Summary
نقدم هنا، وضع بروتوكول للحصول على نظم 3D-الثقافة في تجميع السقالات الببتيد لتعزيز التفريق بين ديديفيرينتياتيد chondrocytes مفصلي البشرية في الأنسجة مثل الغضاريف الذاتية.
Abstract
ويرد وصف تقنية مفيدة لاستزراع الخلايا في سقالة نانوفيبير ثلاثية الأبعاد (3D) تجميع ذاتي. يجسد هذا النظام ثقافة بيئة الذي يحاكي عن كثب السمات الهيكلية للأنسجة غير الاستقطاب. وعلاوة على ذلك، هيكل السقالة nanofiber المضمنة معين يجعل من شفافة للضوء المرئي، مما يسمح للتصور سهلة للعينة تحت المجهر. واستخدمت هذه الميزة إلى حد كبير لدراسة الهجرة الخلية والمنظمة، والانتشار، والتمايز وهكذا أي تطوير وظيفتها الخلوية خاصة بالتلوين بالأصباغ محددة أو تحقيقات. وعلاوة على ذلك، يصف لنا في هذا العمل، والأداء الجيد لهذا النظام لدراسة ريديفيرينتييشن لتوسيع chondrocytes مفصلي البشرية بسهولة في الأنسجة عنقية. الخلايا مغلفة في تجميع ذاتي الببتيد السقالات ومثقف تحت شروط معينة لتعزيز تشوندروجينيسيس. الثقافات ثلاثي الأبعاد وأظهرت جدوى جيدة خلال 4 أسابيع التجربة. كما هو متوقع، عينات مثقف مع الحمام تشوندروجينيك (بالمقارنة مع المستحثة بغير ضوابط) الملون بقوة إيجابية لازرق تولويدين (الذي البقع الجليكوزامينوجليكان (الكمامات) العالية الموجودة في المصفوفة خارج الخلية الغضاريف)، وأعرب عن اكتب علامات جزيئية محددة، بما في ذلك الكولاجين الأول والثاني والعاشر، وفقا لتحليل "لطخة الغربية". هذا البروتوكول سهلة لأداء، ويمكن استخدامها في المختبرات البحثية والصناعات والأغراض التعليمية في الدورات المختبرية.
Introduction
وقد أجريت لعقود عديدة، ثقافة خلية الثدييات تحت ظروف تجريبية باستخدام أنظمة الثقافة (2D) ثنائية الأبعاد الكلاسيكية بسبب المسائل العملية والاقتصادية بغض النظر عن الجوانب غير الفسيولوجية. على الرغم من أن هذا النظام الثقافي يساعد على دراسة وفهم أكثر الآليات الجزيئية والخلوية، ونحن نعلم اليوم أن نماذج الثقافة خلية جديدة ضرورية لدراسة النظم الخلوية أكثر تعقيداً. ولذلك، نظم الثقافة (3D) ثلاثي الأبعاد تحتاج إلى إعادة إنشاء المكروية التي بيوفيسيكالي، بيوميتشانيكالي، وبيولوجيا أكثر مماثلة للأنسجة الطبيعية. في السنوات الأخيرة، نظم الثقافة 3D، بشكل عام، أصبحت أكثر انتشارا بين الباحثين والصناعة نظراً لأنها تمثل نموذجا جديداً لدراسة أو فحص في الخلايا التي يمكن أن تنمو في الفضاء، وإنشاء خلية إلى خلية أو خلية لمصفوفة التفاعلات، تهاجر و في نهاية المطاف تفرق في الأنساب الخلية المحددة.
