Summary
Protokollet beskrivs hur man ingenjör en perfusable vaskulär nätverk i en sfäroid. Den sfäroid omgivande närmiljön är utarbetat för att inducera angiogenes och ansluta sfäroid till mikrokanaler i en mikroflödessystem enhet. Metoden tillåter perfusionen i den sfäroid, vilket är en efterlängtad teknik i tredimensionella kulturer.
Abstract
En sfäroid (en flercelliga aggregat) betraktas som en bra modell av levande vävnader i människokroppen. Trots betydande framsteg inom sfäroid kulturerna förblir ett perfusable vaskulär nätverk i spheroids en viktig utmaning för långtidsodling som krävs för att upprätthålla och utveckla deras funktioner, såsom protein uttryck och morfogenes. Protokollet presenterar en ny metod för att integrera en perfusable vaskulär nätverk inom sfäroid i en mikroflödessystem enhet. För att framkalla en perfusable vaskulär nätverk i sfäroid, vägleddes angiogena groddar ansluten till mikrokanaler till sfäroid genom att utnyttja angiogena från humana lungfibroblaster odlade i sfäroid. Angiogena groddarna nådde den sfäroid, samman med endotelceller Co odlade i sfäroid, och bildade en kontinuerlig vaskulär nätverk. Vaskulära nätverket kunde BEGJUTA interiören sfäroid utan läckage. Det konstruerade vaskulär nätverket kan användas ytterligare som en rutt för tillförsel av näringsämnen och avlägsnande av slaggprodukter, härma blodcirkulationen i vivo. Metoden ger en ny plattform i sfäroid kultur mot bättre rekapitulation av levande vävnader.
Introduction
Skifta från en enskiktslager (tvådimensionell) kultur till en tredimensionell kultur motiveras av behovet av att arbeta med kultur modeller som efterliknar de cellulära funktionerna levande vävnader1,2,3. Platt och hård plast substrat som vanligen används i cellkultur liknar inte de flesta av de extracellulära miljöerna i den mänskliga kroppen. I själva verket visar många studier att tredimensionella kultur återskapa vävnadsspecifika arkitektur, mekaniska och biokemiska signaler och cell-cell kommunikation, som inte har iakttagits i konventionella tvådimensionell kultur4, 5,6,7,8.
En flercelliga aggregat eller sfäroid, är en av de mest lovande teknikerna för att förverkliga denna tredimensionella kultur9,10. Celler utsöndrar den extracellulär matrixen (ECM) och kan interagera med andra i sfäroid. Även om vissa andra bioengineering närmar sig11,12,13,14, såsom cell stapling, replikera framgångsrikt rumsliga komplexiteten i den mänskliga kroppen, dessa metoder har bara två eller tre typer av celler för enkel analys och fokus på bara en funktion av målorgan. Celler i spheroids utsätts däremot för olika kultur miljöer beroende på sina positioner i sfäroid på grund av heterogena leverans av näringsämnen, syre, och parakrin och autokrin signalmolekyler i sfäroid. Denna funktion av spheroids härmar delvis i vivo kultur skick och aktivera cellerna i spheroids att skapa mycket mer komplex, organiserad vävnad struktur i vitro än de odlade i stapling vävnad9, 15 , 16. om en sfäroid består av en enda typ av celler, funktionen av cellerna i sfäroid är inte enhetlig på grund av heterogena miljö i sfäroid. I de senaste åren, sfäroid kulturer får embryonala stamceller (EKSG), inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) eller vävnad boförälder stamceller att efterlikna i vivo utvecklingsmässiga sekvenser och återskapa mini-organ såsom hjärna17, lever18och njure19,20.
Trots betydande framsteg i sfäroid kultur tekniker är odla stora spheroids under lång tid fortfarande problematiskt. I en tredimensionell vävnad behöver celler vara ligger inom 150-200 µm av ett blodkärl på grund av det begränsade utbudet av syre och näringsämnen21. Vaskulär nätverk inom sfäroid är nödvändigt att sammanfatta utbyte av ämnen mellan blod och vävnader i vivo. För att uppnå detta, har andra grupper tillsammans odlade endotelceller med målet celler22,23,24 eller inducerad differentiering av pluripotenta celler in CD31-positiva celler20. De rapportera fartyget-liknande strukturerna har dock inte de öppna ändarna på lumina att leverera syre och näringsämnen till mitten av sfäroid. För att efterlikna den vaskulära rollen för att ge näring till cellerna i den tredimensionella kulturen, måste öppen och perfusable vaskulär nätverk utvecklas i sfäroid.
