Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e cultivar os mastócitos peritoneais murino. Também descrevemos dois protocolos para a sua caracterização funcional: uma imagem fluorescente de enciclopédia Ca2 + concentração intracelular e um ensaio de degranulação baseado na quantificação colorimétrica de β-hexosaminidase a liberado.
Abstract
Mastócitos (MCs), como parte do sistema imunológico, um papel fundamental na defesa do hospedeiro contra vários patógenos e no início da resposta imune alérgica. A ativação de MCs através do cross-linking de superfície IgE ligado ao receptor de IgE de alta afinidade (FcεRI), bem como através da estimulação de vários outros receptores, inicia a ascensão do livre intracelular Ca2 + nível ([Ca2 +]eu) que promove a liberação de mediadores inflamatórios e alérgicos. A identificação dos constituintes moleculares envolvidos nessas vias de sinalização é crucial para a compreensão da regulação da função MC. Neste artigo, descrevemos um protocolo para o isolamento do tipo murino tecido conjuntivo MCs pela lavagem peritoneal e cultivo de MCs peritoneais (EPM). Culturas de MCs de vários modelos de rato nocaute por esta metodologia representam uma abordagem útil para a identificação das proteínas envolvidas na MC vias de sinalização. Além disso, podemos também descrever um protocolo para unicelulares Fura-2 de imagens como uma técnica importante para a quantificação de Ca2 + sinalização no MCs. baseada em fluorescência monitoramento de [Ca2 +] é um confiável e comumente usado abordagem estudo de Ca2 + sinalização de eventos, incluindo a entrada de cálcio operada a loja, que é de extrema importância para a ativação do MC. Para a análise de MC degranulação, descrevemos um ensaio de liberação de β-hexosaminidase. A quantidade de β-hexosaminidase lançado no meio de cultura é considerada como um marcador de degranulação para todos os três diferentes secretoras subconjuntos descrito no MCs. β-hexosaminidase facilmente pode ser quantificado pela sua reação com um substrato de colorigenic em um ensaio colorimetric da placa da microplaca. Esta técnica altamente reprodutível é cost-effective e exige nenhum equipamento especializado. No geral, o protocolo fornecido demonstra um alto rendimento de MCs expressando marcadores de superfície típicas MC, exibindo características fenotípicas e morfológicas típicas da MCs e demonstrando respostas altamente reprodutíveis para secretagogues de Ca2 +- ensaios de imagem e degranulação.
Introduction
MCs desempenham um papel proeminente durante respostas de imune inatas e adquiridas. Especificamente, MCs participarem na morte de patógenos, como bactérias e parasitas e também degradam peptídeos endógenos potencialmente tóxicos ou componentes de venenos (para revisão, consulte Galli et al . 20081). O papel fisiológico de MCs na inata e imunidade adaptativa é objecto de debate acalorado. Portanto, as inúmeras discrepâncias de dados nos estudos realizados com diferentes modelos de rato MC-deficientes exigem uma reavaliação sistemática de funções imunológicas de MCs além de alergia2. MCs maduros são localizadas principalmente em tecidos e órgãos como a pele, pulmão e intestino e normalmente são encontrados apenas em pequenas quantidades no sangue. MCs derivam de precursores hematopoiéticos, como progenitores de MC e completar a sua diferenciação e maturação no microambiente que de quase todos os tecidos vascularizados1. Fator derivado de T-células interleucina (IL) -3 promove seletivamente a viabilidade, proliferação e diferenciação de uma população de pluripotentes de rato MCs de seus progenitores hematopoiéticos3. Fator de célula-tronco (SCF) é produzido por células estruturais nos tecidos e desempenha um papel crucial no desenvolvimento da MC, sobrevivência, migração e função4. As propriedades de MCs individuais podem variar dependendo de sua capacidade de sintetizar e armazenar várias proteases ou proteoglicanos. Nos ratos, os tipo de tecido conjuntivo chamados MCs são distintos dos MCs da mucosa de acordo com sua localização anatômica, morfologia e conteúdo de heparina e proteases5.
No MCs, um aumento de livre citosólico Ca2 + ([Ca2 +]eu) é indispensável para a degranulação e a produção de eicosanoides, bem como para a síntese de citocinas e a ativação de fatores de transcrição em resposta ao antígeno e vários secretagogues6. Um grande alvo a jusante estes estímulos é a fosfolipase C que hidrolisa fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato diacilglicerol (DAG) e inositol 1, 4,5-triphosphate. DAG ativa a proteína quinase C e IP3 libera íons de Ca2 + do retículo endoplasmático. Esgotamento destas lojas ativa Ca2 + fluxo através da membrana plasmática Ca2 + canais, levando para armazenar a entrada de cálcio operados (SOCE). Este processo é evocado através da interação do Ca2 +-sensor, estromais interação molécula-1 (Stim1), no retículo endoplasmático com Orai17 , bem como através da ativação de canal potencial de (TRPC) canônico transitória do receptor proteínas (para revisão, ver Freichel et al . 20148) na membrana plasmática.
Para estudar o papel fisiológico desses canais, vários farmacológicos (aplicação de bloqueadores dos canais) ou abordagens genéticas são normalmente usadas. Neste último caso, supressão da expressão da proteína é alcançado pela segmentação do mRNA ("knockdown") ou edição de DNA genômico com exclusão global ou tecido-específica9 de um exon codificação um poro formando a subunidade de um canal (nocaute). A disponibilidade de um bloqueador com especificidade suficiente para estes canais é limitada. Além disso, a abordagem "knockdown" requer controle cuidadoso de sua efetividade, usando, por exemplo., Western blot análise e é dificultado pela indisponibilidade de anticorpos específicos para a proteína do alvo do canal em muitos casos. Assim, o uso de modelos de rato nocaute ainda é considerado como o padrão ouro para tal análise. Um modelo preferencial em vitro para a investigação das funções do MC é o cultivo da EPM que pode ser isolada ex vivo como uma população totalmente madura (em oposição a diferenciar MCs em vitro de, por exemplo., células da medula óssea)10 . Em comparação com MCs derivada de medula óssea (BMMCs), que também são comumente usados para estudar MC função em vitro, a estimulação de FcεRI e beta-hexosaminidase lançamento é aumento 8-fold e 100-fold na EPM, respectivamente. Neste artigo, descrevemos um método de isolamento e cultivo de murino PMCs, que permite para obter após 2 semanas de cultivo um elevado número de puro tecido conjuntivo digite MCs, suficientes para uma análise mais aprofundada.
