Summary
Het protocol wordt beschreven hoe een perfusable vasculaire netwerk in een sferoïde ingenieur. Van de sferoïde omliggende communicatie is bedacht om te induceren angiogenese en de sferoïde verbinden met de microchannels in een microfluidic apparaat. De methode staat de perfusie van het sferoïde, die een langverwachte techniek in driedimensionale culturen is.
Abstract
Een sferoïde (een meercellig aggregaat) wordt beschouwd als een goed model voor levende weefsels in het menselijk lichaam. Ondanks de aanzienlijke vooruitgang in de sferoïde culturen blijft een perfusable vasculaire netwerk in de spheroïden een essentiële uitdaging voor langetermijnkweek moeten handhaven en ontwikkelen van hun functies, zoals eiwit expressies en voedselproductie. Het protocol presenteert een nieuwe methode om het integreren van een perfusable vasculaire netwerk binnen de sferoïde in een microfluidic apparaat. Om een perfusable vasculaire netwerk in de sferoïde, werden naar de sferoïde angiogenic spruiten verbonden met microchannels geleid door gebruik te maken van angiogenic factoren van menselijke longen fibroblasten gekweekt in de sferoïde. De angiogenic spruiten bereikt de sferoïde, samengevoegd met de endotheliale cellen samen gekweekt in de sferoïde, en vormden een continue vasculaire netwerk. De vasculaire netwerk kan perfuse het interieur van de sferoïde zonder lekkages. Het geconstrueerde vasculaire netwerk kan verder worden gebruikt als een route voor de toevoer van voedingsstoffen en verwijdering van afvalstoffen, het nabootsen van bloed omloop in vivo. De methode biedt een nieuw platform in sferoïde cultuur naar betere recapitulatie van levende weefsels.
Introduction
Verschuiven van een enkelgelaagde (tweedimensionaal) cultuur naar een driedimensionale cultuur is ingegeven door de noodzaak om te werken met cultuur-modellen die na te de cellulaire functies van levende bootsen weefsels1,2,3. Vlakke en harde kunststof ondergronden gebruikte in celkweek lijken niet allermeest naar de extracellulaire omgeving in het menselijk lichaam. In feite, veel studies tonen aan dat driedimensionale cultuur opnieuw weefsel-specifieke architectuur, mechanische en biochemische signalen en cel-cel communicatie, die niet in conventionele tweedimensionale cultuur4waargenomen zijn, 5,6,7,8.
Een meercellig aggregaat of sferoïde, is een van de meest veelbelovende technieken om te beseffen dit driedimensionale cultuur9,10. Cellen afscheiden van de extracellulaire matrix (ECM) en in de sferoïde met anderen kunnen communiceren. Hoewel sommige andere bioengineering benaderingen11,12,13,14, zoals cel stapelen, met succes het repliceren van ruimtelijke complexiteit van het menselijk lichaam, deze benaderingen hebben slechts twee of drie soorten cellen voor het gemak van de analyse en gericht op slechts één functie van de doelorganen. In tegenstelling, worden cellen in de spheroïden blootgesteld aan verschillende cultuur omgevingen afhankelijk van hun posities in de sferoïde vanwege de heterogene levering van voedingsstoffen, zuurstof, en paracrine en autocrine moleculen in de sferoïde signalering. Deze functie van spheroïden bootst gedeeltelijk in vivo cultuur voorwaarde, zodat de structuur van de cellen in de spheroïden maken veel complexer, georganiseerde weefsel in vitro dan die gekweekt in de stapelvolgorde weefsel9, 15 , 16. als een sferoïde uit een enkele soort cellen bestaat, de functie van de cellen in de sferoïde is niet uniform vanwege de heterogene omgeving in de sferoïde. In de afgelopen jaren, sferoïde culturen toegestaan embryonale stamcellen (SER's), geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) of weefsel-ingezeten stamcellen te bootsen in vivo developmental sequenties en opnieuw mini-organen zoals de hersenen17, lever18en nier19,20.
Ondanks aanzienlijke vooruitgang in sferoïde cultuur technieken, het kweken van grote spheroïden voor een lange tijd is nog steeds problematisch. In een drie-dimensionale weefsel moeten cellen bevinden binnen 150-200 µm van een bloedvat vanwege het beperkte aanbod van zuurstof en voedingsstoffen21. Vasculaire netwerken binnen de sferoïde zijn nodig om de uitwisseling van stoffen tussen het bloed en de weefsels in vivorecapituleren. Om dit te bereiken, hebben de andere fracties mede gekweekte endotheliale cellen met target cellen22,23,24 en veroorzaakte de differentiatie van pluripotente cellen in CD31-positieve cellen20. De gerapporteerde vaartuig-achtige structuren hoeft echter niet de open uiteinden van de lumina zuurstof en voedingsstoffen naar het midden van de sferoïde te verstrekken. Om na te bootsen de vasculaire functie voeden cellen in de driedimensionale cultuur, moet open en perfusable vasculaire netwerk worden ontwikkeld in de sferoïde.