والهدف العام لهذه المنهجية هو إعادة في المختبر خلوية المكروية التي أقرب إلى المكروية في فيفو . على وجه الخصوص، سقالة الببتيد تجميع ذاتي الاصطناعية (برامج التكيف الهيكلي) نوع من مادة بيولوجية مع خصائص فريدة من نوعها؛ وهي تشكل شبكة مسام نانومتر الحجم مصنوعة من التفاعلات الضعيفة بين الببتيدات مع الخصائص الميكانيكية والهيكلية مماثلة تلك المصفوفات خارج الخلية الطبيعية. وبعبارة أخرى، العقلانية وراء استخدام هذه المواد فإنه ينشئ حقاً 3D-بيئة التي مثالية للحصول على أنسجة الزائفة-3D أو وحدات الجهاز. ولكن الأهم من ذلك، يسمح سياق 3D هيكل ثلاثي الأبعاد للحصول على الوظائف البيولوجية الجديدة التي عادة ليست موجودة في 2D ثقافة المنابر، مثل خصائص تتعلق بهندسة الأنسجة، ظواهر النقل الجماعي، خلية الزخرفة، وفي نهاية المطاف morphogenesis الأنسجة، وعوامل رئيسية في المستقبل للبحث وتطوير وظيفي أنسجة وأجهزة1،2. وعلاوة على ذلك، ميزة لبرامج التكيف الهيكلي على نظيراتها الطبيعية (الكولاجين، ماتريجيل) هو أنها مستقرة جداً في درجة حرارة الغرفة ولا تتطلب شروطا خاصة لمرحلة ما بعد الإنتاج أو التوزيع أو مخزن3،4، 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15-برامج التكيف الهيكلي من السهل التعامل معها، عندما رغبت؛ المواد الهلامية 3D يمكن الحصول عليها ببساطة بزيادة قوام القوة الأيونية أو بتعديل درجة الحموضة إلى الحياد1،2. أخيرا، كانت المنهجية الموصوفة هنا المستخدمة على نطاق واسع في المختبر لتعزيز الصيانة والنمو والتمايز على عدد من أنواع الخلايا، بما في ذلك تشوندروسيتيس، خلايا الكبد، وخلايا بطانية، وخلايا الاوستيوبلاستس، الخلايا العصبية، وكذلك كالخلايا الجذعية الجنينية وجسدية3،4،5،،من67،،من89،10، 11 , 12 , 13 , 14 , 15-في العمل الحالي، يمكننا وصف استخدام نظام 3D-الثقافة للتفرقة بين البشر chondrocytes مفصلي الموسعة (هاتش) في الأنسجة مثل الغضاريف كما هو موضح سابقا11.
هنا، يتم وصف طريقة لخلايا الثقافة في نظام ثلاثي الأبعاد باستخدام برامج التكيف الهيكلي. في هذا مادة بيولوجية الاصطناعية، خلايا تختلط أولاً بحل ببتيد، الذي فعل في وقت لاحق لتجميع ذاتي، إنشاء شبكة أبعاد النانومترية حول الخلايا وذلك خلق بيئة 3D حقاً (الشكل 1). من المهم أن تنظر في أن السلوك الخلوي يتأثر بصلابة مصفوفة القيم (أي انتشار، والهجرة والتمييز). ولذلك، عنصر تحكم منهجية مشتركة لخلايا الثقافة فوق سقالة الببتيد بنفس صلابة قيم (الثقافة في بعدين).
Protocol
1-ذاتية تجميع إعداد السقالة (برامج التكيف الهيكلي) الببتيد
- تعد حلاً 0.5% من الببتيد RAD16--أنا في السكروز 20% (w/v)، في أنبوب مايكرو--أجهزة الطرد المركزي. Sonicate الحل الببتيد لمدة 20 دقيقة في حمام الموجات فوق الصوتية في الحد الأقصى من الطاقة وفي درجة حرارة الغرفة (RT) لضمان خلط متجانسة.
ملاحظة: حجم الحل أن تكون مستعدة سيتوقف على عدد انكابسوليشنز المطلوب. RAD16--أنا الببتيدات لا تعاني من التدهور في ظل هذه الظروف sonication. - تمييع الحل الببتيد الذي أعد في الخطوة 1، 1 مع حجم السكروز 10% (w/v) اللازمة للحصول على التركيز النهائي المطلوب.
ملاحظة: هو عامل هام تأخذ في الاعتبار تعديل تركيز الببتيد الأولية صلابة المصفوفة النهائي يتوقف على هذه المعلمة. RAD16--أنا ينبغي أن يكون الحل الببتيد 2 x أكثر مركزة من تركيزات النهائية المرجوة من بنية ثلاثية الأبعاد. عادة، RAD16 النهائي--أنا الببتيد التركيزات المستخدمة بين 0.15-0.5% (w/v). - ضع الأنبوب الصغير-الطرد يحتوي على الحل الببتيد في حمام الموجات فوق الصوتية على RT لمدة 20 دقيقة لضمان خلط متجانسة.