Under de senaste åren, vissa forskargrupper i fältet microengineering rapporterade metoder att konstruera en perfusable vaskulär nätverk, spontant bildade en mikroflödessystem enhet genom att utnyttja angiogena från cocultured fibroblast celler25 ,26. Dessa vaskulära nätverk har en liknande morfologi till motsvarigheterna i vivo och kan vara ombyggda av miljöfaktorer, vilket gör dem lämpliga för att imitera vaskulär funktioner i en sfäroid kultur. Syftet med detta protokoll är att konstruera en perfusable vaskulär nätverk i en sfäroid använder en mikroflödessystem plattform27. Mikroflödessystem enheten ändras från de tidigare rapporterade enhet25 så att en sfäroid kan införlivas. Genom att rikta angiogena utsöndringen från fibroblast celler i en sfäroid till endotelceller i mikrokanaler, angiogena groddar från den mikrokanaler anastomoseras med sfäroid och bildade en perfusable vaskulär nätverk. Denna metod tillåter en direkt leverans av ett brett spektrum av ämnen, såsom fluorescerande molekyler och mikrometer-skala pärlor i inre av en sfäroid, som ger en ram för ett långsiktigt vävnadsodling med vaskulär nätverk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. tillverkning av mikrofabricerade enhet mögel
- Designa mönster av mikrofabricerade enheten med hjälp av kommersiellt tillgängliga program (Clewin5 eller AutoCAD 2016, etc.). För Clewin5 funktion, se användarmanualen (http://manualzz.com/doc/7159150/clewin-user-s-manual).
Obs: Filen design finns i kompletterande fil 1. - Överför filen design till en micro mönster generator och ladda verktyget med en krom mask belagda med den positiv fotoresist.
- Utsätta den positiv fotoresist i området mönster med hjälp av en micro mönster generator.
- Utveckla den positiv fotoresist använder utvecklaren (Tabell av material) och skölj masken med avjoniserat vatten (DI).
- Med krom etsmedlet (Tabell för material), etch krom i det exponerade området där den positiv fotoresist togs bort. Skölj masken med DI-vatten.
- Ta bort de återstående fotoresist på masken med aceton.
Obs: Genomskinlighetsmask kan vara ett alternativ för Cr mask. - Förbered en ren kisel wafer (4 tum, P(100)) och spin rock hexamethyldisilazane (HMDS) vid 3.000 rpm för 30 s.
- Softbake HMDS för 5 min vid 120 ° C och cool rånet för 5 min i rumstemperatur.
- Spincoat den negativa fotoresist (tabell material) på 500 rpm för 10 s och 1200 rpm för 30 s.
Obs: Spin beläggning villkoret bör ge fotoresist lager med en tjocklek av ca 100 µm på rån efter photolithography. - Prebake den negativa fotoresist för 45 min vid 95 ° C och cool rånet i 60 min i rumstemperatur.
- Kontrollera UV ljusintensiteten i varje experiment och beräkna exponeringstiden för total exponering energi dos på 250 mW/cm2. Placera photomasken (steg 1.1-1.6) på rånet och utsätta dem för UV-ljus.
- Postbake den negativa fotoresist för 1 min vid 65 ° C och 5 min vid 95 ° C. Tillåta rånet svalna för 1 min i rumstemperatur.
- Utveckla negativa fotoresist lagret för 15 min i första utvecklare (Tabell för material) badet och 2 min i andra badet. Skölj rånet i första isopropanol (IPA) badet för 10 s och i andra IPA badet för 10 s.
- Hardbake den negativa fotoresist i 30 min på 200 ° C och cool rånet för 5 min i rumstemperatur.
- Mät tjockleken på den negativa fotoresist lager med en surface profiler.
- Placera rånet i exsickator ansluten till en vakuumpump och tillsätt 200 µL silan (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane). Slå på pumpen i 10 min, sedan stänga av den och hålla rånet i exsickatorn för 4 h.
2. tillverkning steg och montering av PDMS lager
- Gjutna Polydimetylsiloxan (PDMS) före polymeren (PDMS base: härdare = 10:1 (w/w)) och lufta i en vakuumkammare för 2 h.
- Bota PDMS vid 80° C i en air-ventilerad ugn över natten.
- Lossna PDMS från silicon rånet.
- Stansa hål 1A - 3B (figur 1) och sfäroid kulturen väl. Använd en 2 mm diameter punch för hål 1A - 3B, och en 1 mm diameter punch för sfäroid väl.
- Rengöra PDMS plattan och en glas täckglas (24 mm × 24 mm) med tejp, genom upprepade gånger fastnar och peeling av tejpen. Behandla sedan PDMS plattan med luft plasma för 40 s (40 mW, 50 sccm).
- Bond PDMS plattan på glas cover slip att utvisa eventuella luftbubblor från ytan mellan PDMS plattan och täckglas och botemedel vid 80 ° C i minst 12 h.