Tijdens de afgelopen jaren gemeld sommige onderzoeksgroepen op het gebied van microengineering methoden voor de bouw van een perfusable vasculaire netwerk, spontaan gevormd in een microfluidic-apparaat met behulp van angiogenic factoren uit cocultured fibroblast cellen25 ,26. Deze vasculaire netwerken hebben een soortgelijke morfologie aan hun tegenhangers in vivo en kunnen worden vernieuwd door milieufactoren, waardoor ze geschikt voor het nabootsen van vasculaire functies in een sferoïde cultuur. Het doel van dit protocol is voor de bouw van een perfusable vasculaire netwerk in een sferoïde met behulp van een microfluidic platform27. Het microfluidic-apparaat is uit de eerder gemelde apparaat25 gewijzigd, zodat een sferoïde kan worden opgenomen. Door de leiding van de secretie van de angiogenic van de cellen van de fibroblast in een sferoïde naar endotheliale cellen in microchannels, angiogenic spruiten van de microchannels anastomosed met de sferoïde en vormde een perfusable vasculaire netwerk. Met deze methode kunt een directe levering van een breed scala van stoffen, zoals TL moleculen en micrometer-schaal kralen in het interieur van een sferoïde, die het kader voor een lange termijn weefselkweek met vasculaire netwerken vormt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fabricage van de schimmel Microfluidic apparaat
- Ontwerpen van het patroon van het microfluidic-apparaat met behulp van commercieel verkrijgbare software (Clewin5 of AutoCAD 2016, enz.). Raadpleeg de gebruikershandleiding (http://manualzz.com/doc/7159150/clewin-user-s-manual) voor de functie van de Clewin5.
Opmerking: Het bestand ontwerp is beschikbaar in aanvullende bestand 1. - Het ontwerp-bestand overbrengen naar een micro patroon generator en laad het gereedschap met een masker van de chroom bekleed met de positieve fotoresist.
- De positieve fotoresist in het gebied van de patroon met behulp van een micro patroon generator bloot.
- Ontwikkelen van de positieve fotoresist met behulp van de ontwikkelaar (Tabel van materialen) en spoel af met gedeïoniseerd water (DI) op het masker.
- Met behulp van de chroom etchant (Tabel of Materials), etch chroom in de blootgestelde gebied waar de positieve fotoresist werd verwijderd. Spoel met DI water op het masker.
- Verwijder de resterende de fotoresist op het masker met behulp van aceton.
Opmerking: Transparantiemasker kunnen een alternatief voor het Cr-masker. - Bereiden van een schone silicium wafer (4 inch, P(100)) en spin jas hexamethyldisilazane (HMDS) bij 3000 t/min voor 30 s.
- Softbake HMDS gedurende 5 minuten op 120 ° C en cool de wafer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Spincoat de negatieve fotoresist (tabel van materialen) op 500 rpm voor 10 s en 1.200 rpm voor 30 s.
Opmerking: De spin coating voorwaarde moet opleveren de fotoresist lagen met een dikte van ongeveer 100 µm op de wafels na fotolithografie. - Prebake de negatieve fotoresist voor 45 min bij 95 ° C en de wafer gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur afkoelen.
- Controleer de intensiteit UV licht in elk experiment en berekenen de belichtingstijd voor een dosis energie totale blootstelling op 250 mW/cm2. De photomask (stap 1.1-1.6) plaats op het zegel en hen blootstellen aan het UV-licht.
- Postbake de negatieve fotoresist voor 1 min bij 65 ° C en 5 min bij 95 ° C. Laat de wafer voor 1 minuut bij kamertemperatuur afkoelen.
- De negatieve fotoresist laag gedurende 15 minuten in het eerste bad van de ontwikkelaar (Tabel van materialen) en 2 min in de tweede bad te ontwikkelen. Spoel de wafer in het eerste bad van isopropanol (IPA) voor 10 s en in het tweede bad van het IPA voor 10 s.
- Hardbake de negatieve fotoresist gedurende 30 minuten bij 200 ° C en cool de wafer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Het meten van de dikte van de laag van de negatieve fotoresist met behulp van een surface profiler.
- Plaats van de wafer in een exsiccator verbonden met een vacuümpomp en voeg 200 µL van silane (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane). Zet de pomp gedurende 10 minuten, dan uitschakelen en houden het zegel in de exsiccator voor 4 uur.
2. fabricage stappen en de assemblage van PDMS lagen
- Het Polydimethylsiloxaan (PDMS) pre polymeer gegoten (PDMS base: genezen van agent = 10:1 (w/w)) en ontgas in een vacuuemcel gedurende 2 uur.
- Uitharding PDMS bij 80° C in een lucht-vented oven's nachts.
- Het PDMS van het silicium wafer afschilferen.
- Punch de gaten 1A - 3B (Figuur 1) en de sferoïde cultuur goed. Gebruik van een 2-mm diameter punch voor gaten 1A - 3B, en een 1 mm diameter punch voor de sferoïde goed.
- Reinig de PDMS slab en een glas cover slip (24 mm × 24 mm) met plakband, door herhaaldelijk steken en peeling uit de tape. Vervolgens behandelen de PDMS slab met lucht plasma voor 40 s (40 mW, 50 sccm).