ملاحظة: حل الببتيد، إذا لم تستخدم على الفور، يمكن تخزينها لعدة أشهر عند 4 درجة مئوية.
2. إعداد تعليق الخلية
- الطرد المركزي بتعليق الخلية (التي تم الحصول عليها بعد العلاج التربسين) في 60 × ز و RT لمدة 5 دقائق.
- إزالة المادة طافية باستخدام ماصة باستور متصل بخط فراغ وتعليق بيليه الخلية في 3-5 مل سكروز 10% (w/v) باستخدام ميكروبيبيتي. المضي قدما لعد الخلايا باستخدام عداد خلية يدوي أو تلقائي.
ملاحظة: محلول السكروز 10% (w/v) هي وسيلة متساوي التوتر وغير الأيونية التي تسمح بصيانة الخلية ويتجنب الببتيد جيليشن خلال عملية خلط. - الطرد المركزي من تعليق خلية في 60 × ز و RT لأدنى 5 إزالة المادة طافية وتعليق بيليه الخلية مرة أخرى في حجم اللازمة من السكروز 10% (w/v) للحصول على ضعف تركيز الخلية النهائية المرجوة (المستحب حوالي 4 × 106 خلايا/ مل).
- ضع عدد المرجوة من إدراج زراعة الأنسجة في كل بئر من لوحة 6-جيدا (إدراج واحد في التغليف).
- Sonicate الحل الببتيد الذي أعد في الخطوة 1 في الحد الأقصى من الطاقة و RT لمدة 5 دقائق.
- "الماصة؛" ومكان ميليلتر 40 تعليق الخلية (التي تم الحصول عليها في 2، 3) لتغليف كل المطلوب بالإضافة إلى حوالي 10-15% حجم إضافي في أنبوب مايكرو--أجهزة الطرد المركزي قياسية.
3. تغليف الخلية 3D في برامج التكيف الهيكلي
- مزيج بحجم متساو RAD16--أنا الحل في السكروز 10% (w/v) (40 ميليلتر لتغليف) مع حجم متساوية من تعليق خلية (40 ميليلتر لتغليف) أعد في الخطوة 2 للحصول على تعليق خلايا في تركيز المطلوب الببتيد (في السكروز 10%). مزيج من بيبيتينج ببطء صعودا وهبوطاً حوالي 10 مرات. تجنب تشكيل فقاعة خلال خلط.
ملاحظة: هذه الخطوة أمر بالغ الأهمية ويجب أن يتم بعناية فائقة نظراً للخلايا تحت ظروف معادية بسبب الببتيد pH منخفضة (حوالي 3.5 – 4.0). - بعناية باستخدام ميكروبيبيتي، تحميل ميليلتر 80 تعليق في كل إدراج.
- إضافة 0.5 مل وسائط الثقافة إلى أسفل البئر الرطب في غشاء إدراج، والسماح لوسائل الإعلام نشرها لتعزيز الببتيد التجميع الذاتي وتكوين المائية. واسمحوا الببتيد هلام لمدة 20 دقيقة تقريبا في مجلس الوزراء تدفق.
ملاحظة: يمكن أن ينتهي التلاعب بالعينات أثناء إعداد الوقت في كسر هلام. - إضافة 40 ميليلتر من المتوسطة إلى الإدراج ببطء شديد والسماح لها بالانزلاق إلى أسفل الجدار الداخلي إلى الهلام.
ملاحظة: ينبغي تحميل وحدة التخزين هذه عادة، بين 20-30 ثانية. - ضع اللوحة في الحاضنة (37 درجة مئوية، 5% CO2، جو هوميديفيد) لمدة 20 دقيقة. سوف يؤيدون هذه الخطوة وإضافات متوسطة المتعاقبة النض السكروز والموازنة للخلايا مع الثقافة المتوسطة.
- إضافة 60 ميليلتر من المتوسطة إلى الجدار الداخلي للإدراج، مما يسمح لها بالتدفق أسفل الجدار. نضح المتوسطة للبئر، وغنية في السكروز، وإضافة 0.5 مل متوسطة جديدة.
- إضافة 60 ميليلتر من المتوسطة ببطء إلى الإدراج ووضع اللوحة في الحاضنة (37 درجة مئوية، 5% CO2، جو هوميديفيد) لمدة 10 دقائق.