Apesar dos recentes progressos no desenvolvimento e aplicação de indicadores de cálcio geneticamente codificado, seu uso é ainda limitado por dificuldades na entrega de genes nas células-alvo, especificamente, em células altamente especializados como principais culturas MCs. Além disso, este grupo de indicadores fluorescentes para [Ca2 +]eu medições ainda carece de corantes ratiometric com uma alta gama dinâmica. Por estas razões, o método preferido para a medição ratiometric [Ca2 +]eu ainda é o uso do corante fluorescente "Fura-2"11.
Atualmente, os mais usados abordagem para a avaliação da ativação de MC e degranulação é a medição da atividade de β-hexosaminidase. Β-hexosaminidase, um mediador alérgico, é um dos componentes do grânulo de MC que é co lançado com histamina em proporção constante de MCs12. Β-hexosaminidase pode ser prontamente e com precisão medido através de sua reação com um substrato específico, que produz uma quantidade mensurável de um produto de colorigenic que é facilmente detectável em um ensaio colorimétrico de microplacas. Neste artigo, é relatada uma aplicação desta técnica de análise de degranulação PMCs em resposta a uma variedade de estímulos.
Agregação de receptor de IgE plasmalemmal de alta afinidade (FcɛRI) ativa no MCs versátil via de sinalização intracelular, levando a uma liberação do conteúdo do grânulo secretor no espaço extracelular circundante. O antígeno específico, além de muitos outros estímulos podem ativar MCs para liberar um diversificado leque de mediadores de imunomoduladores, como anafilatoxinas do complemento (ex., C3a e C5a)13, a vasoconstritor peptídeo endotelina 1 (ET1)14 , como bem como numerosas substâncias catiônicas e drogas provocando reações pseudoallergic (EG., Icatibanto)15 por ligação a MRGPRX216. Vias de sinalização intracelulares envolvido na degranulação induzida por MRGPR MCs caracterizam-se mal em comparação com FcɛRI mediada por sinalização intracelular; essas vias só começaram a ser estudada intensamente durante os últimos poucos anos17 após o receptor identificação16. Em grande parte, os canais iônicos de membrana plasmática envolvidos na entrada de cálcio, seguida de estimulação MRGPRX2 permanecem para ser compreendido. Portanto, o presente artigo centra-se na sinalização intracelular do cálcio e degranulação de MCs estimulada com agonistas MRGPR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os animais procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes da legislação alemã para cuidados e uso de animais de laboratório (oficialmente aprovado pelo Conselho regional de Karlsruhe).
1. PMC isolamento e cultivo por lavagem Intraperitoneal
| 1 | Gelo |
| 2 | seringas de 10 mL |
| 3 | Agulhas 27 G |
| 4 | Agulhas de 20 G |
| 5 | Pinos e blocos de isopor |
| 6 | Tubos de colheita (tubos de centrífuga plástico de 50 mL) |
| 7 | etanol a 70% |
| 8 | Meio RPMI (pré refrigeradas e mantidas no gelo) |
| 9 | PMC médio: Meio RPMI + 20% FCS (soro Fetal da panturrilha) + 1% solução de estreptomicina penicilina (Pen-Strep) |
| 10 | Tampão fosfato de Dulbecco salino - DPBS (sem o Ca2 + e Mg2 +) |
| 11 | Frascos de cultura (25 cm) |
| 12 | Soluções de ações de fatores de crescimento (IL-3: 1 μg/μL; SCF: 2,5 μg/mL) |
| 13 | Pipetas (10ml) |
| 14 | Pontas de pipetas estéreis (20 a 200 µ l) |
| 15 | Hemocytometer |
| 16 | Centrífuga de bancada |
| 17 | Tesoura e pinça |
| 18 | Câmara de CO2 para ratos |
| 19 | Capô aberto de estéril |
| 20 | Fechado estéril capa |
| 21 | Incubadora de célula (37 ° C e 5% CO2) |
| 22 | Pipetas de transferência (20 a 200 µ l) |
Tabela 1: Materiais para a etapa 1.
-
Isolamento de PMC pela lavagem intraperitoneal
- Antes o isolamento de célula, prepare os materiais listados na tabela 1.
- Use 8 a 14 semanas de ratos masculinos para isolamento do PMC. Eutanásia em um rato por inalação de CO2 e confirmar a morte por perda de reflexos. Pulverize o mouse com 70% de etanol e corrigi-lo em um bloco de espuma usando pinos (lado dorsal para baixo). Retire a pele ventral do mouse usando a tesoura de ponta romba. Evite danificar a cavidade peritoneal.
Nota: Nós usamos normalmente este protocolo para ratos com um fundo genético de estirpe C57BL/6N. - Injete 7 mL do meio RPMI gelado e 5 ml de ar na cavidade peritoneal, utilizando uma seringa de 10 mL, equipada com uma agulha 27G. Empurre a agulha cuidadosamente no peritônio e não perfurar a nenhum órgão. Use um ponto na região da gordura epidídimo para reduzir o risco de uma perfuração de órgão.
- Após a injeção, aperte o mouse por 1 min desanexar peritoneais células entram no meio RPMI. Não agite o mouse também fortemente, para evitar danificar os órgãos internos e contaminando a cavidade peritoneal com o sangue.
- Reutilize a seringa de 10 mL, equipando-o com uma nova cânula de 20 G. Deslocar os órgãos internos para um lado, pela inclinação do bloco de espuma e batendo-lhe suavemente no banco para facilitar a aspiração média do outro lado. Inserir uma agulha 20g, bisel para cima e aspirar o fluido no abdômen, devagar e com cuidado (~0.5 mL/s) para evitar entupimentos pelos órgãos internos. Recolha todo o líquido possível (tipicamente 5-6 mL).