- Bond het PDMS plaat op de glazen cover slip tot uitzetting van alle luchtbellen aan het oppervlak tussen de PDMS plaat en de cover slip uitharding bij 80 ° C gedurende ten minste 12 uur.
3. sferoïde voorbereiding
Opmerking: In de studie, rode fluorescerende eiwit uiting van menselijke navelstreng ader endotheliale cellen (RFP-HUVECs) en uiten van groen fluorescent proteïne (GFP-HUVECs) HUVECs worden gebruikt in de sferoïde en microchannels, respectievelijk te onderscheiden van de oorsprong van HUVECs na de bouw van een perfusable vasculaire netwerk. Als de oorsprong van HUVECs is niet nodig, zijn labelloze HUVECs genoeg voor het experiment.
- Ontdooi de RFP-HUVECs (3.0 × 105 cellen/injectieflacon) en de menselijke longen fibroblast (hLF) (1.0 × 106 cellen/injectieflacon) en voeg ze in 10 mL medium voor endotheliale cellen en cellen van de fibroblast, respectievelijk (Tabel van materialen). Cultuur hen in een schotel van 100 mm bij 37 ° C en 5% CO2 voor 2-3 dagen voor sub confluente RFP-HUVECs en hLFs. Deze voorbereiding zal opleveren ~ 200 spheroïden.
- Scheur de RFP-HUVECs en de hLFs van de schotels met 2 mL trypsine-EDTA 0,05% en stop de reactie van de trypsine met 4 mL van DMEM met 10% (v/v) foetale runderserum (FBS) en 1% (v/v) penicilline/streptomycine.
- Na centrifugeren bij 220 x g gedurende 3 minuten, verwijder het supernatant en resuspendeer de RFP-HUVECs en hLFs in de endotheliale middellange tot de laatste cel concentraties op 2,5 × 10-4 en 1.0 × 105 cellen/mL, respectievelijk.
- Zachtjes Voeg 200 µL van de celsuspensie (5.000 cellen voor RFP-HUVECs) en de 20.000 cellen voor hLFs per putje in een 96-wells-plaat met ultra-lage bindende oppervlak.
- Incubeer de 96-wells-plaat bij 37 ° C en 5% CO2 voor een periode van 2-4 dagen.
Opmerking: Aangezien de sferoïde diameter is afhankelijk van de periode van de cultuur en het nummer van de eerste cel in de 96-wells-plaat, het kan worden gecontroleerd door deze twee parameters.
4. de cel zaaien in het Microfluidic-apparaat
Opmerking: De naamgevingsconventie voor de gaten, kanalen en de sferoïde goed worden aangetoond in Figuur 1. Dag 0 definiëren we als de dag wanneer cel oogsten in het microfluidic-apparaat is voltooid. Schematische voorstelling van de experimentele tijdlijnen is afgebeeld in Figuur 2.
- Dag −1) sferoïde laden
Opmerking: De volgende stap moet worden uitgevoerd op het ijs om te voorkomen dat gelering van collageen en fibrine.- Ontbinden fibrinogeen in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voor een eindconcentratie van 2.80 mg/mL.
- Bereiden geneutraliseerde collageen (3,0 mg/mL in PBS) volgens protocol van de fabrikant.
- Combineer 107.2 µL van fibrinogeen oplossing (2.80 mg/mL), 8.0 µL van geneutraliseerde collageen (3,0 mg/mL) en 3.6 µL van aprotinin (5 U/mL) per reactie in een buis. Deze oplossing "master mix oplossing" is geëtiketteerd (MS).
Opmerking: Het volume is genoeg voor het laden van een sferoïde. Als er meer dan één sferoïde, vermenigvuldigt u elk volume met het aantal spheroïden. - Ontbinden van trombine in PBS voor een eindconcentratie van 50 U/mL.
Opmerking: Aliquots van 50 U/mL trombine (20 µL/buis) op −30 ° C worden opgeslagen en worden ontdooid vóór elk experiment. - Plaats de 96-wells-plaat met de spheroïden binnen het biosafety kabinet.
- Twee 35-mm petrischalen binnen het biosafety kast, met een schotel op ijs (schotel 1) en de andere schotel op de benchtop (schotel 2) voor te bereiden. Pipetteer 99 µL van MS in het midden van de schotel 1 (Figuur 3a) vormen een druppel.
- Snijd de uiteinden van 2 gele (10-100 µL) en 3 duidelijke Pipetteer tips (1-100 µL) voor het verzamelen van spheroïden van de 96-wells-plaat, mengen van trombine met MS, precieze collectie van de spheroïden, injecteren van de spheroïden in het apparaat, en media injecteren in het apparaat , respectievelijk. De poriegrootte van het puntje iets groter dan de diameter van de gaten 1A - 3B van kanaal 1 en 3 moet worden of de sferoïde in kanaal 2 voor een snug goed passen.
Opmerking: Hierna, tenzij anders vermeld, gebruik de pipet tips gesneden in deze stap. De foto van gesneden tips vindt u in Figuur 4. - Verzamel een sferoïde met 100 µL van medium van de 96-wells-plaat en toe te voegen aan de schotel 2 (Figuur 3a).