- نضح متوسطة البئر وإضافة 2.5 مل متوسطة جديدة في البئر. إضافة 200 ميليلتر من المتوسطة إلى الإدراج. ضع اللوحة في الحاضنة (37 درجة مئوية، 5% CO2، جو هوميديفيد) للحفاظ على الخلايا الظروف المناسبة.
- تغيير في المتوسط كل يوم. إزالة المتوسطة القديمة من أسفل البئر. إضافة 2.5 مل متوسطة جديدة إلى ميليلتر جيدا و 200 للإدراج.
ملاحظة: إذا استمر التمايز الخلية، وسائط الإعلام حمل محددة ستضاف إلى الثقافات، أسفر عن التزام نوع الخلايا المطلوب (انظر أدناه، الخلية التمايز).
4-خلية البقاء في 3D-برامج التكيف الهيكلي
- ملاحظة: فحص صلاحية خلية يعرف لايف/الميت – مقايسة البقاء/سيتوتوكسيسيتي كذلك.
- في أنبوب 15 مل، إعداد وحدة التخزين اللازمة حل جديدة كالسين 2 ميكرومتر صباحا و 2 ميكرومتر اثيديوم هوموديمير-1 (اتهد-1) في برنامج تلفزيوني فورتيكسينج لإبقاء س. 10 في الظلام.
ملاحظة: وحدة التخزين لاستخدامها لكل عينة سوف تعتمد على حجم جيدا وفقا لما يلي: 2 مل لكل بئر من لوحة 6-مولتيويل؛ 1 مل لكل جيد من لوحة 12-مولتيويل ومل 0.5 لكل بئر من صفيحة 24-مولتيويل. - استخدام ميكروبيبيتي، شطف 3 مرات مع 2 مل من برنامج تلفزيوني عينات 3D-برامج التكيف الهيكلي، وثم تغطية ذلك مع الحل الذي أعد في الخطوة 4، 1. تبني على RT لمدة 40 دقيقة في الظلام.
- استخدام ميكروبيبيتي، الشطف بنيات مع 2 مل من برنامج تلفزيوني 5 مرات.
- تصور هذه العينات تحت مجهر فلورية استخدام 10 X أو 20 X التكبير.
5-الخلية التمايز
- ويكمل ثقافة الخلايا (37 درجة مئوية، 5% CO2، جو هوميديفيد) في تشوندروسيتي القاعدية المتوسطة (CBM) مع النمو.
ملاحظة: هو وصف إعداد المتوسطة في تعليمات الشركات المصنعة (انظر الجدول المواد). - الحث على تمايز خلية في اليوم 2 مع تشوندروجينيك المتوسطة الإنسان المؤتلف الذي يتضمن تحويل عامل النمو-b1 [TGFb1] (10 نانوغرام/مل)، "حمض" الأسكوربيك L 2-الفوسفات [AA2P] (25 ميكروغرام/مل) والديكساميتازون (100 nM).
- الحفاظ على الثقافة لمدة 4 أسابيع في حاضنة مع جو هوميديفيد في أول أكسيد الكربون 37 درجة مئوية و 5%2. تغيير المتوسطة تشوندروجينيك كل يوم.
6-تولويدين الأزرق تلطيخ (السل)
- أغسل ثقافات 3D-برامج التكيف الهيكلي مرتين عن طريق إضافة وإزالة ثم 2 مل من برنامج تلفزيوني مع ميكروبيبيتي. إصلاح لهم عن طريق إضافة 2 مل من 2% (w/v) ففورمالدهايد في برنامج تلفزيوني عن ح 2 في الرايت
- تغسل مرتين مع 2 مل من 0.1% Triton X-100 في "برنامج تلفزيوني" (ببست).
- احتضان مع 2 مل السل 0.05% في الماء لمدة 20 دقيقة في الرايت
- تغسل عدة مرات (3 مرات على الأقل) مع 2 مل من برنامج تلفزيوني حتى يتم حل برنامج تلفزيوني إزالة واضحة.
- تحليل عينات من خلال الفحص البصري تحت مجهر مجسم11،،من1314.
