Summary
Qui, presentiamo un protocollo per ottenere sistemi 3D-cultura in auto-assemblanti peptide impalcature per promuovere la differenziazione dei chondrocytes articolari umani dedifferentiated in cartilagine-come il tessuto.
Abstract
Una tecnica utile per la coltura di cellule in nanofibra autoassemblanti impalcatura tridimensionale (3D) è descritto. Questo sistema di coltura ricrea un ambiente che imita molto attentamente le caratteristiche strutturali del tessuto non polarizzato. Inoltre, la struttura particolare nanofibra intrinseco dell'impalcatura rende trasparente alla luce visibile, che consente una visualizzazione semplice del campione al microscopio. Questo vantaggio è stato ampiamente utilizzato per studiare la migrazione cellulare, organizzazione, proliferazione e differenziazione e così qualsiasi sviluppo della loro particolare funzione cellulare mediante colorazione con coloranti specifici o sonde. Inoltre, in questo lavoro descriviamo la buona prestazione di questo sistema per studiare facilmente la redifferentiation di espanso chondrocytes articolari umani in tessuto cartilaginoso. Cellule erano incapsulate in auto-assemblanti peptide impalcature e coltivate in condizioni specifiche per promuovere chondrogenesis. Le colture tridimensionali hanno mostrato buona redditività durante le 4 settimane dell'esperimento. Come previsto, campioni coltivati con induttori condrogenica (rispetto ai controlli non indotta) macchiato forte positivi per il blu di toluidina (che le macchie di glicosaminoglicani (gag) che sono altamente presenti nella matrice extracellulare della cartilagine) ed espresso marcatori molecolari specifici, tra cui collagene di tipo I, II e X, secondo analisi Western Blot. Questo protocollo è facile da eseguire e può essere utilizzato in laboratori di ricerca, industrie e per scopi didattici nei corsi di laboratorio.
Introduction
Per molti decenni, coltura delle cellule dei mammiferi è stata eseguita in condizioni sperimentali, utilizzando sistemi di classica cultura bidimensionale (2D) a causa di problemi pratici ed economici indipendentemente gli aspetti non-fisiologica. Anche se questo sistema cultura aiuta a studiare e capire di più i meccanismi cellulari e molecolari, che conosciamo oggi sono necessari nuovi paradigmi di coltura delle cellule per studiare più complessi sistemi cellulari. Pertanto, sistemi tridimensionali (3D) cultura sono necessari per ricreare un microambiente che è biofisicamente, biomeccanico e biologicamente più simile a quella dei tessuti naturali. Negli ultimi anni, sistemi di coltura 3D, in generale, sono diventati più diffusi tra i ricercatori e l'industria rappresentano un nuovo modello di studio o di screening in cui le cellule possono crescere nello spazio, creare cellula--cellula o interazioni cellula-matrice, la migrazione e alla fine di differenziarsi in linee cellulari specifici.
L'obiettivo generale di questa metodologia è quello di ricreare un in vitro microambiente cellulare che è più vicino al microambiente in vivo . In particolare, lo scaffold sintetico di peptide autoassemblanti (SAPS) è un tipo di biomateriale con proprietà uniche; forma una rete di pori di dimensioni nanometriche fatto di interazioni deboli tra peptidi con proprietà meccaniche e strutturali simili quelli di matrici extracellulari naturale. In altre parole, la razionalità dietro l'uso di questo materiale è che crea un ambiente veramente 3D che è ideale per ottenere tessuti di pseudo-3D o unità di organo. Tuttavia, la cosa più importante, il contesto 3D permette di acquisire nuove funzioni biologiche che normalmente non sono presenti nelle piattaforme 2D cultura, come proprietà relazionati all'architettura dei tessuti, fenomeni di trasferimento di massa, cella patterning la struttura 3D e alla fine morfogenesi dei tessuti, che sono fattori chiave nella ricerca futura e nello sviluppo di tessuti funzionali e organi1,2. Inoltre, un vantaggio di SAPS sopra le loro controparti naturali (collagene, Matrigel) è che sono molto stabili a temperatura ambiente e non richiedono particolari condizioni di post-produzione, distribuzione o archiviazione3,4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. SAPS è facile da gestire, quando lo si desidera; 3d gel può essere ottenuta semplicemente aumentando la forza ionica o regolando il pH a neutralità1,2. Infine, la metodologia descritta qui è stato ampiamente utilizzato in vitro per promuovere la manutenzione, la crescita e la differenziazione di un certo numero di tipi di cellule, tra cui gli epatociti, cellule endoteliali, osteoblasti, condrociti, cellule neuronali pure come cellule staminali embrionali e somatiche3,4,5,6,7,8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14 , 15. nel lavoro attuale, descriviamo l'uso di un sistema 3D-cultura a differenziarsi chondrocytes articolari espanso umani (hACh) in cartilagine-come il tessuto come descritto in precedenza11.