- De sferoïde met minimale volume van media van schotel 2 halen. Houd de pipet rechtop en moet de sferoïde verplaatsen naar de onderkant van de pipet tip door de zwaartekracht. Verwijder de sferoïde door het aanraken van het uiteinde van de pipet op de meniscus van de MS-droplet in schotel 1 (Figuur 3a).
Opmerking: De volgende stappen 4.1.10 & 4.1.11 moeten snel worden uitgevoerd. - Voeg 1 µL van trombine (50 U/mL) en meng zachtjes met de gele Pipetteer tip.
- Met het pipet ingesteld op 7 µL, halen de sferoïde en leg deze langzaam in de sferoïde put (Figuur 3b).
- Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C gedurende de gelering van fibrine.
- Langzaam het injecteren van het endotheel medium uit gaten 1A en 3A en opvulling kanalen 1 en 3 met media (20 ~ 30 µL/kanaal).
- Plaats het apparaat in een schotel van 100 mm met een natte Kimwipe ter voorkoming van verdamping van de media van het apparaat (afbeelding 3 c).
- Plaats het apparaat op 37 ° C en 5% CO2 gedurende 24 uur te verwijderen van de bubbels op het raakvlak tussen de media en fibrine.
- Dag 0) HUVECs laden
- Ontdooi GFP-HUVECs (3.0 x 105 cellen/injectieflacon) en voeg ze toe aan 10 mL van het endotheel medium. Cultuur hen in een schotel van 100 mm bij 37 ° C en 5% CO2 voor 2-3 dagen te sub-confluentie bereiken. Een schotel van sub confluente GFP-HUVECs is genoeg voor het voorbereiden van 8-10 apparaten.
- GFP-HUVECs van de schotels met 2 mL trypsine-EDTA 0,05% los en stop de reactie van de trypsine met 4 mL van DMEM met 10% (v/v) foetale runderserum (FBS) en 1% (v/v) penicilline/streptomycine.
- Na centrifugeren bij 220 x g gedurende 3 min, resuspendeer de GFP-HUVECs in het endotheel medium op 5.0 x 106 cellen/mL.
- HUVECs celsuspensie injecteren kanaal 1 door gat 1B (20 µL/kanaal).
- Het microfluidic apparaat 90° kantelen, plaats het aan de kant en Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten om ervoor te zorgen dat de HUVECs zich aan de fibrine in kanaal 2 houden.
- Bevestigen van de gehechtheid van de HUVECs op de fibrine. Wanneer het aantal HUVECs die zijn aangesloten op het raakvlak tussen de gel en medium niet voldoende is, kan de therapieën de vasculaire oorzaak worden verbroken na een paar dagen van apparaat cultuur (Figuur 5). In het protocol, is het slagingspercentage van de perfusie > 50%.
- Herhaal stap 4.2.4 en 4.2.5 voor kanaal 3.
- De cellen van de cultuur in een schotel van 100 mm met een vochtige Kimwipe bij 37 ° C en 5% CO2 7-14 dagen.
- Dag 1 ~) Media exchange
- Wisselen de helft van de media in de kanalen 1 en 3 elke dag.
5. kernen kleuring
- Bereiden van 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS.
- Verwijder het medium van kanaal 1 en 3 en Voeg 20 µL van 4% PFA per kanaal. Ter vervanging van de oplossing in 4% PFA, herhaal het verwijderen van de oplossing van het apparaat en het toevoegen van 4% PFA drie keer.
- Incubeer het apparaat bij 4 ° C's nachts.
- Verwijderen van 4% PFA van het apparaat en wassen de kanalen drie keer met PBS.
- Voeg 20 µL van 10 µg/mL de fluorescente kleurstof (Tabel of Materials) per kanaal om vlek cellulaire kernen. Om te wisselen van de oplossing in het apparaat, herhaal de oplossing uit het apparaat verwijderen en het toevoegen van 10 µg/mL de fluorescente kleurstof driemaal.
- Bewaar het apparaat bij 4 ° C gedurende 24 uur.
6. vloeistof perfusie van een sferoïde
- Bereid de sferoïde na het kweken van meer dan 7 dagen in het apparaat bij 37 ° C en 5% CO2 voor de voltooiing van een continu vasculaire traject.
- Verwijder het medium van de gaten 1A, 1B, 3A en 3B.
- Invoering 10 µL van 10 µM oplossing van fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-dextran in PBS in gaten 1A en 1B.
- Toezicht op het verloop van microbeads of FITC kleurstof onder een omgekeerde Microscoop.
7. kwantificering van Sprout lengte
Opmerking: ImageJ ver. 1,49 software wordt gebruikt voor alle analyse van het beeld in deze studie.
- Overlappen de beelden van GFP-HUVECs dagen 0, 1, 3, 5 en 7.
- Aftrekken van de positie van de therapieën tip van dag 0 van dezelfde positie op de foto's genomen op de dagen 1, 3, 5 en 7.
- Het bepalen van de groei van de vasculaire tip van de wortel positie (Figuur 6). De afstand tussen de vasculaire uiteinde en wortel werd gedefinieerd als de lengte van de stronk in deze studie (figuur 7b).