ملاحظة: السل يشكل المجمعات مع أنيونى جليكوكونجوجاتيس في المصفوفة خارج الخلية، مثل بروتيوجليكانس (PG) والجليكوزامينوجليكان (هفوة)، التي هي أساسا التي يفرزها تشوندروسيتي-مثل الخلايا. عينات إيجابية ملطخة الأزرق.
7-الغربية وصمة عار
ملاحظة: سبق وصف الإجراءات المستخدمة في هذا البروتوكول في مرجع11.
- 3D-ثوابت في المعهد الملكي العازلة التي تحتوي على مبطلات المانع كوكتيل من بيبيتينج.
- تحضير هلام الاكريلاميد وفقا لمتطلبات الحجم هلام (من معدات تشغيل جل محددة) وتشغيل ليساتيس خلية لمدة 90 دقيقة في 150 الخامس16.
ملاحظة: عادة ما تكون على استعداد هلام الاكريلاميد بتركيز 7.5-10% (w/v)، اعتماداً على الوزن الجزيئي للبروتين. - نقل البروتينات الواردة في الجل في غشاء ثنائي الفلوريد (PVDF) الفينيليدن عن طريق تطبيق 40 الخامس ح 2 في الرايت
- احتضان الغشاء PVDF في RT ح 2 في المخزن المؤقت لحظر (4% (w/v) الحليب المجفف الخالي في ببست) في حاوية منفصلة مع حجم ما يكفي لتغطية الغشاء.
- احتضان الغشاء في RT ح 1 مع الأجسام المضادة الأولية بتركيز 1 ملغ/مل في ببست نهائية. انظر الجدول المواد.
- إضافة الأجسام المضادة الثانوية بتركيز 1 ملغ/مل. انظر الجدول المواد.
- إعداد الغشاء للكشف عن hP مع الركيزة تشيميلومينيسسينت16. انظر الجدول المواد.
- تأخذ الصور تشيميلومينيسسينت16.
Representative Results
في هذا العمل، هو وصف بروتوكول بسيط وأسرع إلى خلايا الثقافة في 3D باستخدام برامج التكيف الهيكلي للحصول على البيانات الكمية والنوعية الموثوقة. ينشئ برامج التكيف الهيكلي المكروية 3D مع الخصائص الفريدة التي تسمح للخلايا المزروعة تحت الشروط المطلوب الشروع في صيانة الخلية، انتشار و/أو التمايز3،4،،من56 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12-في مجموعتنا، عدة دراسات قد أجريت باستخدام خلايا الأنسجة الدهنية البشرية المستمدة السلف (حابك)، chondrocytes مفصلي البشرية الموسعة (هاتش) والبشرية عن طريق الجلد العادي الليفية (هندف) للثقافة، وتوسيع والتفريق بينهم في الأنسجة مثل الغضاريف10،،من1112. هنا، نحن وصف الثقافة 3D والتفريق بين إعادة هاتش الموسعة في الأنسجة مثل الغضاريف، كما هو موضح سابقا11. ومن ثم فإننا تغليف الخلايا في 3D-برامج التكيف الهيكلي والثقافة منهم في المتوسط التعريفي تشوندروجينيك، كما هو موضح في الشكل 1 (وفي البروتوكول). بعد 24 ساعة، تم تقييم عينات للبقاء مع "فحص" صلاحية/سيتوتوكسيسيتي لايف/قتيلا. أن النتائج تشير إلى أن % عدد قليل من الخلايا قد لقوا حتفهم (أحمر) بعد 5 أيام من التغليف وتقريبا لم يلاحظ أي خلايا ميتة بعد 4 أسابيع ثقافة (الشكل 2). المقبل، ونحن الملون لهم لترسب glycosaminoglycan (هفوة) في المصفوفة خارج الخلية استخدام تولويدين الأزرق تلطيخ الأسلوب. كما هو متوقع، الفريق التوجيهي استجابت بشكل صحيح للعلاج، وتبين قوية تلطيخ (الشكل 2).