- Retire a agulha da seringa e transferir a suspensão de células coletadas em um tubo de coleta no gelo. Descarte um tubo de amostra se houver contaminação do sangue visível.
- Centrifuga os tubos com a suspensão de eritrócitos a ~ 300 x g por 5 min. Sob uma capa esterilizada Aspire o sobrenadante. Para cada rato, combinar as pelotas de amostra em 4 mL de frio (4 a 10 ° C) médio de PMC e a suspensão de células de transferência para um balão de cultura 25 cm2 . Adicione os fatores de crescimento IL-3 e SCF para a concentrações finais 10 ng/mL e 30 ng/mL, respectivamente. Coloque o frasco que contém as células em uma incubadora (37 ° C e 5% CO2) e incube por ~ 48 h, até o próximo procedimento.
-
Cultura do PMC
- Dia 2 (~ 48 h após isolamento): mudança média
- Para remover as células do sobrenadante e não-aderente (hemácias e células mortas), Aspire o meio do recipiente, colocando uma ponta de pipeta Pasteur na borda do frasco e segurando o balão quase horizontalmente. Adicione 4 mL de meio de PMC pré-aquecido por rato. Adicionar os fatores de crescimento, IL-3 (10 ng/mL) e SCF (30 ng/mL). Coloque o frasco que contém as células em uma incubadora (37 ° C e 5% CO2).
- Dia 9: Célula dividindo
- Transferi a suspensão de células de balão de cultura de células em um tubo de centrífuga plástico de 50 mL. Lavar o balão três vezes com fosfato salino do 10ml pré aquecido (37 ° C) Dulbecco (DPBS), coletando a suspensão de células com as células destacadas no mesmo 50 mL plástico tubo de centrifugação. Contar a concentração de células por um hemocytometer e calcular o número total das células.
- Centrifugar a suspensão de eritrócitos a ~ 300 x g por 5 min e aspirar o sobrenadante. Recupere a pelota médio pré-aquecido e PMC (37 ° C) para obter a célula concentração 1 x 106 células/mL. Transferi a suspensão de células para um novo frasco de cultura2 25 cm. Descarte o frasco velho com fibroblastos aderindo ao fundo.
- Adicionar os fatores de crescimento, IL-3 (10 ng/mL) e SCF (30 ng/mL) e coloque o frasco que contém as células em uma incubadora (37 ° C e 5% CO2).
- Dias 12 – 15: medições de célula
- Se quaisquer experimentos com estimulação dos receptores FcɛRI são planejados, pré-tratamento das células durante a noite com 300 ng/mL de IgE anti-DNP em meio de cultura padrão. Prossiga com a etapa 2 ou etapa 3.
- Dia 2 (~ 48 h após isolamento): mudança média
2. medição de concentração fluorométrica de cálcio livre intracelular em EPM
- Antes as medições, prepare os materiais listados na tabela 2. Além disso, preparar uma configuração de imagem consiste em: microscópio de fluorescência invertido; Objectivo: 40 X / 1,3 de óleo; Fura 2 filtro definido; Câmera do CCD; Fonte de luz de excitação; Programa de aquisição de imagem; Gravidade alimentados com sistema de aplicação de solução.
| 1 | PMC (12 – 15 dias de idade) 1 x 106 células/mL |
| 2 | Concanavalina A |
| 3 | Fura-2h |
| 4 | Solução a 20% Pluronic F-127 |
| 5 | Lamínulas óculos redondos; ø 25 mm; N. º 1 |
| 6 | Solução-mãe de DNP-HSA (albumina de soro humano-dinitrofenol) |
| 7 | Solução anti-DNP-anticorpos (IgE) |
| 8 | Placa de fundo plano (12 cavidades) |
| 9 | Solução de reserva composta 48/80 |
| 10 | Cubra bem imagem Chambers |
| 11 | Hemocytometer |
| 12 | Pipetas de transferência (20 a 200 µ l) |
Tabela 2: Materiais para a etapa 2.
-
Preparação de imagem fura-2
- Realizar uma contagem de células usando um hemocytometer e ajustar a concentração de células a 1 x 106 células/mL. Dividi as colônias PMCs pipetando suavemente (3 a 5 vezes) a suspensão de células com uma ponta de pipeta de 1 mL.
- Preparar um Ca2 +-contendo HEPES sal solução tampão (Ca2 +- HBSS) composto de 135 mM NaCl, 6 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,2 mM MgCl2, 10mm HEPES e glicose de 12 mM. Ajuste o pH para 7,4 com 3 M de NaOH.
- Preparar a Concanavalina A corrediças revestidas por pipetagem 1 gota de solução Concanavalina A (0,1 mg/mL em H2O) em cada 25 mm redondo tampa vidro sob uma capa de estéril. Deixe as gotas sobre as lamínulas pelo menos 1 min, em seguida, remover a maioria da solução com uma pipeta e deixe as lamínulas secar por 45 min. Pressione cuidadosamente as Concanavalina A tratados lamínulas sobre a borracha de câmara de imagem (consulte a Tabela de materiais) até Eles atribuem para obter microscopia câmaras de imagem.
Nota: Slides de poli-L-Lysine revestido podem ser usados como uma alternativa. - Dissolver o corante2 + Ca fluorescente Fura-2 AM (1 mM) em dimetilsulfóxido (DMSO). Guarde esta solução protegida da luz.
- Diluir o Fura-2 solução em Ca2 +AM - HBSS a uma concentração final de 5 µM para preparar o amortecedor do carregamento do"". Suplemento com 5 µ l/mL de 20% pluronic F-127 em DMSO.
- Mix de 500 µ l do buffer"carregando" com 500 µ l de suspensão de células o PMC. Pipetar a mistura para a câmara de imagem e incube as celulas por 20-30 min à temperatura ambiente no escuro.
- Configure a gravidade alimentada com sistema de aplicação com diferentes soluções de acordo com o protocolo de estimulação. Suplemento seringa 1 com 40 mL de solução de Ca2 +- HBSS, 2 com 40 mL de Ca2 +- HBSS solução contendo 100 ng/mL DNP a seringa, seringa 3 com 40 mL de Ca2 +- HBSS solução contendo 50 µ g/mL composto 48/80, seringa 4 com 40 mL de nominalmente Ca2 +-livre-solução HBSS e seringa 5 com 40 mL de nominalmente Ca2 +-livre-solução HBSS contendo 2 µM Thapsigargin.