Qui, è descritto un metodo per cellule di cultura in un sistema 3D utilizzando SAPS. In questo biomateriale sintetico, cellule prima sono mescolate con una soluzione di peptide, che è successivamente indotto di auto-assemblarsi, creando una rete di dimensioni nanometriche intorno alle cellule e quindi creare un ambiente veramente 3D (Figura 1). È importante considerare che il comportamento cellulare è interessato da valori di rigidezza di matrix (vale a dire, proliferazione, migrazione e differenziazione). Di conseguenza, un controllo metodologico comune è quello di cellule di cultura in cima l'impalcatura del peptide con gli stessi valori di rigidità (cultura su due dimensioni).
Protocol
1. auto-assemblanti Peptide impalcatura (SAPS) preparazione
- Preparare una soluzione di 0,5% di peptide RAD16-I nel saccarosio 20% (p/v), in una provetta da centrifuga micro. Sonicare la soluzione del peptide per 20 min in un bagno ad ultrasuoni a potenza massima e a temperatura ambiente (TA) per garantire la miscelazione omogenea.
Nota: Il volume della soluzione di essere preparati dipenderà il numero di incapsulamenti desiderato. RAD16-I peptidi non subiscono degradazione in queste condizioni di sonicazione. - Diluire la soluzione di peptide preparata al punto 1.1 con il volume necessario di saccarosio al 10% (p/v) per ottenere la concentrazione finale desiderata.
Nota: Un fattore importante da prendere in considerazione è la regolazione della concentrazione del peptide iniziale poiché la rigidità di matrice finale dipenderà da questo parametro. Il RAD16-io soluzione peptide dovrebbe essere più concentrato rispetto alla concentrazione finale desiderata del costrutto 3D 2x. Normalmente, il finale RAD16-ho usati le concentrazioni nel peptide sono tra 0,15 – 0,5% (p/v). - Inserire la micro-provetta contenente la soluzione del peptide in un bagno ad ultrasuoni a RT per 20 min per garantire la miscelazione omogenea.
Nota: Il peptide soluzione, se non utilizzato immediatamente, può essere conservata per diversi mesi a 4 ° C.
2. preparazione della soluzione di cella
- Centrifugare la sospensione cellulare (ottenuta dopo il trattamento di tripsina) a 60 x g e RT per 5 min.
- Rimuovere il surnatante con una pipetta di Pasteur collegata ad una linea del vuoto e sospendere il pellet cellulare in 3 – 5 mL di saccarosio al 10% (p/v) utilizzando una micropipetta. Procedere per contare le celle utilizzando un contatore di cellule manuale o automatico.
Nota: La soluzione di saccarosio al 10% (p/v) è un mezzo isotonico e non ionici che permette per la manutenzione delle cellule ed evita la gelificazione del peptide durante il processo di miscelazione. - Centrifugare la sospensione cellulare a 60 x g e RT per 5 min, rimuovere il supernatante e sospendere nuovamente il pellet cellulare nel volume necessario di saccarosio al 10% (p/v) per ottenere il doppio della concentrazione di cella finale desiderata (raccomandabile circa 4 x 106 cellule / mL).
- Inserire un numero desiderato di coltura del tessuto inserti in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti (un inserto per incapsulamento).
- Sonicare soluzione peptide preparata nel passaggio 1 alla massima potenza e RT per 5 min.
- Pipettare e posto 40 µ l della sospensione delle cellule (ottenuta in 2.3) per ogni incapsulamento desiderata più circa 10 – 15% del volume supplementare in un tubo di micro-centrifuga standard.