وأخيراً، الواسمات الجزيئية لعلامات تشوندروجينيسيس وتضخم، بما في ذلك الكولاجين اكتب الأول والثاني والعاشر، وتم تحليلها بواسطة لطخة غربية (الشكل 3). ولوحظ نوع الكولاجين أنا (COL1) وقد لوحظ في نظم 2D و 3D ولكن عصابة أقل من كاتشين ~ 130 (تمثل البروتين COL1 الناضجة المجهزة يتم تجميعها في المصفوفة خارج الخلية) فقط في 3D. يشير بوضوح إلى هذه النتيجة أن الخلايا تمر بالتمايز في الأبعاد الثلاثة المضي قدما بطريقة أكثر فسيولوجية. بشكل ملحوظ، تم اكتشاف نوع الكولاجين الثاني (COL2)-كعصابة واحدة من الوزن الجزيئي المتوقعة الحالية في المصفوفة خارج الخلية--فقط في ثوابت 3D مثقف تحت ظروف تشوندروجينيك. وأخيراً، الكولاجين النوع X (COL10) واكتشفت في 2D و 3D سواء بنيات مثقف تحت ظروف تشوندروجينيك، مما يشير إلى درجة ما من تضخم بعد 4 أسابيع ثقافة.
رقم 1: التمثيل التخطيطي لتغليف الخلايا في 3D-برامج التكيف الهيكلي- ويرد وصف التمثيل التخطيطي لتغليف هاتش للحصول على خلايا موزعة عشوائياً داخل 3D-برامج التكيف الهيكلي. 1-تجميع ذاتي الببتيد إعداد السقالة (برامج التكيف الهيكلي)؛ 2-خلية إعداد تعليق؛ و 3- تغليف 3D-خلية في برامج التكيف الهيكلي. لاحظ أن التخطيطي يظهر فقط الخطوات 3.1 إلى 3.4.
رقم 2: الخلية تمايز الأداء وتشوندروجينيك في الثقافات 3D-برامج التكيف الهيكلي- خلية تلطيخ صلاحية إجراء أيام 5 و 4 أسابيع للثقافة التي اكتشفت تحت مجهر فلوري (الخلايا الحية في الخلايا الخضراء والميت باللون الأحمر). تغيير حجم أشرطة = 200 ميكرومتر. تشوندروجينيسيس العامة التزاما يقيمها تولويدين الزرقاء المصبوغة (مسلفت الجليكوزامينوجليكان باللون الأزرق) من بنيات 3D-برامج التكيف الهيكلي مثقف في وسائل الإعلام الرقابة وتشوندروجينيك. تغيير حجم أشرطة = 500 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من ل. رشا-سانشو et al. 11- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: الكولاجين الأول، التعبير الثاني والعاشر من هاتش تمر تشوندروجينيسيس. هاتش مثقف في 2D-أحادي الطبقة وفي 3D-برامج التكيف الهيكلي بعد 4 أسابيع في تشوندروجينيك تم تقييم وسائل الإعلام وضوابط للتعبير عن الكولاجين النوع الأول (COL1)، الكولاجين من النوع الثاني (COL2) ونوع الكولاجين X (COL10). واستخدم التعبير أكتين كرقابة داخلية. وقد تم تعديل هذا الرقم من ل. رشا-سانشو et al. 11- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
سابقا، وصف مجموعتنا، والبعض الآخر استخدام منصات الثقافة (3D) ثلاثي الأبعاد مع الخلية متنوعة النظم3،4،5،،من67،8 ،9،10،11،،من1213،،من1415. في هذا العمل، ونحن تصف طريقة سهلة ويمكن الاعتماد عليها للحصول على الثقافة 3D الخلايا الجذعية النظم التي يمكن تطبيقها على أي نوع من خلايا الثدييات بما في ذلك أي نوع من الخلايا الوظيفية، الجنينية أو الكبار، أو في نهاية المطاف، عزل خلايا مختلة من الخزعات أو الأورام، وهلم جرا. وبالإضافة إلى ذلك، بشكل مستقل، إذا كانت الخلايا الجذعية المنشأ الجنينية أو الكبار أن لديهم قدرة التزام نسب أفضل في بيئة ثلاثية الأبعاد من الثقافة 2D الكلاسيكية الأطباق10،،من1112، 13،،من1415. ولذلك، ثقافة الخلية في هذا النظام سيؤدي إلى التمايز في هياكل مثل الأنسجة الوظيفية التي يمكن أن تستخدم في تطبيقات مختلفة، من الطب الترميمي أو التجدد الحيوي لمنصات السمية والدوائية.
