베타-글루코사민 기판으로 사용 됩니다. 효소 가수분해 후 물질 감지 fluorometrically 화합물을 생성합니다. 우리 출시, 총 콘텐츠를 정규화의 degranulation의 정도 표현. 이 통해 다른 핸드폰 번호와 다양 한 셀 준비 사이 그들의 세부적인 내용을 소개 하는 변화를 피하기 위해 수 있었습니다. 우리는 자발적인 릴리스 MC 생존 능력의 지표로 서 그것의 중요성 때문에 별도로 알려졌다 이후 net 자극된 degranulation에서 자발적인 릴리스 (MCs secretagogues의 부재에서 관찰) 감 하지 않았다. 시험 결과에 높은 가변성을 피하기 위해, 그것은 매우 신중 하 게 supernatants와 알 약의 자극된을 세포 원심 분리 후 분리 하는 것이 중요. 또한 색채 측정을 수행 하기 전에 다 잘 판에 어떤 거품의 형성을 피하기 위해 필수적 이다. 설명된 방법의 중요 한 한계는 결과 절대 값이 아니라 출시 된 중재자의 백분율로 표현 됩니다.
출시 된 세로토닌 또는 히 스타 민의 직접 검출 방법, 달리 보고 분석 결과 훨씬 더 비용 효율적 이며 특수 장비를 요구 한다. 또한, 설명된 기술은, 높은 재현성은 방사성 실험실에서 수행 될 필요가 없습니다 그리고 비싼 항 체의 구입을 요구 하지 않습니다. 따라서, 더 어렵고 비용이 많이 드는 기술에 훌륭한 대안이 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자 돛대 세포 준비와 재배 기술 지원에 대 한 줄리아 Geminn를 인정 하 고 싶습니다. 이 작품은 Transregional 공동 연구 센터 (TR-SFB) 152에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI Medium | Thermo Scientific | 21875034 | |
| DPBS | Sigma-Aldrich | 14190144 | |
| FCS | Thermo Scientific | R92157 | |
| IL-3 | R&D Systems | 403-ML | |
| SCF | Thermo Scientific | PMC2115 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C2272 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fischer Scientific | F1221 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| DNP-HSA | Sigma-Aldrich | A6661 | |
| Anti-DNP-Antibody | Sigma-Aldrich | D-8406 | |
| Penstrep | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Compound 48/80 | Sigma-Aldrich | C2313 | |
| 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | X100 | |
| 4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside | Sigma-Aldrich | N9376 | |
| CoverWell Imaging Chamber | Sigma-Aldrich | GBL635051 | |
| 96-Well plate, v-shaped bottom | Corning | 3896 | |
| 96-Well plates, flat bottom | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Microtiter plate reader with "i-control" software | Tecan | Nano Quant, infinite M200 Pro | |
| Flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I9657 | |
| 50 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Culture Flasks (25 cm) | Greiner Bio-One | 69160 | |
| Cover slips glasses round; ø 25 mm; No. 1 | Menzel | CB00250RA1 | |
| Hemocytometer | VWR | 631-0696 | |
| Inverted Microscope | Zeiss | Observer Z1 | |
| Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil | Zeiss | 440260-9900 | |
| HC Filter Set Fura 2 | AHF | H76-521 | |
| CCD Camera | Zeiss | AxioCam MRm | |
| Monochromatic Light Source | Sutter Instruments | Lambda DG-4 | |
| Imaging Acquisition Program | Zeiss | AxioVision 4.8.2 | |
| Gravity fed solution application system | Custom Made | 4-channel | |
| 15 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Bench Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R |
References
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