- Prepare um objectivo de imersão de óleo de alta-abertura X 40, colocando uma pequena gota de óleo de imersão sobre ele.
- Monte o sistema de aplicação no palco do microscópio invertido. Coloque a câmara de imagem com as pilhas carregadas no sistema de aplicação e fixá-lo para evitar movimento durante a gravação. Ligue a luz transmitida e concentrar as células.
- Enxague as células três vezes com Ca2 +- HBSS buffer usando o sistema de aplicação de gravidade-alimentado.
- Incube as celulas em Ca2 +- HBSS por 5 min para Fura-2 esterificação de AM.
- Enxagúe as células mais uma vez antes de iniciar a geração de imagens remover qualquer potencialmente vazou tintura fluorescente.
-
Imagem latente da pilha
- Inicie o programa de aquisição de imagens no modo de aquisição fisiológica. Abra a janela de configuração e ajustar o foco e o tempo de aquisição ideal (que deve ser o mesmo para a excitação com 340 nm e 380 nm e normalmente varia entre 50-150 ms).
Nota: Minimizar a exposição do Fura-2 célula carregada à luz para evitar fotobranqueamento do corante. - Uma foto de referência da imagem e marcar as células como regiões de interesse (ROI). Marca o último ROI em uma área onde não há células estão presentes e definem-la como plano de fundo.
- Complete a instalação e iniciar a medição com uma taxa de aquisição de s 5.
Nota: As células serão alternadamente iluminadas com a luz de excitação de 340 nm e 380 nm e a fluorescência emitida (> 510 nm) serão coletados usando a câmera do CCD. As imagens de fluorescência sinais F340 nm e F380 nm, bem como a relação (F340 F380/nm nm) serão exibidas em três janelas. Os gráficos do curso do tempo da intensidade de fluorescência de ROIs individual quer dizer valores serão exibidos também continuamente. - Adicione soluções com o número de ciclo adequado de acordo com o desenho do experimento:
- A medida induzida pelo antigénio elevação de [Ca2 +]eu, conforme ilustrado na Figura 2A, 2B, aplica a solução de seringa 2 após ciclo 20 e parar a gravação depois ciclo 150.
- Para medir a elevação induzida pelo composto 48/80 de [Ca2 +]i,como ilustrado na Figura 2C, aplicar a solução de seringa 3 após ciclo 20 e parar a gravação depois ciclo 150.
- Para medir a elevação da [Ca2 +]eu evocada por SOCE, conforme ilustrado na Figura 2D, aplicar a solução de seringa 4 após o ciclo 10, aplicar a solução de seringa 5 após ciclo 70, aplicar a solução de seringa 4 após ciclo 120, Aplique a solução de seringa 1 após ciclo 150 e parar a gravação após ciclo de 220.
- Depois de terminar a medição, converter os resultados em uma tabela de relação contendo as intensidades medidas para comprimentos de onda da excitação com e sem correção de fundo, bem como os valores de relação com e sem correção de fundo para cada ROI e cada ponto de medição do tempo. No programa de aquisição, consecutivamente, pressione os botões: "cortador de início", "marcar todos", "converter tudo", "medições de fisiologia", "Okey,"Okey". Salve os arquivos como tabelas e pilhas de imagem para análise off-line.
- Inicie o programa de aquisição de imagens no modo de aquisição fisiológica. Abra a janela de configuração e ajustar o foco e o tempo de aquisição ideal (que deve ser o mesmo para a excitação com 340 nm e 380 nm e normalmente varia entre 50-150 ms).
3. beta-hexosaminidase lançamento medição em EPM
| 1 | PMC (12 – 15 dias de idade) 1 x 106 células/mL |
| 2 | Solução anti-DNP-anticorpos (IgE) |
| 3 | Solução-mãe de DNP-HSA |
| 4 | Solução de reserva composta 48/80 |
| 5 | Ionomycin |
| 6 | Placa de 96 poços, fundo em forma de v |
| 7 | Placas de 96 poços, fundo chato |
| 8 | Tubos de centrífuga plástico (15 mL) |
| 9 | Pipetas |
| 10 | Incubadora de célula (37 ° C e 5% CO2) |
| 11 | Centrífuga de bancada |
| 12 | Leitor de placas de microtitulação para medições de densidade óptica |
| 13 | Pipeta multicanal (20 – 200 μL) |
| 14 | Hemocytometer |
Tabela 3: Materiais para a etapa 3.
- Antes as medições, prepare os materiais listados na tabela 3.
Nota: lançado de MCs após sua estimulação β-hexosaminidase hidrolisa p-nitrofenil-acetil-D-glucosamina (pNAG) p-nitrofenol e N-acetil-D-glucosamina. A quantidade de β-hexosaminidase na amostra é proporcional à quantidade de p-nitrofenol que será formada. Em um ambiente de pH elevado da "Solução de paragem", de p-nitrofenol existe como totalmente deprotonado p-nitrophenolat e pode ser detectado por sua luz absorbância em 405 nm. - Prepare a solução de Tyrode contendo 130 mM de NaCl, 5 mM KCl, 1,4 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10mm HEPES, glicose de 5,6 mM e BSA 0,1%. Ajuste o pH para 7,4 com 3 M de NaOH.
- Prepare a solução de Lise adicionando um volume de 1% de Triton X-100 solução de Tyrode.
- Preparar a solução de paragem composta por glicina de 200mm e ajustar o pH a 10,7 com NaOH.
- Prepare a solução de pNAG (2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside 4-nitrofenil) dissolvendo-se pNAG em ácido cítrico de 0,4 M a uma concentração final de 4 mM.
- Calcular a quantidade de células necessárias para o ensaio (realizar o ensaio em duplicado). Uso de 200.000 PMCs por bem. Use 2 poços como controles negativos (solução de Tyrode sem qualquer secretagogues como DNP ou composto 48/80) e 2 poços como controles positivos (solução de Tyrode, com 10 µM Ionomycin) para cada genótipo.