3. sfäroid förberedelse
Obs: I studien, röd fluorescerande protein att uttrycka mänskliga umbilical ven endotelceller (RFP-HUVECs) och grönt fluorescerande protein uttrycker HUVECs (GFP-HUVECs) används i sfäroid och mikrokanaler, respektive att skilja ursprung HUVECs efter byggandet av en perfusable vaskulär nätverk. Om ursprunget till HUVECs inte behövs, är omärkt HUVECs nog för experimentet.
- Tina den RFP-HUVECs (3,0 × 105 celler/injektionsflaska) och mänsklig lunga fibroblast (hLF) (1,0 × 106 celler/injektionsflaska) och Lägg dem i 10 mL medium för endotelceller och fibroblast celler, respektive (Tabell för material). Kultur dem i en 100 mm maträtt på 37 ° C och 5% CO2 för 2-3 dagar för sub konfluenta RFP-HUVECs och hLFs. Denna förberedelse kommer att ge ~ 200 spheroids.
- Lossa den RFP-HUVECs och hLFs från rätter med 2 mL 0,05% trypsin-EDTA och stoppa trypsin reaktionen med 4 mL av DMEM innehållande 10% (v/v) fetalt bovint serum (FBS) och 1% (v/v) penicillin/streptomycin.
- Efter centrifugering vid 220 x g i 3 min, avlägsna supernatanten och återsuspendera den RFP-HUVECs och hLFs i endotel medellång till sista cellen koncentrationer på 2,5 × 104 och 1,0 × 105 celler/mL, respektive.
- Försiktigt lägga 200 µL cellsuspension (5.000 för RFP-HUVECs) och 20 000 celler för hLFs per brunn i en plattan med 96 brunnar med ultralåg bindande yta.
- Inkubera i plattan med 96 brunnar vid 37 ° C och 5% CO2 för en period av 2-4 dagar.
Obs: Eftersom sfäroid diameter beroende på kultur period och inledande cell nummer i plattan med 96 brunnar, det kan styras av dessa två parametrar.
4. cell sådd i ultrakalla enheten
Obs: Namngivningskonventionen för hålen, kanaler och sfäroid väl demonstreras i figur 1. Vi definierar dag 0 som den dagen när cellen skörd i ultrakalla enheten är klar. Schematisk bild av den experimentella tidslinjer visas i figur 2.
- Dag −1) sfäroid lastning
Obs: Följande steg bör utföras på is för att förhindra gelation av kollagen och fibrin.- Lös upp fibrinogen i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för en slutlig koncentration på 2,80 mg/mL.
- Förbereda neutraliserat kollagen (3,0 mg/mL i PBS) enligt tillverkarens protokollet.
- Kombinera 107,2 µL fibrinogen lösning (2,80 mg/mL), 8,0 µL av neutraliserat kollagen (3,0 mg/mL) och 3,6 µL av aprotinin (5 U/mL) per reaktion i ett rör. Denna lösning är märkt ”master mix lösning” (MS).
Obs: Volymen är tillräckligt för lastning en sfäroid. Om det finns mer än en sfäroid, multiplicera varje volym med antalet spheroids. - Lös upp trombin i PBS för en slutlig koncentration på 50 U/mL.
Obs: Alikvoter av 50 U/mL trombin (20 µL/tub) lagras på −30 ° C och är Tinas före varje experiment. - Placera den plattan med 96 brunnar innehållande spheroids inuti biosäkerhet skåp.
- Förbered två 35 mm petriskålar inuti biosäkerhet skåp, med en maträtt på is (maträtt 1) och andra skålen på bänkmonterade (maträtt 2). Pipettera 99 µL av MS i mitten av skålen 1 (figur 3a) för att bilda en droplet-fil.
- Trim tips av 2 gul (10-100 µL) och 3 rensa pipettspetsar (1-100 µL) för insamling av spheroids från den plattan med 96 brunnar, blandning av trombin med MS, exakt samling av spheroids, injicera spheroids i enheten, och injicera media i enheten , respektive. Porstorlek av spetsen bör vara något större än diametern på hålen 1A - 3B i kanal 1 och 3 eller sfäroid väl i kanal 2 för bästa passform.
Obs: Nedan, såvida inte annat anges, Använd pipetten tips skära i det här steget. Fotografiet av skurna tips finns i figur 4. - Samla en sfäroid med 100 µL av medium från plattan med 96 brunnar och lägga till den i skålen 2 (figur 3a).
- Plocka upp sfäroid med minimivolym av media från skålen 2. Medan du håller den vi rekommenderar upprätt, bör sfäroid flytta mot botten av Pipettera spetsen av gravitationen. Mata ut sfäroid genom att vidröra Pipettera spetsen på menisken av MS droplet-programmet i skålen 1 (figur 3a).