8. kwantificering van vasculaire hoeken
Opmerking: Vasculaire hoek werd gedefinieerd als de hoek bestond door vasculaire hoek, wortel en het centrum van de sferoïde (Figuur 7 c).
- De fluorescerende beelden van de coculture sferoïde RFP-HUVECs met binarize en meten "zwaartepunt" positie door analyse functie in ImageJ. In deze studie wordt de positie gemeten "zwaartepunt" gedefinieerd als het midden van de sferoïde (Figuur 6).
- Bepaal de positie van de vasculaire tips en wortels in stap 7 op dezelfde manier.
- Het meten van de vasculaire hoeken met analyse functie in ImageJ software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont een ontwerp en de foto van het microfluidic-apparaat. Het heeft drie parallelle kanalen, in welk kanaal 2 de sferoïde goed bevat. Kanalen 1 en 3 worden gebruikt voor de HUVEC-cultuur en kanaal 2 is voor de sferoïde. Elk kanaal is gescheiden door een trapeziumvormig microposts ontworpen naar het patroon PDMS. De microposts verhinderen de hydrogel in kanaal 2 van lekken in kanalen 1 en 3 door oppervlaktespanning en uitwisseling van stoffen tussen de sferoïde en HUVECs in microchannels28.
Figuur 7a toont het midden van een microfluidic apparaat na het zaaien van de cel. Helder weergegeven fluorescerende opnamen op dag 0 in veld en dat fibrine gel gevuld alleen kanaal 2 zonder lekkages in kanalen 1 en 3, en HUVECs met succes gekoppeld aan de zijkant van de gel van fibrine. Het beeld helder veld is in focus op de beide de geladen sferoïde en microposts, die aangeeft dat de sferoïde goed geregeld aan de onderkant van het apparaat. De angiogenic spruiten zijn waargenomen op dag 1 en de lengte van de verhogingen van de spruiten met tijd (figuur 7b). Op dag 3, het langste sprout bereikt de sferoïde en op dag 7, allermeest naar de angiogenic spruiten de sferoïde (gemiddelde afstand van de kanalen 1 en 3 tot de sferoïde < 500 µm). In het beste geval, kan na 4 dagen in apparaat cultuur, stroom door de vasculaire lumen worden waargenomen. De vasculaire hoek werd gedefinieerd als de richtingen van de vasculaire tip en het centrum van de sferoïde uit de vasculaire wortel. Figuur 7 c toont de gekwantificeerde vasculaire hoek gedurende 7 dagen in de cultuur van het apparaat. De vasculaire hoeken daalde in een tijd-afhankelijke manier, die aangeeft dat de angiogenic spruiten gemigreerd naar de sferoïde.
Figuur 8 toont u de sectie van de vasculaire netwerk waar RFP-HUVECs en GFP-HUVECs hebt samengevoegd. RFP-HUVECs en GFP-HUVECs vormden betekenisdragers een enkele vasculaire lumen zoals aangegeven door de pijl hoofden, die duidelijk aangeven angiogenic spruiten uit kanalen 1 en 3 anastomosed om RFP-HUVECs in de sferoïde en vormden een voortdurende vasculaire netwerk. Controleer de perfusability van de vasculaire netwerk, werd FITC-dextran geïnjecteerd in kanaal 1. FITC-dextran in kanaal 1 stroomde in de geconstrueerde vasculaire netwerk en het interieur van de sferoïde en eindelijk op kanaal 3 (Figuur 9). Tijdens de perfusie van FITC-dextran oplossing is er geen lekkage van de vasculaire netwerk in de extravascular ruimte. Het werd eerder aangetoond dat kleine moleculen geïnjecteerd in de vasculaire lumen de vasculaire muur passeren en met de cellen in de extravascular regio's reageren. Bovendien bleek de coëfficiënt van de permeabiliteit van de vasculaire netwerk dicht bij dat in vivo27. Deze resultaten impliceren dat het geïntegreerde vasculaire netwerk kan de voedingsstoffen naar de sferoïde te verstrekken en het afvalproduct verwijderen.