وقد أظهرنا مكسب واضح في وظيفة الخلية لأنه يشبه المكروية الخلوية للأنسجة الطبيعية من حيث هيكل المصفوفة ومعلمات النشاط الحيوي والفيزيائية والبيولوجية. ومع ذلك، كما يصبح النظام أكثر تعقيداً، عدد المعلمات التي يجب أن تكون ينظم أيضا الزيادات، التي تشمل الحاجة إلى منصة دعم خارجي (مثل نظام التروية نشطة لتجنب النقل الجماعي للقضايا المرتبطة بالظواهر ). الخلايا المزروعة ثريديمينسيونالي أداء أفضل فيما يتعلق بتنظيم الأنشطة الأساسية، مثل الهجرة والانتشار والتفرقة. أنها يمكن أن تشكل الشبكات المعقدة مما يتيح تعزيز الحديث المتبادل الخلوية، الذي إلى حد بعيد كنتيجة أساسية لتنمو والتفريق في 3D. حقيقة أن يستنزف يمكن أن تخلق الظروف في المختبر مشابهة لتلك تمثل البروتينات المصفوفة خارج الخلية تنتج ميزة منذ دراسة عقلانية للتأثير لكل مكون من مكونات إضافة إلى السقالة (عامل النمو أو السكاريد أو إشارات يمكن أن يقوم الببتيد) بسهولة.
المزايا الواضحة لاستخدام برامج التكيف الهيكلي بالمقارنة إلى السقالات الطبيعية الأخرى، مثل الكولاجين النوع الأول وماتريجيل، هي ما يلي: 1) برامج التكيف الهيكلي مادة بيولوجية اصطناعية مع اختلاف الحد الأدنى من دفعة إلى دفعة الإنتاج؛ 2) برامج التكيف الهيكلي لديها القدرة على أن تكون فونكتيوناليزيد بزخارف الببتيد محددة؛ و 3) يعرض برامج التكيف الهيكلي انخفاض تحلل الأحيائي في المختبر، مما يسمح بالحفاظ على بنية ثلاثية الأبعاد مع نفس الخصائص الفيزيائية-الحيوية والنشاط الحيوي والهيكلية على مر الزمن. ومع ذلك، الحد من استخدام يستنزف مقابل أخرى يتم العثور على السقالات أثناء الخطوة التغليف، حيث تكون الخلايا في بيئة عدائية بسبب انخفاض درجة الحموضة. ولذلك، هذا خطوة حاسمة في وصف المنهجية. وعلاوة على ذلك، من المهم تعيين تركيز برامج التكيف الهيكلي لكل نوع خلية معينة قبل البدء في أي تجربة. وهذا ضروري، في الواقع، عندما تستزرع خلايا على أو إلى هذه الحيوية، حيث سيقدم كل نوع خلية معينة ظروف نمو النشاط الحيوي الأمثل.
وأخيراً، نعتقد أن تصميم وتصنيع هذا النوع من مادة بيولوجية سقالة سيعزز تطوير نماذج الأنسجة ثلاثية الأبعاد الفسيولوجية وأكثر اعتمادية لمساعدة صناعة المستحضرات الصيدلانية لتطوير أفضل النهج العلاجي الطب التجديدي أو السرطان أو أي علاج طبي.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
البحوث التي يقوم بها أصحاب تدعمها جزئيا منح من "الاتحاد الأوروبي البرنامج الإطاري السابع" (FP7-2007-2013) ضمن اتفاق المنحة رقم 229239، ومن "مؤسسة AO الاستكشافية البحوث التعاونية أبحاث البرنامج الحادة" غضروف الإصابة/الآفة/عيب (المجلس الدولي للمطارات CRP) في إطار مشروع بيواكتيفي والسقالات المحاكاة البيولوجية لتجديد الغضاريف (بيوكارت).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human articular chondrocytes (Ach) | Lonza | CC-2550 | |
| RAD16-I peptide solution (PuraMatrix) | Corning | 354250 | |
| Sucrose (tissue culture grade) | Sigma | S0389 | |
| Cell culture inserts (0.4 µm pore, 12 mm diameter) | Millipore | PICM01250 | |
| Chondrocyte Basal Medium (CBM) | Lonza | CC-3217 | |
| SingleQuots of Growth Supplements | Lonza | CC-4409 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Lonza | DE14-801F | |
| Dexamethasone | Sigma | D8893 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate (AA2P) | Sigma | A8960 | |
| Human transforming growth factor-β1 (TGF-β1) | Millipore | GF111 | |
| RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Invitrogen | LC 2005 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34080 | |
| Anti-Actin | SCBT | sc-1615 | |
| Anti-Collagen I | Abcam | ab138492 | |
| Anti-Collagen II | Abcam | ab3092 | |
| Anti-Collagen X | Abcam | ab182563 | |
| Antigoat IgG-HRP | Abcam | ab97100 | |
| Anti-mouse IgG-HRP | Abcam | ab97023 | |
| Anti-rabbit IgG-HRP | Abcam | ab97051 |
References
- Aggeli, A., et al. Responsive gels formed by the spontaneous self-assembly of peptide into polymeric β-sheet tapes. Nature. 386, 259-262 (1997).