3. 3D Cell incapsulamento in SAPS
- Mescolare un volume uguale del RAD16-ho soluzione in saccarosio di 10% (w/v) (40 µ l per incapsulamento) con un volume uguale di sospensione delle cellule (40 µ l per incapsulamento) preparata nel passaggio 2 per ottenere una sospensione di cellule nella concentrazione del peptide desiderato (nel 10% di saccarosio). Mescolare pipettando lentamente su e giù per circa 10 volte. Evitare la formazione di bolle durante la miscelazione.
Nota: Questo passaggio è fondamentale e deve essere eseguito con molta attenzione poiché le cellule sono in condizioni ostili a causa del peptide di basso pH (circa 3.5-4.0). - Usando una micropipetta, accuratamente caricare 80 µ l della sospensione in ogni inserto.
- Aggiungere 0,5 mL di terreno di coltura per il fondo del pozzo per bagnare l'inserto della membrana, permettendo media diffusione promuovere l'auto-assemblaggio del peptide e hydrogel formazione. Lasciate che il peptide del gel per circa 20 min nell'armadietto di flusso.
Nota: La manipolazione dei campioni durante l'impostazione di tempo potrebbe finire in gel di rottura. - Molto lentamente aggiungere 40 µ l di terreno all'inserto e lasciarlo scivolare giù la parete interna al gel.
Nota: Normalmente, il caricamento di questo volume dovrebbe prendere tra 20 – 30 s. - Posizionare la piastra nell'incubatore (37 ° C, 5% CO2, atmosfera umidificata) per 20 min. Questo passaggio e aggiunte successive medie favorirà lisciviazione del saccarosio e l'equilibratura delle cellule con terreno di coltura.
- Aggiungere 60 µ l di terreno alla parete interna dell'inserto, facendolo fluire lungo la parete. Aspirare il mezzo del pozzo, che è ricco di saccarosio, e aggiungere 0,5 mL di terreno nuovo.
- Aggiungere 60 µ l di terreno lentamente all'inserto e posizionare la piastra nell'incubatore (37 ° C, 5% CO2, atmosfera umidificata) per 10 min.
- Aspirare il mezzo del pozzo e aggiungere 2,5 mL di terreno nuovo nel pozzo. Aggiungere 200 µ l di terreno nell'inserto. Posizionare la piastra nell'incubatore (37 ° C, 5% CO2, atmosfera umidificata) per mantenere le cellule in condizioni appropriate.
- Modificare il mezzo ogni giorno. Rimuovere il vecchio mezzo dal fondo del pozzo. Aggiungere 2,5 mL di terreno nuovo per il bene e 200 µ l per l'inserto.
Nota: Se continua differenziazione cellulare, la media d'induzione specifico verrà aggiunto alle culture, conseguente l'impegno di tipo cellulare desiderato (Vedi sotto, differenziazione cellulare).
4. attuabilità in 3D-SAPS
- Nota: L'analisi di attuabilità delle cellule è conosciuto come il Live/Dead — analisi di fattibilità/citotossicità pure.
- In una provetta da 15 mL, preparare il volume necessario di soluzione fresca di 2 µM calceina e 2 µM di omodimero di etidio-1 (EthD-1) in PBS nel Vortex per 10 s. tenga all'oscuro.
Nota: Il volume da utilizzare per ogni campione dipenderà il ben formato secondo quanto segue: 2 mL per ciascun pozzetto di una piastra 6-pozzetti; 1 mL per ogni bene di una piastra 12-pozzetti e 0,5 mL per ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. - Usando una micropipetta, sciacquare i campioni 3D-SAPS 3 volte con 2 mL di PBS e poi, coprire con la soluzione preparata al punto 4.1. Incubare a temperatura ambiente per 40 min al buio.
- Utilizzando una micropipetta, sciacquare i costrutti con 2 mL di PBS 5 volte.
- Visualizzare i campioni sotto un microscopio di fluorescenza usando X 10 o 20 ingrandimenti.
5. differenziamento
- Cellule di cultura (37 ° C, 5% CO2, atmosfera umidificata) in condrociti basale medio (CBM) con crescita supplementi.