Figuur 1 : Ontwerp en een foto van het apparaat microfluidic. (a) overzicht van het ontwerp van het microfluidic-apparaat. Grijze gebied geeft drie microfluidic kanalen gescheiden door trapeziumvormige microposts. Kanaal 2 heeft een goed voor een sferoïde cultuur. Juiste figuur toont de uitgebreide weergave in de rode rechthoek aan de linkerkant. (b) foto van het microfluidic apparaat waarvan kanalen zijn gevuld met rode inkt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Experimental tijd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Methode voor het laden van een sferoïde in het apparaat microfluidic. (a) het maken van een drop van MS en media met een sferoïde in twee aparte gerechten. Pipetteer vervolgens met behulp van trombine de sferoïde in MS. (b) Schematische aanzicht van het apparaat tijdens de injectie van de sferoïde. Overtollige hoeveelheid gel stroomt uit door de gaten 2A en 2B. Echter blijft de sferoïde aan de onderkant van het apparaat als gevolg van de fysieke opsluiting. (c) Schematische voorstelling van de apparaten wanneer ze in een broedmachine. Natte Kimwipe werd geplaatst in een schotel van 100 mm en twee 35-mm gerechten met het apparaat werden gezet op de Kimwipe. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : De foto's van Pipetteer tips gesneden voor cel naar het apparaat zaaien. De linker witte tip is voor gaten 1A, 1B, 3 bis en 3C en inbrengende sferoïde op een daling van fibrine gel (stappen 4.1.13, 4.2.4, 4.1.9 en 4.2.6). De middelste gele tip is voor het verzamelen van de sferoïde van 96-Wells (stap 4.1.7). De juiste witte tip is voor de sferoïde put (stap 4.1.11). De tips voor knippen worden ook getoond in de foto. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Niet-perfusable therapieën. Angiogenic spruiten van microchannels heeft geen verbinding met de opening tussen microposts en verloor de verbinding tussen de lumen en microchannels (zwarte pijlen). Het wordt veroorzaakt door het onvoldoende HUVECs zaadjes in de kanalen 1 en 3. Rood: RFP-HUVECs in de sferoïde, groen: GFP-HUVECs van microchannels. De cellen werden gekweekt in het apparaat gedurende 14 dagen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 : Definitie van de vasculaire wortel, tip en het centrum van de sferoïde. (a) de methode voor het bepalen van de positie van de vasculaire wortel en tip voor het meten van de lengte van de stronk. Na aanpassing van de time-lapse fluorescerende beelden, wordt de fluorescerende foto genomen van een paar dagen na het kweken in het apparaat afgetrokken door het beeld op dag 0. We afgemeten aan de lengte van de spruiten na het aftrekken ImageJ software. (b) de definitie van het midden van de sferoïde. De fluorescerende beelden van de RFP-HUVECs zijn binarized en gemeten op haar centroid door ImageJ software. We definiëren de centroid als het midden van de sferoïde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7 : Vorming van een vasculaire netwerk in het apparaat microfluidic. (a) time-lapse beelden van een centrum van een microfluidic apparaat na het zaaien van de cel. Rood: RFP-HUVECs gekweekt in de sferoïde, groen: GFP-HUVECs geoogst in kanalen 1 en 3. Kwantitatieve analyse van de stronk lengte (b) en vasculaire hoek (c) (n = 42 spruiten in 3 apparaten, de foutbalken geven de standaardfouten (S.E.)). De lengte van de stronk werd gedefinieerd als de afstand van de positie van de HUVECs op dag 0 naar de vasculaire tip (b, terug naar boven). De hoek (∠TRS) werd gedefinieerd door de vasculaire wortel (R), uiteinde (T) en het centrum van de sferoïde (S) (c, boven). Zie afbeelding 6 voor de definitie van vasculaire wortel, tip en het centrum van de sferoïde. Deze gegevens zijn verkregen met behulp van ImageJ software. De schema's uit te leggen van de definitie van de lengte van de stronk en de vasculaire hoek zijn van Nashimoto, Y. et al. gewijzigd 27. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 8 : Vorming van vasculaire lumen door HUVECs van microchannels en de sferoïde. (a) TL afbeelding van het overzicht van het monster na 14 dagen in apparaat cultuur. Gele rechthoek geeft de x-en y-positie van de optische sectie weergegeven in (b). (b) x-y, y-z en x-z optische sectie van het geconstrueerde vasculaire netwerk. Witte pijlen geven aan vasculaire lumen. Rood: RFP-HUVECs gekweekt in de sferoïde, groen: GFP-HUVECs gekweekt in de microchannels, blauwe: cellulaire kernen. (a) toont geen blauwe fluorescentie omdat (a) het beeld voor de fixatie is. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 9 : Perfusie van een sferoïde met behulp van een geconstrueerde vasculaire netwerk. Helder veld a en TL (b) beelden van de sferoïde na 7 dagen in de cultuur van het apparaat. (c) TL beeld van de dezelfde sferoïde na FITC-dextran (70 kDa) laden. Rood: RFP-HUVECs in de sferoïde en kanalen 1 en 3, groen: FITC-dextran, blauw: cellulaire kernen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende bestand 1: het ontwerp van het apparaat microfluidic. Het bestand bevindt zich in de dxf-indeling. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eerdere verslagen blijkt dat hLFs een cocktail van meerdere angiogenic factoren, zoals de angiopoietin-1, de angiogenin, de hepatocyte groeifactor afscheiden, transformeren groeifactor-α, tumor necrose factor en sommige extracellulaire matrix eiwitten29, 30. Deze bepaling is afhankelijk van de secretie van de angiogenic van hLFs in een sferoïde coculture, dat de beperking van de techniek is. Het is daarom essentieel voor een stabiele vasculaire formatie een sferoïde coculture instellen op de bodem van een put zodat de afstand tussen de sferoïde coculture en de HUVECs in de kanalen 1 en 3 kan worden verkort. De lengte van de vasculaire vanaf fibroblasten was omgekeerd evenredig met de afstand tussen de endotheliale cellen en fibroblasten31, zodat de kortere afstand gunstig voor stabiele vasculaire vorming is. Echter, als u wilt openen een sferoïde gat (1 mm diameter) zonder schadelijke kanalen 1 en 3, de minimale breedte van kanaal 2 was 1,5 mm.