Obs: Följande steg 4.1.10 & 4.1.11 bör utföras snabbt. - Tillsätt 1 µL av trombin (50 U/mL) och blanda försiktigt med gula Pipettera spetsen.
- Med pipetten ange till 7 µL, plocka upp sfäroid och långsamt träs in sfäroid brunnen (figur 3b).
- Inkubera i 15 minuter vid 37 ° C för gelation av fibrin.
- Injicera långsamt det endothelial mediet från hål 1A och 3A och fyll kanaler 1 och 3 med media (20 ~ 30 µL/kanal).
- Placera enheten i ett 100 mm skålen med en våt Kimwipe att förhindra avdunstning av media från enheten (figur 3 c).
- Placera enheten vid 37 ° C och 5% CO2 för 24 h ta bort bubblorna i gränssnittet mellan media och fibrin.
- Dag 0) HUVECs lastning
- Tina GFP-HUVECs (3,0 x 105 celler/injektionsflaska) och lägga till dem i 10 mL av endothelial medium. Kultur dem i en 100 mm maträtt på 37 ° C och 5% CO2 för 2-3 dagar att nå sub-konfluens. En maträtt av sub konfluenta GFP-HUVECs är tillräckligt för att förbereda 8-10 enheter.
- Lossa GFP-HUVECs från rätter med 2 mL 0,05% trypsin-EDTA och stoppa trypsin reaktionen med 4 mL av DMEM innehållande 10% (v/v) fetalt bovint serum (FBS) och 1% (v/v) penicillin/streptomycin.
- Efter centrifugering vid 220 x g i 3 min, blandas i GFP-HUVECs endothelial medium på 5,0 x 106 celler/mL.
- Injicera HUVECs cellsuspension i kanal 1 genom hålet 1B (20 µL/kanal).
- Luta enheten mikroflödessystem 90°, placera den på sidan och inkubera vid 37 ° C i 30 min för att se till att HUVECs följer fibrin i kanal 2.
- Bekräfta att fästa HUVECs på fibrin. När antalet HUVECs fästas på gränssnittet mellan gel och medium inte är tillräcklig, kan vaskulatur kopplas vaskulär roten efter några dagar av enheten kultur (figur 5). I protokollet, andelen framgångsrika perfusionen är > 50%.
- Upprepa steg 4.2.4 och 4.2.5 för kanal 3.
- Kultur celler i en 100 mm skålen med en fuktig Kimwipe vid 37 ° C och 5% CO2 7-14 dagar.
- Dag 1 ~) Media exchange
- Byta hälften av media i kanal 1 och 3 varje dag.
5. atomkärnor färgning
- Förbered 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS.
- Ta bort mediet från kanal 1 och 3 och tillsätt 20 µL av 4% PFA per kanal. Att ersätta lösningen i 4% PFA, upprepa att ta bort lösningen från enheten och lägga till 4% PFA tre gånger.
- Inkubera enheten vid 4 ° C över natten.
- Ta bort 4% PFA från enheten och tvätta kanalerna tre gånger med PBS.
- Tillsätt 20 µL 10 µg/ml den fluorescerande färgämnen (Tabell för material) per kanal att färga cellulära atomkärnor. För att utbyta lösningen i enheten, upprepa att ta bort lösningen från enheten och lägga till 10 µg/mL den fluorescerande färgämnen tre gånger.
- Förvara inte enheten vid 4 ° C under 24 h.
6. vätska Perfusion en sfäroid
- Förbereda sfäroid efter odling för mer än 7 dagar i enheten vid 37 ° C och 5% CO2 för slutförandet av en kontinuerlig vaskulär väg.
- Ta bort mediet från hål 1A, 1B, 3A och 3B.
- Införa 10 µL 10 µM lösning av fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC)-dextran i PBS i hål 1A och 1B.
- Övervaka flödet av mikrokulor eller FITC färgämne under en inverterade Mikroskop.
7. kvantifiering av Sprout längd
Obs: ImageJ ver. 1,49 programvara används för alla analys av bilden i denna studie.
- Överlappa bilderna av GFP-HUVECs dagar 0, 1, 3, 5 och 7.
- Subtrahera ställning vaskulatur spetsen på dag 0 från samma position på bilder tagna på dag 1, 3, 5 och 7.
- Bestämma tillväxten av vaskulär spets från roten position (figur 6). Avståndet mellan vaskulär tip och rot definierades som sprout längd i denna studie (figur 7b).
8. kvantifiering av vaskulär vinklar
Obs: Vaskulär vinkel definierades som vinkeln bestod av vaskulär vinkel, rot och centrera av sfäroid (figur 7 c).