- Transferir as células para um tubo de centrífuga plástico 15 mL, ajuste o volume para 15 mL com solução de Tyrode e centrifugar a x 200 g por 4 min. remover o sobrenadante com uma pipeta Pasteur e ressuspender as células em solução de Tyrode para 2 x 106 células /mL.
- Transferi 100 µ l de suspensão de células por poço em uma chapa bem V-fundo de 96 poços. Adicione 25 µ l de estimulação ou solução de controle a cada poço (de acordo com o esquema de pipetagem, ilustrado na Figura 3A). Incube as celulas por 45 min a 37 ° C e 5% de CO2.
- Pare a reação, colocando a placa de 96 poços no gelo por 5 min. Em seguida, centrifugar a placa a 4 ° C por 4 min a 120 x g. Transferência de 120 µ l do sobrenadante com uma pipeta multicanal para uma placa de 96 poços de fundo plano e colocá-lo no gelo. Com cuidado, evite tocar as pelotas de célula, mas completamente, aspirar o sobrenadante.
- Adicione 125 µ l de tampão de Lise nas pelotas de célula. Incubar as pelotas de célula por 5 min à temperatura ambiente e ressuspendê-los após a incubação por pipetagem repetidas (aproximadamente 5 vezes).
- Pipete 25 µ l da solução de pNAG (4mm) em poços necessários de uma nova placa de 96 poços de fundo plano. Adicione 25 µ l de cada sobrenadante para a solução de pNAG preparado, bem como 25 µ l de cada lisado celular.
- Incubar os lotes de reação para 1 h a 37 ° C. Após a incubação, pipete 150 µ l de solução de paragem em cada poço para parar a reação.
- Analisar a placa com um leitor de microplacas usando uma configuração dual-comprimento de onda de 405 nm com referência 630 nm para subtração de fundo automático. No programa de aquisição, marque a caixa "Referência" e no menu de elemento do programa de "Absorção", selecione "630 nm" da lista drop-down. Se a densidade óptica das amostras é muito alta, prepare uma diluição adequada da sonda antes de remeasuring.
- Calcule a percentagem de β-hexosaminidase liberação de acordo com a seguinte equação:
onde lançamento [%] é a porcentagem de liberação de beta-hexosaminidase específico, um [sobrenadante] é o fundo corrigido a absorção do líquido sobrenadante, e um [lisado] é o fundo corrigida de absorção da célula correspondente lisada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
EPM foram isoladas a partir de 3 ratos de tipo selvagem (C57BL/6N) por lavagem intraperitoneal e mais cultivadas em meio RPMI suplementado com FCS de 20% e 1% caneta-Strep na presença de fatores de crescimento (IL-3 a 10 ng/mL) e SCF em 30 ng/mL em estéreis humedecidas condições no 37 ° C e 5% CO2. O meio foi mudado nos dias 2 e 9, após o isolamento da célula. A morfologia celular foi analisada usando transmissão luz imagem DIC (consulte a Figura 1A, B). O contraste de célula e granularidade demonstraram a viabilidade celular bom. Depois de 2 semanas de cultivo sob estas condições, obteve-se uma população homogênea de 1,5 x 107 células. Análise de citometria de fluxo das células co manchadas com anti-IgE anticorpo conjugado com FITC e anticorpo Anti-c-Kit conjugados com PE revelou 98,6% de FITC positivo e 99,8% PE células positivas (Figura 1C). 98,5% das células cultivadas eram duplo positivo para FITC e PE (C(Figura 1), demonstrando características típicas da MCs maduros.
Para analise posterior funcional das células obtidas, fluorométrica [Ca2 +]eu usando indicador fluorescente Fura-2 foram realizadas medidas. Fura-2 células carregadas alternadamente foram iluminadas com 340 nm e 380 nm de excitação luz cada 5 s e fluorescência > 510 nm foi registrado usando uma câmera CCD. A relação da fluorescência (F340/F380) foi monitorada constantemente. Aplicação de DNP (100 ng/mL) para PMC incubado durante a noite com 300 ng/mL de IgE anti-DNP evocou uma elevação pronunciada da [Ca2 +]eu nível de, que lentamente deteriorado no máximo metade ao longo de vários minutos (Figura 2A, B). A variabilidade das respostas de célula foi relativamente baixa (Figura 2A, B). Estimulação dos receptores MRGPRB2 com 50 µ g/mL do composto 48/80, com o mesmo protocolo de tempo também aumentou significativamente [Ca2 +]i em PMCs Fura-2-carregado com uma muito semelhante amplitude média da resposta (Figura 2C). Para a análise do SOCE na EPM, foi aplicado um protocolo de "re-adição": 10 ciclos após o início da medição, externo Ca2 + foi removido e durante ciclos de 70 a 120, Thapsigargin (2 µM), um inibidor do retículo endoplasmático ATPase, foi aplicado para o esgotamento de Ca2 + lojas intracelulares e ativação máxima de SOCE. A transitória [Ca2 +]eu elevação reflete a Ca2 + liberação de Ca2 + lojas intracelulares em um nominalmente Ca2 +-livre solução do banho (Figura 2D). Restaurando a concentração externa de Ca2 + a 2 mM após ciclo 150 resultou em um aumento proeminente de [Ca2 +]i nível devido ao influxo de Ca2 + através dos canais SOCE (Figura 2D). Este componente da resposta Ca2 + foi fortemente inibida na presença de 10 µM GSK 7975A, conhecido como um bloqueador CRAC, Considerando que a Ca2 + liberação de Ca2 + lojas intracelulares permaneceu inalterado (Figura 2D ).