Nota: La preparazione del mezzo è descritto nelle istruzioni del produttore (Vedi Materiali tavolo). - Indurre la differenziazione delle cellule al giorno 2 con condrogenica contenenti medie ricombinanti umani trasformando il fattore di crescita-b1 [TGFb1] (10 ng/mL), acido L-ascorbico 2-fosfato [AA2P] (25 µ g/mL) e desametasone (100 nM).
- Mantenere la cultura per 4 settimane in un'incubatrice con atmosfera umidificata a 37 ° C e 5% CO2. Sostituire il terreno condrogenica ogni altro giorno.
6. toluidina blu colorazione (TB)
- Lavare le culture di 3D-SAPS due volte aggiungendo e rimuovendo quindi 2 mL di PBS con una micropipetta. Correggerli aggiungendo 2 mL di 2% (p/v) p-formaldeide in PBS per 2 h a TA.
- Lavare due volte con 2 mL di 0.1% Triton X-100 in PBS (PBST).
- Incubare con 2 mL di TB 0.05% in acqua per 20 minuti a TA.
- Lavare più volte (almeno 3 volte) con 2 mL di PBS, fino a quando la soluzione di PBS rimossa è chiara.
- Analizzare i campioni mediante ispezione visiva sotto un microscopio stereoscopico11,13,14.
Nota: TB forma complessi con anionici glycoconjugates presso la matrice extracellulare, come proteoglicani (PG) e glicosaminoglicani (GAG), che sono principalmente secreto dai condrociti-come le cellule. Campioni positivi sono macchiati blu.
7. Western Blot
Nota: La procedura utilizzata in questo protocollo è stata precedentemente descritta nel riferimento11.
- Lyse 3D-costrutti in RIPA buffer contenente l'inibitore della proteasi cocktail di pipettaggio.
- Preparare il gel dell'acrilamide secondo requisiti di gel-volume (delle apparecchiature in esecuzione gel specifico) ed eseguire i lisati cellulari per 90 min a 150 V16.
Nota: Gel dell'acrilamide è solitamente preparato ad una concentrazione di 7,5 – 10% (p/v), a seconda del peso molecolare della proteina. - Trasferire le proteine contenute nel gel in una membrana di polivinilidene (PVDF) Il difluoruro applicando 40 V per 2 h a TA.
- Incubare la membrana PVDF a temperatura ambiente per 2 h in tampone bloccante (4% (p/v) di latte in polvere senza grassi in PBST) in un contenitore separato con volume sufficiente a coprire la membrana.
- Incubare la membrana a temperatura ambiente per 1 h con anticorpi primari ad una concentrazione finale di 1 mg/mL in PBST. Vedere la tabella dei materiali.
- Aggiungere gli anticorpi secondari ad una concentrazione di 1 mg/mL. Vedere la tabella dei materiali.
- Preparare la membrana per il rilevamento di hP con un substrato chemiluminescente16. Vedere la tabella dei materiali.
- Prendere immagini chemiluminescente16.
Representative Results
Nel presente lavoro, un protocollo semplice e veloce alle cellule di cultura in 3D utilizzando SAPS è descritto per ottenere dati qualitativi e quantitativi affidabili. SAPS crea un microambiente 3D con proprietà uniche che permettono alle cellule coltivate in condizioni desiderate per procedere alla manutenzione delle cellule, proliferazione e/o differenziazione3,4,5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12. nel nostro gruppo, diversi studi sono stati effettuati utilizzando cellule di tessuto adiposo umano derivato progenitrici (hAPC), espanso chondrocytes articolari umani (hACh) e fibroblasti cutanei umani normali (hNDF) alla cultura, espandere e differenziarli in cartilagine-come il tessuto10,11,12. Qui, descriviamo la cultura 3D e la re-differenziazione di hACh espansa nel tessuto della cartilagine-come, come descritto in precedenza11. Quindi, abbiamo incapsulano le cellule in 3D-SAPS e cultura li in mezzo di induzione condrogenica, come descritto in Figura 1 (e nel protocollo). Dopo 24 h, i campioni sono stati valutati per la vitalità con le analisi di fattibilità/citotossicità Live/Dead. I risultati indicano che una piccola percentuale delle cellule erano morta (rosso) dopo 5 giorni di incapsulamento e quasi nessun cellule morte sono state osservate dopo 4 settimane di cultura (Figura 2). Successivamente, li abbiamo macchiato per la deposizione di glicosaminoglicani (GAG) presso la matrice extracellulare, utilizzando il metodo di colorazione blu di toluidina. Come previsto, il gruppo di induzione ha risposto correttamente al trattamento, mostrando forte colorazione (Figura 2).