- Binarize fluorescerande bilderna av den coculture sfäroid innehållande RFP-HUVECs och mäta ”centroiden” position genom analysfunktion i ImageJ. I denna studie definieras uppmätta ”centroiden” ställning som centrum för sfäroid (figur 6).
- Bestämma positionen för den vaskulära tips och rötter på samma sätt i steg 7.
- Mäta de vaskulära vinklar analys funktionen i ImageJ programvara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar en design och foto av mikrofabricerade enheten. Den har tre parallella kanaler, i vilken kanal 2 innehåller sfäroid väl. Kanalerna 1 och 3 används för den HUVEC kulturen och kanal 2 är för sfäroid. Varje kanal är separerade med Trapetsformat microposts utformad för att mönstret PDMS. Microposts hindrar hydrogel i kanal 2 från att läcka in i kanalerna 1 och 3 av ytspänning och tillåta utbyte av ämnen mellan sfäroid och HUVECs i mikrokanaler28.
Figur 7a visar mitten av en mikroflödessystem enhet efter cell sådd. Ljusa fält och fluorescerande bilder tagna på dag 0 visar att fibrin gel fylld bara kanal 2 utan läckage in i kanalerna 1 och 3, och HUVECs framgångsrikt kopplade till sidoväggen av fibrin gel. Ljusa fält bilden är i fokus på de båda den inlästa sfäroid och microposts, som anger att sfäroid ordentligt fast på botten av enheten. Angiogena groddarna observeras på dag 1 och längden av groddar ökar med tiden (figur 7b). På dag 3, den längsta spira nådde sfäroid och på dag 7, de flesta av angiogena groddarna nådde sfäroid (genomsnittliga avstånd från kanaler 1 och 3 till den sfäroid < 500 µm). I bästa fall, kan efter 4 dagar i enheten kultur, flödet genom de vaskulära lumina observeras. Vaskulär vinkeln definierades som anvisningarna på vaskulär spets och centrera av sfäroid från vaskulär roten. Figur 7 c visar kvantifierade vaskulär vinkeln under 7 dagar i enheten kultur. Vaskulär vinklarna minskade ett tidsberoende sätt, som anger att angiogena groddarna migrerats mot sfäroid.
Figur 8 visar avsnittet av vaskulär nätverk där RFP-HUVECs och GFP-HUVECs har slagits ihop. RFP-HUVECs och GFP-HUVECs bildade coordinately en enda vaskulär lumen som visas av pilen huvuden, som tydligt indikerar angiogena groddar från kanal 1 och 3 anastomoseras till RFP-HUVECs i sfäroid och bildade en kontinuerlig vaskulär nätverk. För att bekräfta perfusability av vaskulära nätverket, injicerades FITC-dextran i kanal 1. FITC-dextran i kanal 1 flödade in i Byggyta vaskulär nätverk och interiör i sfäroid och slutligen nådde till kanal 3 (figur 9). Under perfusionen av FITC-dextran lösning finns det inget läckage från vaskulära nätverket i extravaskulär utrymmet. Det var tidigare visat att små molekyler injiceras i vaskulär lumen passera genom kärlväggen och reagera med cellerna i de extravaskulära regionerna. Dessutom visades permeabilitetskoefficienten för vaskulära nätverket vara nära det i vivo27. Dessa resultat innebär att det integrerade vaskulär nätverket kunde leverera näringsämnen till sfäroid och ta bort avfall produkten.