Hoewel de sferoïde vestigt zich op de bodem van de put, waren vasculaire wortels af en toe losgekoppeld van de microposts of microchannels (Figuur 5). In dit geval kon geen reagens bereiken de vasculaire lumen via microchannels (kanalen 1 of 3). Hoewel we dit probleem niet volledig oplossen kunnen, wij gaan ervan uit dat het probleem te wijten aan het ontoereikende aantal HUVECs aan het oppervlak van het fibrine-gel (4.2.1-4.2.6 stap is). Zorg ervoor dat de HUVECs stabiel hechten de zijwand van kanaal 2.
Richting van de succesvolle injectie van een sferoïde in de put, het optimaliseren van de binnenste en buitenste diameter van micropipet tips in stap 4.1.7 is belangrijk: 1) de inwendige diameter groter moet zijn dan die van de sferoïde. 2) de buitenste dimeter moet passen aan de rand van de put zodat geen lekkage van de gel bij de bovenkant van de put tijdens de injectie gebeurt en de tip kan gemakkelijk worden verwijderd na de injectie gel. In dit protocol (φ1 mm van een sferoïde goed) is ongeveer 700 µm de maximale diameter voor de injecteerbare sferoïde. Als de goed diameter groter is dan die in dit protocol is ontworpen, kunnen grotere spheroïden kunnen worden geïnjecteerd omdat het tip kan worden gesneden om te hebben grotere innerlijke diameters. Sferoïde diameters kunnen gemakkelijk worden beheerd door het veranderen van het aantal van de cellen geoogst in de 96-wells-plaat.
Dit protocol geeft ten eerste roman microfluidic platform voor de bouw van een perfusable vasculaire netwerk in een sferoïde. Hoewel de coculture met HUVECs kan de vorming van schip-achtige structuren in een sferoïde18,23,24, waren deze niet perfusable als gevolg van de dode uiteinden van de lumina. Omdat fibroblast cellen bestaan in veelzijdige weefsels (bot, adipocyte en kanker, enz.), door de toevoeging van sommige andere targeting cellen aan de coculture sferoïde, een vascularisatie van een verschillende soort spheroïden kan worden verwacht, die de kan nabootsen vivo milieu beter dan de conventionele sferoïde cultuur. Uit te breiden van de toepassing van de techniek, zou de toekomstige werkzaamheden omvatten de vascularisatie van spheroïden zonder de toevoeging van cellen van de fibroblast. Sommige recente werken verslag beenmerg stromale cellen32 en spier cellen33 kan veroorzaken angiogenese in de microfluidic-apparaten. Met behulp van de stromale of spier cellen in plaats van de cellen van de fibroblast zou verhogen het aantal weefsels die kunnen worden vascularized in het microfluidic-apparaat. Dit protocol voorziet een fundamentele platform weefsel vascularisatie, die is een langverwachte techniek op het gebied van drie dimensionale culturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteur verklaart dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door CREST JST (subsidie nummer JPMJCR14W4), maatschappij voor de promotie van wetenschap (JSPS) KAKENHI (subsidie nummer 25600060, 16K 16386), het centrum van innovatie programma van MEXT en JST, Project gericht op de ontwikkeling van Key evaluatie technologie van Japan Agentschap voor medisch onderzoek en ontwikkeling, AMED, Mizuho Stichting ter bevordering van de wetenschappen. Microfabrication werd gesteund door de Kyoto Universiteit Nano technologie-Hub.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AutoCAD 2017 | Autodesk | AutoCAD 2017 | |
| A chromium mask coated with AZP 1350. | CLEAN SURFACE TECHNOLOGY | CBL2506Bu-AZP | |
| Micro pattern generator | Heidelberg | uPG101 | |
| MF CD-26 developer | Rohm and haas electronic materials | - | Developer in protocol 1.4 |
| S-Clean | Sasaki Chemical | S-24 | Chromium etchant in protocol 1.5 |
| Aceton | Wako | 012-00343 | |
| Silicon Wafer | Canosis | SiJ-4 | |
| Spin Coater | MIKASA | 1H-D7 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Tokyo Ohka Kogyo | H0089 | |
| SU-8 3050 | MicroChem | - | Negative photoresist in protocol 1.9 |
| UV Exposure | Nanometric Technology Inc | LA310s | |
| SU-8 Developer | MicroChem | Y020100 | Developer for the negative photoresist in protocol 1.13 |
| 2-propanol | Wako | 163-04841 | |
| Surface profiler | Veeco | Veeco Dektak XT-S | |
| (Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma | 448931 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Toray | 184W/C | |
| Biopsy Punch (1.0mm) | Kai Industries | BP-10F | |
| Biopsy Punch (2.0mm) | Kai Industries | BP-20F | |
| Plasma System | Femto Science | COVANCE | |
| Cover glass | MATSUNAMI GLASS | C024241 | |
| Culture Dishes | Iwaki | 1000-035 | |
| RFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell | Angio Proteomie | cAP-0001RFP | |
| Normal Human Lung Fibroblasts | Lonza | CC-2512 | |
| Endothelial Cell Growth Medium | Lonza | CC-3162 | |
| Fibroblast Growth Media Kits | Lonza | CC-3132 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wako | 168-23191 | |
| 0.05w/v% Trypsin-0.53mmol/l EDTA• 4Na Solution with Phenol Red | Wako | 204-16935 | |
| PBS (Phosphate Buffered Salts) | Takara bio | T900 | |
| 96-well plate | Sumitomo bakelite | 631-21031 | |
| 1000ul Chip | NIPPON Genetics | FG-402 | |
| 200ul Chip | NIPPON Genetics | FG-301 | |
| 10ul Chip | NIPPON Genetics | 37650 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | Model 370 | |
| GFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell | Angio Proteomie | cAP-0001GFP | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma | A6279 | |
| Collagen I | Corning | 354236 | |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma | T4648 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H21492 | Fluorescent dye to stain nuclei in protocol 5.5 |
| Paraformaldehyde Solution | Wako | 163-25983 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | OLYMPUS | IX71 | |
| Degital CCD Camera | OLYMPUS | ORCA-R2 | |
| Confocal Laser Scanning Biological Microscope | OLYMPUS | FV1000 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | OLYMPUS | IX-83 | |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma | FD70S |
References
- Abbott, A. Cell culture: Biology's new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Abu-Absi, S. F., Friend, J. R., Hansen, L. K., Hu, W. S. Structural polarity and functional bile canaliculi in rat hepatocyte spheroids. Experimental Cell Research. 274 (1), 56-67 (2002).