Na próxima etapa, testamos a capacidade dos PMCs isolados de sofrem degranulação após reticulação dos receptores de alta afinidade de FcɛRI ou a estimulação dos receptores de MRGPRB2. Para essa finalidade, foi realizado um ensaio de liberação de ß-hexosaminidase. As células foram adicionadas a uma placa de 96 V-inferior (2 x 105 células/poço) e estimuladas de acordo com o esquema ilustrado na Figura 3,A 45 minutos a 37 ° C. A placa foi centrifugada e após a remoção do líquido sobrenadante, os pellets foram lysed. O conteúdo de ß-hexosaminidase de sobrenadantes individuais e pelota lysates foi analisado por suas reações com pNAG durante uma incubação de 1 h a 37 ° C. A quantidade de produtos da reação foi detectada colorimetricamente e a percentagem de ß-hexosaminidase a lançado foi calculada (consulte a Figura 3B). A liberação espontânea era muito baixa (1%), Considerando que as respostas aos estímulos de degranulação forte como 10 µM Ionomycin e composto 48/80 a 50 µ g/mL foram mais 40% e 60%, respectivamente. Degranulação respostas à estimulação DNP foram dose-dependente na faixa de concentração de 10 a 300 ng/mL. Juntos, estes dados indicam claramente o bom estado funcional dos PMCs isolados.
Figura 1 : Caracterização da escola primária de culto murino selvagem tipo PMCs executadas usando análise de citometria de fluxo e microscopia DIC. (, B) Imagens representativas obtidas usando 20 X plasDIC objetivo de PMCs cultivadas em frascos plásticos de 25 cm2 1 h após o isolamento da célula por lavagem intraperitoneal (A) e no dia 9 de cultivo (B). Barras de escala no canto direito inferior canto indicar 100 µm. (C) fluxo cytometry análise de EPM (culto de 12 dias de acordo com o protocolo descrito acima) co manchado com anti-IgE anticorpo conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) e Anti-c-kit anticorpos conjugados com ficoeritrina (PE). O enredo de densidade celular é dividido em quatro quadrantes: Q1, PE acima autofluorescência nível/FITC abaixo do nível de autofluorescência; Q2, PE acima autofluorescência nível/FITC acima autofluorescência do nível; Q3, PE abaixo autofluorescência nível/FITC abaixo do nível de autofluorescência; Q4, PE abaixo autofluorescência nível/FITC acima do nível autofluorescência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Gravação de [Ca2 +] eu em Fura-2 carregado PMCs isolados de ratos tipo selvagem. [Ca 2 + ]eu apresenta-se como relação de fluorescência F340/F380. (A) representante vestígios do [Ca2 +]eu tempo curso de EPM individuais (n = 38) estimulada com DNP (100 ng/mL). (B) tempo curso de DNP (100 ng/mL)-evocada [Ca2 +]eu elevação. Cada ponto de dados indica os valores médios obtidos de 38 células individuais ilustradas no painel A. As EPM foram pré-tratados durante a noite com 300 ng/mL de IgE anti-DNP. (C) curso a tempo dos valores médios do composto 48/80-induzida [Ca2 +]eu elevação na EPM (n = 60). (D) curso a tempo dos valores médios de [Ca2 +]eu alterações durante intracelular Ca2 +-armazenar depleção induzida pela aplicação de 2 µM Thapsigargin (Tg) em nominalmente Ca2 +-livre solução, seguida por loja operado o influxo de cálcio após re-adição de 2 mM de Ca2 + em solução de banho no grupo controle (n = 44) das EPM (quadrados pretos) e na presença de 10 µM da GSK 7975A na solução de banho (quadrados azuis) (n = 41). Em B, C e D, as barras de erro mostram o erro padrão da média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Beta-hexosaminidase solte colorimétricas multi bem as medições realizadas com PMCs isolados de ratos tipo selvagem. (A) esquema de estimulação da placa de 96 poços pipetagem para realizar o ensaio da beta-hexosaminidase; os resultados são apresentados no painel que b. "espontânea" corresponde a pipetagem de solução de Tyrode, sem adição de qualquer secretagogues; IM = Ionomycin; CP 48/80 = composto 48/80. (B) barra gráfico ilustrativo percentual de liberação de ß-hexosaminidase em condições basais (CNPq), após estimulação com Ionomycin (IM), albumina de soro humano-Dinitrofenol (DNP) e composto 48/80 (Cp 48/80) com concentrações indicadas. O ensaio foi realizado em duplicata; barras de erro mostram o erro padrão da média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Modelos MC podem ser usados com sucesso para estudar MC degranulação, quimiotaxia, adesão, bem como para elucidar intracelular vias de transdução sinalização envolvidas na ativação de MC. Alguns pesquisadores uso modelos humanos MCs, tais como linhas imortalizadas (LAD2 e HMC1) ou MCs humanas derivados da medula sangue células progenitoras (CD133 +) e células progenitoras de sangue periférico (CD34 +). Outros preferem roedores modelos MC, tais como imortalizados (leucemia basophilic do rato RBL - 2H 3 MC linha) ou primária cultivadas (mouse BMMCs osso-medula-derivado de MCs, PMCs) modelos. Murino MCs primários podem ser usados para analisar a função de MC em numerosos modelos de rato "knock-out", que são a abordagem padrão-ouro para a exploração das funções fisiológicas dos genes específicos e proteínas codificadas. O défice de ferramentas farmacológicas para potência e seletividade suficiente faz com que esse método particularmente valioso para a investigação dos mecanismos de transdução de sinal por MC ativação18. PMCs murino são o fenótipo de tecido conjuntivo que apresenta uma morfologia madura e alta granularidade. Eles apenas não respondem bem ao antígeno reticulação de FcεRI como BMMCs, mas também são ativados por agonistas de vários receptores adicionais, tais como endotelina 1 ou composto 48. No entanto, o rendimento dos PMCs normalmente é significativamente mais baixo em comparação com o de BMMCs e geralmente não é suficiente para realizar um Western blot ou outra técnica que requer um grande número de células. Várias técnicas foram descritas para o isolamento e purificação da EPM. Por exemplo, centrifugação gradiente de Percoll foi relatada para produzir uma alta pureza da células19; no entanto, o número de células obtidas com esta técnica normalmente é relativamente baixo. O protocolo descrito aqui, o passo mais crítico é a aspiração de suspensão de células da cavidade peritoneal. Evitando a contaminação do sangue da amostra e aspirar a quantidade máxima de possíveis médias são essenciais para obter um elevado número de EMP de alta pureza. Com algumas cepas de rato, um número máximo de PMC é obtido apenas por um reduzido (11 – 12 dias) período de cultivo. Deixando essas células nas condições de cultura para mais tempo leva apenas a uma redução do número de células.