Figur 1 : Design och ett fotografi av enhetens mikroflödessystem. (a) Översikt över utformningen av mikrofabricerade enheten. Grå området anger tre mikroflödessystem kanaler avgränsade med Trapetsformat microposts. Kanal 2 har en brunn för en sfäroid kultur. Högra bilden visar den förstorade vyn i den röda rektangeln till vänster. (b) fotografi av mikrofabricerade enheten vars kanaler är fyllda med rött bläck. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Experimentell tid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Metod för att läsa in en sfäroid i enhetens mikroflödessystem. a göra en droppe MS och media med en sfäroid i två separata rätter. Överför sedan sfäroid till MS med trombin. (b) Schematisk avsnittsvy av enheten under injektion av sfäroid. Överskjutande mängd gel rinner ut genom hålen 2A och 2B. Dock stannar sfäroid på botten av enheten på grund av den fysiska inneslutningen. (c) Schematisk enheter när de är i en inkubator. Våta Kimwipe placerades i en 100 mm maträtt och två 35 mm rätter med enheten lades på Kimwipe. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Fotografier av pipettspetsar skär för cell seedning till enheten. Den vänstra vita spetsen är för hål 1A, 1B, 3A och 3C och överlåtande sfäroid en minskning av fibrin gel (steg 4.1.9, 4.1.13, 4.2.4 och 4.2.6). Den mellersta gul tipset är för insamling av sfäroid från 96-brunn (steg 4.1.7). Just vita spets är för sfäroid brunnen (steg 4.1.11). Tips före snitt visas också i fotografiet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Icke-perfusable vaskulatur. Angiogena groddar från mikrokanaler ansluta inte till öppningen mellan microposts och förlorade anslutningen mellan lumen och mikrokanaler (svarta pilar). Det orsakas av de otillräckliga HUVECs seedade i kanal 1 och 3. Röd: RFP-HUVECs i sfäroid, grön: GFP-HUVECs från mikrokanaler. Cellerna odlades i enheten i 14 dagar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Definitionen av vaskulär roten, spets och centrera av sfäroid. (a) metod för att bestämma positionen för den vaskulära rot och tips att mäta sprout längd. Efter att anpassa time-lapse fluorescerande bilderna, dras den fluorescerande bild tagen några dagar efter odling i enheten av bilden på dag 0. Vi mätte längden på groddarna efter subtraktionen av ImageJ software. (b) definitionen av centrera av sfäroid. De fluorescerande bilderna av de RFP-HUVECs är binarized och mätt vid dess centroiden av ImageJ software. Vi definierar centroiden som centrum för sfäroid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7 : Bildandet av en vaskulär nätverk i enhetens mikroflödessystem. (a) time-lapse bilder av ett centrum för en mikroflödessystem enhet efter cell sådd. Röd: RFP-HUVECs odlade i sfäroid, grön: GFP-HUVECs skördas i kanal 1 och 3. Kvantitativ analys av sprout längd (b) och vaskulär vinkel (c) (n = 42 groddar i 3 enheter, felstaplarna indikerar de standard fel (S.E.)). Sprout längden definierades som avståndet från positionen där HUVECs dag 0 till vaskulär spetsen (b, högst upp). Vinkeln (∠TRS) definierades av vaskulär roten (R), tips (T) och centrera av sfäroid (S) (c, överst). Se figur 6 för definitionen av vaskulär rot, spets och centrera av sfäroid. Dessa data erhölls med ImageJ programvara. De scheman som förklarar definitionen av sprout längd och vaskulär vinkeln ändras från Nashimoto, Y. et al. 27. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 8 : Bildandet av vaskulär lumen av HUVECs från mikrokanaler och sfäroid. (a) fluorescerande bild av översikten över provet efter 14 dagar i enheten kultur. Gula rektangeln anger x-y-position i avsnittet optiska visas i (b). (b) x-y, y-z och x-z optiska avsnitt av det konstruerade vaskulär nätverket. Vita pilar indikerar vaskulär lumen. Röd: RFP-HUVECs odlade i sfäroid, grön: GFP-HUVECs odlade i mikrokanaler, blå: cellulär atomkärnor. (a) visar ingen blå fluorescens eftersom (a) är bilden innan upptagning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9 : Perfusion en sfäroid Byggyta vaskulär nätverk. Ljusa fält a och fluorescerande (b) bilder av sfäroid efter 7 dagar i enheten kultur. (c) fluorescerande bild av den samma sfäroid efter FITC-dextran (70 kDa) lastning. Röd: RFP-HUVECs i sfäroid och kanalerna 1 och 3, grön: FITC-dextran, blå: cellulär atomkärnor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande fil 1: utformningen av enhetens mikroflödessystem. Filen är i dxf-format. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidigare rapporter visar att hLFs utsöndrar en cocktail av flera angiogena faktorer, såsom angiopoietin-1, angiogenin, hepatocyte tillväxtfaktor, omvandla tillväxt factor-α, tumör nekros faktor och vissa extracellulära matrix proteiner29, 30. Denna analys bygger på angiogena utsöndringen från hLFs i en coculture sfäroid, som är begränsningen av tekniken. Därför är det avgörande för en stabil vaskulär formation att ställa en coculture sfäroid längst ned i en brunn så att avståndet mellan den coculture sfäroid och HUVECs i kanal 1 och 3 kan förkortas. Vaskulär längden från fibroblaster var omvänt proportionell mot avståndet mellan endotelceller och fibroblaster31, så att kortare avståndet är fördelaktiga för stabil vaskulär bildandet. För att öppna ett sfäroid hål (1 mm i diameter) utan skadliga kanaler 1 och 3, var dock kanal 2 Minsta bredd 1,5 mm.
Även om sfäroid lägger sig på botten av brunnen, var vaskulär rötter ibland frånkopplad från microposts eller mikrokanaler (figur 5). I det här fallet kunde ingen reagens nå vaskulär lumen genom mikrokanaler (kanaler 1 eller 3). Även om vi inte kunde lösa detta problem helt, förmodar vi att problemet är på grund av ett otillräckligt antal HUVECs på ytan av fibrin gelen (steg 4.2.1-4.2.6). Kontrollera HUVECs stabilt bifoga sidovägg kanal 2.