- Semino, C. E. Can we build artificial stem cell compartments? Journal of Biomedicine and Biotechnology. 3, 164-169 (2003).
- Kisiday, J., et al. Self-assembling peptide hydrogel fosters chondrocyte extracellular matrix production and cell division: implications for cartilage tissue repair. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 99, 9996-10001 (2002).
- Narmoneva, D. A., Vukmirovic, R., Davis, M. E., Kamm, R. D., Lee, R. T. Endothelial cells promote cardiac myocyte survival and spatial reorganization: implications for cardiac regeneration. Circulation. 110, 962-968 (2004).
- Genové, E., Shen, C., Zhang, S., Semino, C. E. The effect of functionalized self-assembling peptide scaffolds on human aortic endothelial cell function. Biomaterials. 26, 3341-3351 (2005).
- Garreta, E., Genové, E., Borrós, S., Semino, C. E. Osteogenic differentiation of mouse embryonic stem cells and mouse embryonic fibroblasts in a three-dimensional self-assembling peptide scaffold. Tissue Engineering. 12, 2215-2228 (2006).
- Sieminski, A. L., Semino, C. E., Gong, H., Kamm, R. D. Primary sequence of ionic self-assembling peptide gels affects endothelial cell adhesion and capillary morphogenesis. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 87 (2), 494-504 (2008).
- Semino, C. E. Self-assembling peptides: from bio-inspired materials to bone regeneration. Journal of Dental Research. 87 (2008), 606-616 (2008).
- Hernández Vera, R., et al. Interstitial fluid flow intensity modulates endothelial sprouting in restricted Src-activated cell clusters during capillary morphogenesis. Tissue Engineering Part A. 15 (1), 175-185 (2009).
- Castells-Sala, C., Martínez-Ramos, C., Vallés-Lluch, A., Monleón Pradas, M., Semino, C. In vitro development of bioimplants made up of elastomeric scaffolds with peptide gel filling seeded with human subcutaneous adipose tissue-derived progenitor cells. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (11), 3419-3430 (2015).
- Recha-Sancho, L., Semino, C. E. Heparin-based self-assembling peptide scaffold reestablish chondrogenic phenotype of expanded de-differentiated human chondrocytes. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (7), 1694-1706 (2016).
- Bussmann, B. M., et al. Chondrogenic potential of human dermal fibroblasts in a contractile, soft, self-assembling, peptide hydrogel. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10 (2), E54-E62 (2016).
- Recha-Sancho, L., Moutos, F. T., Abellà, J., Guilak, F., Semino, C. E. Dedifferentiated Human Articular Chondrocytes Redifferentiate to a Cartilage-Like Tissue Phenotype in a Poly (ε-Caprolactone)/Self-Assembling Peptide Composite Scaffold. Materials. 9 (6), 472 (2016).
- Recha-Sancho, L., Semino, C. E. Chondroitin Sulfate and Decorin based self-assembling scaffolds for cartilage tissue engineering. PlosOne. 11 (6), e0157603 (2016).
- Aloy-Reverté, C., Moreno-Amador, J. L., Nacher, M., Montanya, E., Semino, C. E. Use of RGD-Functionalized Sandwich Cultures to Promote Redifferentiation of Human Pancreatic Beta Cells After In Vitro Expansion. Tissue Engineering Part A. , (2017).
- Kurien, B. T., Scofield, R. H.