No presente estudo, descrevemos um simples protocolo adequado para o isolamento de MCs maduros que torna possível obter uma população altamente pura do MC da cavidade peritoneal do mouse. As células obtidas são caracterizadas por uma elevada homogeneidade e apresentam características típicas de MC, tais como a expressão de receptores de marcador específico (KIT e FcεRI). Estas células apresentam claramente a característica de MC para desgranulam e aumentar sua [Ca2 +]eu em resposta à ativação de FcɛRI e MRGPR.
MC sinalização está firmemente relacionado ao [Ca2 +]i nível determinado pelo Ca2 + lançamento de lojas intracelulares e entrada de Ca2 + através de canais de membrana plasmática. [Ca2 +] eu elevação ativa um complexo de vias de sinalização intracelulares que degranulação de gatilho MC. Como em outras células não-excitáveis, a principal Ca2 + influxo via no MCs é ativado pelo esgotamento do Ca2 +o SOCE-armazena. Identificação dos canais envolvidos nesta via de sinalização é crucial para a compreensão da regulação da função MC. Para a identificação dos componentes moleculares do percurso SOCE, a técnica de microfluorometric utilizando indicadores de Ca2 + fluorescentes e a abordagem de "remendo-braçadeira" eletrofisiológicos têm desempenhado um papel proeminente. No entanto, a elevação de [Ca2 +]eu nível é a soma de liberação de Ca2 + e SOCE. Para discriminar estas duas fases de mobilização de Ca2 + , o chamado protocolo de "Re-adição2 + Ca" (para revisão ver pássaro et al 200820) foi desenvolvido anteriormente. Neste protocolo, a solução de sal externa é alternada de um contendo normal [Ca2 +]ó (1-2mm) para um nominalmente Ca2 +-livre solução. Nestas condições, as células são tratadas com thapsigargin para esvaziar o Ca2 + lojas e assim ativar completamente SOCE. Na ausência de extracelular Ca2 +, thapsigargin tratamento evoca a transientes [Ca2 +]eu elevação, refletindo uma liberação de íons de Ca2 + de Ca2 + lojas intracelulares. A re-adição de extracelular Ca2 + leva a um aumento de [Ca2 +]eu representando a SOCE. Neste artigo, apresentamos a utilização bem sucedida desta abordagem para a caracterização de SOCE no MCs. Para monitorar [Ca2 +]eu mudanças, Fura-2 foi usado como um indicador de cálcio. Na sua forma acetoximetil, Fura-2 facilmente pode ser carregado no EPM. O uso de tintura esta ratiometric permite a comparação de amplitudes não só de [Ca2 +]eu elevações, mas também diferenças em [Ca2 +]eu níveis basais, que é particularmente importante para a análise de tipo selvagem/nocaute células. Comparado com corantes fluorescentes geneticamente codificados, uma das principais desvantagens do Fura-2 é sua alta acumulação de diferentes organelas celulares e contaminação da fluorescência citoplasmática.
A imagem de Fura-2 requer uma técnica de dupla excitação. Normalmente, é tecnicamente muito mais fácil de usar do que a técnica de dupla emissão que exige não só o uso de uma fonte de luz desencadeada, mas além do envolvimento de uma roda de filtro ou um divisor de imagem no caminho de luz de emissão. O protocolo descrito pode ser usado para a Ca2 + imagem latente de outras células não-excitáveis.
Uma característica fundamental do MCs é seu alto conteúdo dos grânulos secretores elétron-densa, que está cheio de grandes quantidades de mediadores e substâncias imuno. MC ativação leva a uma rápida liberação de grânulos pré-formados compostos. Várias abordagens para analisar MC degranulação em vitro estão disponíveis, incluindo a detecção de serotonina radiolabeled, usando anticorpos (ELISA) de detecção de histamina e a detecção de um aumento do uso de superfície de membrana plasmática medidas de capacitância de célula eletrofisiológicos "remendo-braçadeira". No presente artigo, descrevemos uma aplicação prática do ensaio usando multi bem Detecção colorimétrica de em vitro lançado β-hexosaminidase. Este ensaio é baseado na capacidade de β-hexosaminidase a hidrolisar o terminal N-acetil-D-hexosamine resíduos em N-acetil-β-D-hexosaminides21. Β-hexosaminidase co é lançado com histamina, mas também com outros mediadores como catepsina D ou TNF e, portanto, pode ser usado como um correlato de degranulação de vários tipos de vesículas secretoras no MCs12,22.
A técnica descrita, PMCs foram estimulados a 37 ° C com diferentes secretagogues, seguidos por uma estimativa de sobrenadantes, bem como pelotas de conteúdo de β-hexosaminidase suas reações com substrato de β-hexosaminidase. Como substrato, utilizou-se 4-Nitrophenyl N-acetil-β-D-glucosaminide. Isso foi hidrolisado a N-acetil-D-glucosamina e p- nitrofenol. A quantidade de p- nitrofenol foi quantificada colorimetricamente pela luz absorbância em 405 nm. Em algumas modificações do ensaio de lançamento do ß-hexosaminidase, 4-methylumbelliferil-N-acetil -beta- glucosamina é usado como substrato. Após a hidrólise enzimática, a substância gera um composto fluorometrically detectável. Estamos em percentagem da extensão da degranulação do lançamento, normalizado para o conteúdo total. Isso nos permitiu evitar a variabilidade introduzida por números diferentes de célula e seu conteúdo granular entre várias preparações da pilha. Nós não subtrair uma liberação espontânea (observada na ausência de MCs secretagogues) de líquido degranulação estimulada, desde que uma liberação espontânea foi reportada separadamente devido à sua importância como indicador de viabilidade de MC. Para evitar a alta variabilidade nos resultados do ensaio, é importante separar cuidadosamente os sobrenadantes e pelotas após centrifugação das células estimuladas. Também é essencial para evitar a formação de quaisquer bolhas nas placas de multi bem antes de realizar as medições colorimétricas. Uma limitação significativa do método descrito é que o resultado é representado não como um valor absoluto, mas como um percentual do mediador liberado.