Mot framgångsrika injektion av en sfäroid i brunnen, optimera mikropipett tips i steg 4.1.7 inre och yttre diameter är viktigt: 1) innerdiameter bör vara större än sfäroid. (2) de yttre dimeter bör passa till kanten av brunnen så att inget läckage av gelen uppstår längst upp i brunnen under injektionen och spetsen lätt kan tas bort efter gel injektionen. I detta protokoll (Ø1 mm en sfäroid väl) är omkring 700 µm maximal diameter för den injicerbara sfäroid. Om väl diametern är utformad större än i detta protokoll, kan större spheroids injiceras eftersom spetsen kan skäras för att ha större inre diametrar. Sfäroid diametrar kan kontrolleras enkelt genom att ändra de mobilnummer som skördats i plattan med 96 brunnar.
Detta protokoll visar för det första roman mikroflödessystem plattform att bygga ett perfusable vaskulär nätverk i en sfäroid. Även om coculture med HUVECs tillåter bildandet av fartyg-liknande strukturer i en sfäroid18,23,24, var dessa inte perfusable på grund av döda ändarna av lumina. Eftersom fibroblast celler finns i mångsidiga vävnader (ben, fettceller och cancer, etc.), genom tillsats av vissa andra inriktning celler till den coculture sfäroid, en vaskularisering av en olika slags spheroids kan förväntas, som kan härma i vivo miljö bättre än konventionella sfäroid kulturen. För att utöka tillämpningen av tekniken, skulle framtida arbete omfatta vascularization av spheroids utan tillsats av fibroblast celler. Vissa senaste verk rapport benmärg stromaceller32 och muskel celler33 kan inducera angiogenes i ultrakalla enheter. Utnyttja stromaceller eller muskel cellerna i stället för fibroblast cellerna skulle öka antalet vävnader som kan vara vaskulariserad i ultrakalla enheten. Detta protokoll ger en grundläggande plattform för vävnad vaskularisering, som är en efterlängtad teknik inom tre dimensionell kulturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av CREST JST (licensnummer JPMJCR14W4), samhället för det främjande av vetenskap (JSPS) KAKENHI (licensnummer 25600060, 16K 16386), The Center of Innovation Program från MEXT och JST, projektet inriktat på att utveckla nyckel utvärdering teknik från Japan-byrå för medicinsk forskning och utveckling, AMED, Mizuho stiftelse för främjande av vetenskaper. Mikrofabrikation stöddes av Kyoto universitet Nano teknik navet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AutoCAD 2017 | Autodesk | AutoCAD 2017 | |
| A chromium mask coated with AZP 1350. | CLEAN SURFACE TECHNOLOGY | CBL2506Bu-AZP | |
| Micro pattern generator | Heidelberg | uPG101 | |
| MF CD-26 developer | Rohm and haas electronic materials | - | Developer in protocol 1.4 |
| S-Clean | Sasaki Chemical | S-24 | Chromium etchant in protocol 1.5 |
| Aceton | Wako | 012-00343 | |
| Silicon Wafer | Canosis | SiJ-4 | |
| Spin Coater | MIKASA | 1H-D7 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Tokyo Ohka Kogyo | H0089 | |
| SU-8 3050 | MicroChem | - | Negative photoresist in protocol 1.9 |
| UV Exposure | Nanometric Technology Inc | LA310s | |
| SU-8 Developer | MicroChem | Y020100 | Developer for the negative photoresist in protocol 1.13 |
| 2-propanol | Wako | 163-04841 | |
| Surface profiler | Veeco | Veeco Dektak XT-S | |
| (Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma | 448931 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Toray | 184W/C | |
| Biopsy Punch (1.0mm) | Kai Industries | BP-10F | |
| Biopsy Punch (2.0mm) | Kai Industries | BP-20F | |
| Plasma System | Femto Science | COVANCE | |
| Cover glass | MATSUNAMI GLASS | C024241 | |
| Culture Dishes | Iwaki | 1000-035 | |
| RFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell | Angio Proteomie | cAP-0001RFP | |
| Normal Human Lung Fibroblasts | Lonza | CC-2512 | |
| Endothelial Cell Growth Medium | Lonza | CC-3162 | |
| Fibroblast Growth Media Kits | Lonza | CC-3132 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wako | 168-23191 | |
| 0.05w/v% Trypsin-0.53mmol/l EDTA• 4Na Solution with Phenol Red | Wako | 204-16935 | |
| PBS (Phosphate Buffered Salts) | Takara bio | T900 | |
| 96-well plate | Sumitomo bakelite | 631-21031 | |
| 1000ul Chip | NIPPON Genetics | FG-402 | |
| 200ul Chip | NIPPON Genetics | FG-301 | |
| 10ul Chip | NIPPON Genetics | 37650 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | Model 370 | |
| GFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell | Angio Proteomie | cAP-0001GFP | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma | A6279 | |
| Collagen I | Corning | 354236 | |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma | T4648 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H21492 | Fluorescent dye to stain nuclei in protocol 5.5 |
| Paraformaldehyde Solution | Wako | 163-25983 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | OLYMPUS | IX71 | |
| Degital CCD Camera | OLYMPUS | ORCA-R2 | |
| Confocal Laser Scanning Biological Microscope | OLYMPUS | FV1000 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | OLYMPUS | IX-83 | |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma | FD70S |
References
- Abbott, A. Cell culture: Biology's new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Abu-Absi, S. F., Friend, J. R., Hansen, L. K., Hu, W. S. Structural polarity and functional bile canaliculi in rat hepatocyte spheroids. Experimental Cell Research. 274 (1), 56-67 (2002).