Infine, marcatori molecolari degli indicatori Condrogenesi e ipertrofia, compreso il collagene di tipo I, II e X, sono stati analizzati mediante western blot (Figura 3). Collagene di tipo che i (COL1) stavo osservato nei sistemi 2D e 3D, ma una banda inferiore di ~ 130 kDa (che rappresentano le proteine trasformate di COL1 matura per essere assemblato presso la matrice extracellulare) è stato osservato solo in 3D. Questo risultato indica chiaramente che le cellule in fase di differenziazione in tre dimensioni procedere in modo più fisiologico. Notevolmente, collagene di tipo II (COL2) è stato rilevato - come una singola banda di peso molecolare previsto presente presso la matrice extracellulare - solo in 3D costrutti coltivate in condizioni di chondrogenic. Infine, collagene di tipo X (COL10) è stato rilevato nei costrutti sia 2D che 3D, coltivate in condizioni di chondrogenic, che indica un certo grado di ipertrofia dopo 4 settimane di cultura.
Figura 1: rappresentazione schematica di incapsulamento di cellule in 3D-SAPS. Rappresentazione schematica del incapsulamento hACh è descritto per ottenere cellule dislocate casualmente all'interno di 3D-SAPS. 1. auto-assemblanti preparazione del peptide dell'impalcatura (SAPS); 2. cella preparazione della sospensione; e 3. 3D-cell incapsulamento in SAPS. Si noti che lo schema elettrico Mostra solo passaggi 3.1-3.4.
Figura 2: differenziazione condrogenica e prestazioni nelle culture di 3D-SAPS cellulare. Macchiatura di attuabilità delle cellule eseguita a 5 giorni e 4 settimane di cultura rilevato sotto un microscopio a fluorescenza (cellule vive in cellule verde e morte in rosso). Scala bar = 200 µm. impegno generale chondrogenesis valutata dal blu di toluidina colorazione (i glycosaminoglycans solfonati in blu) di 3D-SAPS costrutti coltivate nei mezzi di controllo e chondrogenic. Scala bar = 500 µm. Questa figura è stata modificata da L. Recha-Sancho et al. 11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: collagene I, II e X espressione di hACh in fase di chondrogenesis. hACh coltivate in un monostrato di 2D e 3D-SAPS dopo 4 settimane in chondrogenic media e controlli sono stati valutati per l'espressione del collagene di tipo I (COL1), collagene di tipo II (COL2) e collagene di tipo X (COL10). Espressione dell'actina è stata utilizzata come controllo interno. Questa figura è stata modificata da L. Recha-Sancho et al. 11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
In precedenza, il nostro gruppo ed altri hanno descritto l'uso di piattaforme di tridimensionale (3D) cultura con cella diversi sistemi3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13,14,15. Nel lavoro attuale, descriviamo un metodo facile e affidabile di ottenere cultura 3D sistemi che sono applicabili a qualsiasi tipo di cellule di mammiferi tra cui qualsiasi tipo di cellula funzionale, embrionale o adulto cellule staminali, o alla fine, le cellule disfunzionali isolate da le biopsie o tumori e così via. Inoltre, in modo indipendente, se le cellule staminali sono di origine embrionale o adulto avrebbero una migliore capacità di impegno di lignaggio nell'ambiente 3D che in 2D classica cultura piatti10,11,12, 13,14,15. Di conseguenza, la coltura delle cellule in questo sistema porterebbe alla differenziazione in funzionale tessuto-come le strutture che potrebbero essere utilizzate in svariate applicazioni, dalla biomedicina riparativa o rigenerativa per piattaforme tossicologiche e farmacologiche.