Em contraste com os métodos de detecção direta de serotonina liberada ou histamina, o ensaio relatado é muito mais rentável e exige nenhum equipamento especializado. Além disso, a técnica descrita é altamente reprodutível, não precisa ser realizada em um laboratório radioactivo e não exige a compra de anticorpos caros. Portanto, pode ser uma excelente alternativa às técnicas mais caras e difícil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores gostaria de reconhecer a Julia Geminn para obter assistência técnica na preparação de mastócitos e cultivo. Este trabalho foi apoiado pela transregionais o centro de investigação colaborativa (TR-SFB) 152.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI Medium | Thermo Scientific | 21875034 | |
| DPBS | Sigma-Aldrich | 14190144 | |
| FCS | Thermo Scientific | R92157 | |
| IL-3 | R&D Systems | 403-ML | |
| SCF | Thermo Scientific | PMC2115 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C2272 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fischer Scientific | F1221 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| DNP-HSA | Sigma-Aldrich | A6661 | |
| Anti-DNP-Antibody | Sigma-Aldrich | D-8406 | |
| Penstrep | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Compound 48/80 | Sigma-Aldrich | C2313 | |
| 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | X100 | |
| 4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside | Sigma-Aldrich | N9376 | |
| CoverWell Imaging Chamber | Sigma-Aldrich | GBL635051 | |
| 96-Well plate, v-shaped bottom | Corning | 3896 | |
| 96-Well plates, flat bottom | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Microtiter plate reader with "i-control" software | Tecan | Nano Quant, infinite M200 Pro | |
| Flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I9657 | |
| 50 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Culture Flasks (25 cm) | Greiner Bio-One | 69160 | |
| Cover slips glasses round; ø 25 mm; No. 1 | Menzel | CB00250RA1 | |
| Hemocytometer | VWR | 631-0696 | |
| Inverted Microscope | Zeiss | Observer Z1 | |
| Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil | Zeiss | 440260-9900 | |
| HC Filter Set Fura 2 | AHF | H76-521 | |
| CCD Camera | Zeiss | AxioCam MRm | |
| Monochromatic Light Source | Sutter Instruments | Lambda DG-4 | |
| Imaging Acquisition Program | Zeiss | AxioVision 4.8.2 | |
| Gravity fed solution application system | Custom Made | 4-channel | |
| 15 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Bench Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R |
References
- Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity. Nat Rev Immunol. 8 (6), 478-486 (2008).
- Feyerabend, T. B., et al. Cre-mediated cell ablation contests mast cell contribution in models of antibody- and T cell-mediated autoimmunity. Immunity. 35 (5), 832-844 (2011).
- Razin, E., Cordon-Cardo, C., Good, R. A. Growth of a pure population of mouse mast cells in vitro with conditioned medium derived from concanavalin A-stimulated splenocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (4), 2559-2561 (1981).
- Galli, S. J., Zsebo, K. M., Geissler, E. N. The kit ligand, stem cell factor. Adv Immunol. 55, 1-96 (1994).
- Galli, S. J., et al. Mast cells as "tunable" effector and immunoregulatory cells: recent advances. Annu Rev Immunol. 23, 749-786 (2005).
- Ma, H. T., Beaven, M. A. Regulators of Ca(2+) signaling in mast cells: Potential targets for treatment of mast cell-related diseases. Adv Exp Med Biol. 716, 62-90 (2011).
- Vig, M., et al. Defective mast cell effector functions in mice lacking the CRACM1 pore subunit of store-operated calcium release-activated calcium channels. Nat Immunol. 9 (1), 89-96 (2008).
- Freichel, M., Almering, J., Tsvilovskyy, V. The role of TRP proteins in mast cells. Front Immunol. 3, 150 (2014).
- Scholten, J., et al. Mast cell-specific Cre/loxP-mediated recombination in vivo. Transgenic Res. 17 (2), 307-315 (2008).
- Malbec, O., et al. Peritoneal cell-derived mast cells: An in vitro model of mature serosal-type mouse mast cells. J Immunol. 178 (10), 6465-6475 (2007).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- Schwartz, L. B., Austen, K. F., Wasserman, S. I. Immunologic release of beta-hexosaminidase and beta-glucuronidase from purified rat serosal mast cells. J Immunol. 123 (4), 1445-1450 (1979).
- Schafer, B., et al. Mast cell anaphylatoxin receptor expression can enhance IgE-dependent skin inflammation in mice. J Allergy Clin Immunol. 131 (2), 541-549 (2013).
- Maurer, M., et al. Mast cells promote homeostasis by limiting endothelin-1-induced toxicity. Nature. 432 (7016), 512-516 (2004).
- Maurer, M., Church, M. K. Inflammatory skin responses induced by icatibant injection are mast cell mediated and attenuated by H(1)-antihistamines. Exp Dermatol. 21 (1), 154-155 (2012).
- McNeil, B. D., et al. Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions. Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).
- Gaudenzio, N., et al. Different activation signals induce distinct mast cell degranulation strategies. J Clin Invest. 126 (10), 3981-3998 (2016).
- Solis-Lopez, A., et al. Analysis of TRPV channel activation by stimulation of FCepsilonRI and MRGPR receptors in mouse peritoneal mast cells. PLoS One. 12 (2), 0171366 (2017).
- Enerback, L., Svensson, I. Isolation of rat peritoneal mast cells by centrifugation on density gradients of Percoll. J Immunol Methods. 39 (1-2), 135-145 (1980).
- Bird, G. S., DeHaven, W. I., Smyth, J. T., Putney, J. W. Methods for studying store-operated calcium entry. Methods. 46 (3), 204-212 (2008).
- Aronson, N. N., Kuranda, M. J. Lysosomal degradation of Asn-linked glycoproteins. FASEB J. 3 (14), 2615-2622 (1989).
- Moon, T. C., Befus, A. D., Kulka, M. Mast cell mediators: their differential release and the secretory pathways involved. Front Immunol. 5, 569 (2014).