- Bissell, M. J., Radisky, D. C., Rizki, A., Weaver, V. M., Petersen, O. W. The organizing principle: microenvironmental influences in the normal and malignant breast. Differentiation. 70 (9-10), 537-546 (2002).
- Liu, Y., et al. Novel role for netrins in regulating epithelial behavior during lung branching morphogenesis. Current Biology. 14 (10), 897-905 (2004).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-U147 (2009).
- Torisawa, Y. S., Shiku, H., Kasai, S., Nishizawa, M., Matsue, T. Proliferation assay on a silicon chip applicable for tumors extirpated from mammalians. International Journal of Cancer. 109 (2), 302-308 (2004).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Sutherland, R. M. Cell And Environment Interactions In Tumor Microregions - The Multicell Spheroid Model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
- Rothbauer, M., Zirath, H., Ertl, P. Recent advances in microfluidic technologies for cell-to-cell interaction studies. Lab on a Chip. , (2017).
- Matsuura, K., Utoh, R., Nagase, K., Okano, T. Cell sheet approach for tissue engineering and regenerative medicine. Journal of Controlled Release. 190, 228-239 (2014).
- Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. Organs-on-chips at the frontiers of drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 248-260 (2015).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), (2014).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373 (2013).
- Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481 (2013).
- Taguchi, A., et al. Redefining the In Vivo Origin of Metanephric Nephron Progenitors Enables Generation of Complex Kidney Structures from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Auger, F. A., Gibot, L., Lacroix, D. Annual Review of Biomedical Engineering. Yarmush, M. L. 15, 177-200 (2013).
- Inamori, M., Mizumoto, H., Kajiwara, T. An Approach for Formation of Vascularized Liver Tissue by Endothelial Cell-Covered Hepatocyte Spheroid Integration. Tissue Engineering Part A. 15 (8), 2029-2037 (2009).
- Kunz-Schughart, L. A., et al. Potential of fibroblasts to regulate the formation of three-dimensional vessel-like structures from endothelial cells in vitro. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 290 (5), C1385-C1398 (2006).
- Rouwkema, J., De Boer, J., Van Blitterswijk, C. A. Endothelial cells assemble into a 3-dimensional prevascular network in a bone tissue engineering construct. Tissue Engineering. 12 (9), 2685-2693 (2006).
- Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab on a Chip. 13 (8), 1489-1500 (2013).
- Moya, M. L., Hsu, Y. H., Lee, A. P., Hughes, C. C. W., George, S. C. In Vitro Perfused Human Capillary Networks. Tissue Engineering Part C-Methods. 19 (9), 730-737 (2013).
- Nashimoto, Y., et al. Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device. Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).
- Huang, C. P., et al. Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures. Lab on a Chip. 9 (12), 1740-1748 (2009).
- Newman, A. C., et al. Analysis of Stromal Cell Secretomes Reveals a Critical Role for Stromal Cell-Derived Hepatocyte Growth Factor and Fibronectin in Angiogenesis. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (3), 513 (2013).
- Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. W. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation. Molecular Biology of the Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
- Griffith, C. K., et al. Diffusion limits of an in vitro thick prevascularized tissue. Tissue Engineering. 11 (1-2), 257-266 (2005).
- Zheng, Y., et al. Angiogenesis in Liquid Tumors: An In Vitro Assay for Leukemic-Cell-Induced Bone Marrow Angiogenesis. Advanced Healthcare Materials. 5 (9), 1014-1024 (2016).
- Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Crosstalk between developing vasculature and optogenetically engineered skeletal muscle improves muscle contraction and angiogenesis. Biomaterials. 156, 65-76 (2018).