Abbiamo dimostrato un chiaro aumento nella funzione delle cellule perché il microambiente cellulare è simile a quella dei tessuti naturali in termini di struttura matrix e parametri biomeccanici, biofisici e biologici. Tuttavia, come il sistema diventa più complesso, il numero di parametri che devono essere regolati anche aumenti, che comprende la necessità di una piattaforma di supporto esterna (ad esempio di un sistema di perfusione attiva per evitare problemi associati a fenomeni di trasferimento di massa ). Cellule coltivate tridimensionalmente le prestazioni migliori in termini che regolano le attività essenziali, quali la migrazione, proliferazione e differenziazione. Potrebbe formano reti complesse consentendo diafonia cellulare avanzata, che è di gran lunga una conseguenza essenziale di crescita e di differenziazione in 3D. Il fatto che i succhi potrebbe creare condizioni in vitro simile a quelle della matrice extracellulare proteine rappresenta un vantaggio poiché uno studio razionale dell'effetto prodotto per ogni componente aggiunto al patibolo (fattore di crescita, polisaccaride o segnalazione peptide) potrebbe essere facilmente portato.
I chiari vantaggi dell'uso di SAPS rispetto ad altri scaffold naturali, come collagene di tipo I e Matrigel, sono i seguenti: 1) SAPS è un biomateriale sintetico con minime variazioni da lotto a lotti di produzione; 2) SAPS ha la capacità di essere funzionalizzati con motivi di peptide specifico; e 3) presenta SAPS bassa biodegradabilità in vitro, che permette il mantenimento del costrutto 3D con le stesse proprietà biofisiche, biomeccaniche e strutturali nel corso del tempo. Tuttavia, la limitazione dell'utilizzo di SAPS contro altri ponteggi è trovato durante la fase di incapsulamento, dove le cellule sono in un ambiente ostile a causa del basso pH. Pertanto, questo è un passaggio fondamentale nella metodologia descritta. Inoltre, è importante impostare la concentrazione di SAPS per ciascun tipo di cella specifica prima di iniziare qualsiasi esperimento. Questo è, infatti, essenziale quando le cellule sono coltivate su o dentro questi biomateriali, poiché ogni tipo di cellula particolare presenterà condizioni di crescita ottimali biomeccanico.
Infine, riteniamo che la progettazione e la fabbricazione di questo tipo di ponteggio biomateriale potrebbe migliorare lo sviluppo di modelli 3D del tessuto più fisiologiche ed affidabili per aiutare l'industria farmaceutica a sviluppare migliori approcci terapeutici per medicina rigenerativa, cancro o qualsiasi trattamento medico.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
La ricerca effettuata dagli autori è stata sostenuta in parte da sovvenzioni dall'Unione europea settimo programma quadro (FP7/2007-2013) sotto Grant accordo n. 229239 e dalla Fondazione AO, esplorativo ricerca collaborativa ricerca programma acuta Cartilagine ferita/lesione/difetto (CRP ACI) nell'ambito del progetto Bioactive e biomimetici scaffold per la rigenerazione della cartilagine (BIOCART).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human articular chondrocytes (Ach) | Lonza | CC-2550 | |
| RAD16-I peptide solution (PuraMatrix) | Corning | 354250 | |
| Sucrose (tissue culture grade) | Sigma | S0389 | |
| Cell culture inserts (0.4 µm pore, 12 mm diameter) | Millipore | PICM01250 | |
| Chondrocyte Basal Medium (CBM) | Lonza | CC-3217 | |
| SingleQuots of Growth Supplements | Lonza | CC-4409 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Lonza | DE14-801F | |
| Dexamethasone | Sigma | D8893 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate (AA2P) | Sigma | A8960 | |
| Human transforming growth factor-β1 (TGF-β1) | Millipore | GF111 | |
| RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Invitrogen | LC 2005 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34080 | |
| Anti-Actin | SCBT | sc-1615 | |
| Anti-Collagen I | Abcam | ab138492 | |
| Anti-Collagen II | Abcam | ab3092 | |
| Anti-Collagen X | Abcam | ab182563 | |
| Antigoat IgG-HRP | Abcam | ab97100 | |
| Anti-mouse IgG-HRP | Abcam | ab97023 | |
| Anti-rabbit IgG-HRP | Abcam | ab97051 |
References
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