- Bissell, M. J., Radisky, D. C., Rizki, A., Weaver, V. M., Petersen, O. W. The organizing principle: microenvironmental influences in the normal and malignant breast. Differentiation. 70 (9-10), 537-546 (2002).
- Liu, Y., et al. Novel role for netrins in regulating epithelial behavior during lung branching morphogenesis. Current Biology. 14 (10), 897-905 (2004).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-U147 (2009).
- Torisawa, Y. S., Shiku, H., Kasai, S., Nishizawa, M., Matsue, T. Proliferation assay on a silicon chip applicable for tumors extirpated from mammalians. International Journal of Cancer. 109 (2), 302-308 (2004).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Sutherland, R. M. Cell And Environment Interactions In Tumor Microregions - The Multicell Spheroid Model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
- Rothbauer, M., Zirath, H., Ertl, P. Recent advances in microfluidic technologies for cell-to-cell interaction studies. Lab on a Chip. , (2017).
- Matsuura, K., Utoh, R., Nagase, K., Okano, T. Cell sheet approach for tissue engineering and regenerative medicine. Journal of Controlled Release. 190, 228-239 (2014).
- Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. Organs-on-chips at the frontiers of drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 248-260 (2015).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), (2014).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373 (2013).
- Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481 (2013).
- Taguchi, A., et al. Redefining the In Vivo Origin of Metanephric Nephron Progenitors Enables Generation of Complex Kidney Structures from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Auger, F. A., Gibot, L., Lacroix, D. Annual Review of Biomedical Engineering. Yarmush, M. L. 15, 177-200 (2013).
- Inamori, M., Mizumoto, H., Kajiwara, T. An Approach for Formation of Vascularized Liver Tissue by Endothelial Cell-Covered Hepatocyte Spheroid Integration. Tissue Engineering Part A. 15 (8), 2029-2037 (2009).
- Kunz-Schughart, L. A., et al. Potential of fibroblasts to regulate the formation of three-dimensional vessel-like structures from endothelial cells in vitro. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 290 (5), C1385-C1398 (2006).
- Rouwkema, J., De Boer, J., Van Blitterswijk, C. A. Endothelial cells assemble into a 3-dimensional prevascular network in a bone tissue engineering construct. Tissue Engineering. 12 (9), 2685-2693 (2006).
- Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab on a Chip. 13 (8), 1489-1500 (2013).
- Moya, M. L., Hsu, Y. H., Lee, A. P., Hughes, C. C. W., George, S. C. In Vitro Perfused Human Capillary Networks. Tissue Engineering Part C-Methods. 19 (9), 730-737 (2013).
- Nashimoto, Y., et al. Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device. Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).
- Huang, C. P., et al. Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures. Lab on a Chip. 9 (12), 1740-1748 (2009).
- Newman, A. C., et al. Analysis of Stromal Cell Secretomes Reveals a Critical Role for Stromal Cell-Derived Hepatocyte Growth Factor and Fibronectin in Angiogenesis. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (3), 513 (2013).
- Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. W. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation. Molecular Biology of the Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
- Griffith, C. K., et al. Diffusion limits of an in vitro thick prevascularized tissue. Tissue Engineering. 11 (1-2), 257-266 (2005).
- Zheng, Y., et al. Angiogenesis in Liquid Tumors: An In Vitro Assay for Leukemic-Cell-Induced Bone Marrow Angiogenesis. Advanced Healthcare Materials. 5 (9), 1014-1024 (2016).
- Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Crosstalk between developing vasculature and optogenetically engineered skeletal muscle improves muscle contraction and angiogenesis. Biomaterials. 156, 65-76 (2018).
