Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לקבל מערכות 3D-תרבות בהרכבת פיגומים פפטיד כדי לקדם את הבידול של dedifferentiated chondrocytes במפרק האנושי לתוך רקמות הסחוס דמוי עצמי.
Abstract
טכניקה שימושית עבור culturing תאים עצמית וההספק nanofiber תלת מימד (3D) לפיגום מתואר. מערכת זו תרבות משחזר סביבה מקרוב מחקה את התכונות מבנית של הרקמה הלא מקוטב. יתר על כן, מבנה מסוים nanofiber מהותי לגרדום הופך שקוף לאור ויזואלי, המאפשר ויזואליזציה קל של הדגימה תחת מיקרוסקופ. יתרון זה שימש בעיקר ללמוד נדידת תאים, הארגון, התפשטות, ואת בידול ולכן כל התפתחות תפקוד התאים מסוים שלהם על ידי צביעת עם צבע מסוים או הגששים. יתר על כן, בעבודה זו, אנו מתארים את ביצועים טובים של מערכת זו ללמוד בקלות את redifferentiation של chondrocytes במפרק האנושי המורחב לתוך רקמות הסחוס. התאים היו מקופל לתוך עצמי בהרכבת פיגומים פפטיד, תרבותי בתנאים מסוימים כדי לקדם את chondrogenesis. תרבויות תלת מימדי הראו הכדאיות טוב במהלך 4 השבועות של הניסוי. כצפוי, דגימות תרבותי עם inducers chondrogenic (לעומת פקדים שאינם-induced) צבעונית מאוד חיובית טולדין כחול (אשר כתמים glycosaminoglycans (GAGs) כי הם מאוד נוכח מטריצה חוץ-תאית סחוס) והביע סמנים מולקולריים ספציפיים, לרבות קולגן סוג אני, II ו- X, על פי ניתוח המערבי כתם. פרוטוקול זה קל לבצע והוא יכול לשמש במעבדות מחקר, תעשיות, למטרות חינוכיות בקורסים מעבדה.
Introduction
במשך עשורים רבים, תרבית תאים בתרבית של בוצעה בתנאים ניסיוני באמצעות מערכות התרבות הקלאסית דו-ממדית (2D) עקב בעיות מעשיות וכלכליים בין ההיבטים הלא-פיזיולוגיים. למרות מערכת תרבות זו מסייעת ללמוד ולהבין מנגנונים מולקולריים וסלולריות ביותר, אנו יודעים היום פרדיגמות חדשות של התרבות תאים נדרשים ללמוד מערכות סלולריות מורכבים יותר. לכן, מערכות תלת מימד (3D) התרבות הן במקרה הצורך, כדי לשחזר את microenvironment biophysically, biomechanically וביולוגית דומה יותר לזה של רקמות טבעי. בשנים האחרונות, מערכות התרבות תלת-ממד, באופן כללי, הפכו להיות נפוץ יותר בקרב חוקרים והתעשייה מאז שהם מייצגים, מודל חדש של מחקר או הקרנה אילו תאים יכולים לגדול בחלל, ליצור לתא או תא-כדי-מטריקס אינטראקציות, העברה, בסופו של דבר להבדיל לתוך שושלות תאים מסוים.
המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא לשחזר במבחנה הסלולר microenvironment כי הוא קרוב יותר microenvironment ויוו . בפרט, לגרדום פפטיד עצמית וההספק סינתטי (לטמבלים) הוא סוג של biomaterial עם מאפיינים ייחודיים; היא יוצרת רשת של נקבוביות בגודל ננומטר עשוי חלש אינטראקציות בין פפטידים בעלי תכונות מכניות ומבניים דומים לאלה של מטריצה חוץ-תאית טבעיים. במילים אחרות, הרציונליות מאחורי השימוש בחומר זה הוא שיוצר באמת 3D-סביבה זה הינו אידיאלי עבור קבלת מדומה 3D הרקמות או האיברים יחידות. עם זאת, והכי חשוב, ההקשר 3D מאפשר את מבנה תלת-ממד להשיג תפקודים ביולוגיים חדשים שאינם בדרך כלל נוכח התרבות 2D פלטפורמות, כגון מאפיינים הקשורים רקמות אדריכלות, תופעות העברה המונית, תא המתבנת ובסופו של דבר מורפוגנזה רקמות, אשר הם גורמי מפתח להמשך המחקר ופיתוח של רקמות פונקציונלי ואת האיברים1,2. יתר על כן, היתרון לטמבלים מעל עמיתיהם טבעי (קולגן, Matrigel) הוא שהם יציבים מאד בטמפרטורת החדר ו אינם דורשים תנאים מיוחדים עבור פוסט-פרודקשן, הפצה או אחסון3,4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. לטמבלים קל לטפל, בעת הצורך; ג'לים 3D ניתן להשיג בפשטות על ידי הגדלת כוח יונית, או על-ידי התאמת רמת ה-pH נייטרליות1,2. לבסוף, המתודולוגיה המתוארת כאן כבר בשימוש נרחב במבחנה לקידום וצמיחה, תחזוקה, של בידול של מספר סוגי תאים, כולל chondrocytes, hepatocytes, תאי אנדותל, תאי העצם, כמו גם תאים עצביים תאי גזע עובריים וגופניות3,4,5,6,7,8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14 , 15. בשנת העבודה הנוכחית, אנו מתארים את השימוש של מערכת תלת-ממד-תרבות להבדיל בין האדם chondrocytes במפרק המורחב (הע ח) לתוך רקמות הסחוס דמוי כפי שתואר לעיל11.
כאן, מתוארת שיטה התרבות תאים במערכת תלת-ממד באמצעות אידיוטים. ב הזה biomaterial סינתטי, התאים מעורבבים קודם עם פתרון פפטיד, אשר כתוצאה מכך מושרה להרכיב עצמית, יצירת רשת של מידות nanometric מסביב לתאים, ולכן יצירת סביבת 3D באמת (איור 1). חשוב לקחת בחשבון כי התנהגות הסלולר מושפע ערכים נוקשות מטריקס (קרי, הפצה, העברה ובידול). לכן, פקד מתודולוגי נפוצה היא התרבות תאים מעל לגרדום פפטיד עם אותם ערכי נוקשות (תרבות על שני ממדים).
Protocol
1. עצמי וההספק פפטיד לגרדום (לטמבלים) הכנה
- להכין פתרון 0.5% של פפטיד RAD16-אני ב- 20% (w/v) סוכרוז, צינור מיקרו-צנטריפוגה. Sonicate הפתרון פפטיד עבור 20 דקות באמבט אולטראסוני-כוח מרבי, בטמפרטורת החדר (RT) כדי להבטיח ערבוב הומוגנית.
הערה: הנפח של פתרון להיות מוכן יהיה תלוי המספר של בסיס הרצוי. RAD16-אני פפטידים אינם סובלים השפלות בתנאים אלה sonication. - לדלל את הפתרון פפטיד מוכן בשלב 1.1 עם נפח נחוץ סוכרוז 10% (w/v) כדי להשיג את הריכוז הסופי הרצוי.
הערה: גורם חשוב שיש לקחת בחשבון הוא ההתאמה של הריכוז ההתחלתי פפטיד מאז הקשיחות מטריקס הסופי יהיה תלוי בפרמטר זה. RAD16-אני פפטיד פתרון צריך להיות 2 x יותר מרוכז יותר הריכוז הסופי הרצוי של הבונה תלת-ממד. בדרך כלל, RAD16 האחרון-אני ריכוזים פפטיד המשמש הן בין 0.15 – 0.5% (w/v). - מקם את הצינור מיקרו-צנטריפוגה המכיל את הפתרון פפטיד לתוך באמבט אולטרא-RT במשך 20 דקות כדי להבטיח ערבוב הומוגנית.
הערה: הפתרון פפטיד, אם לא נעשה שימוש באופן מיידי, ניתן לאחסן במשך כמה חודשים ב 4 º C.
2. התא ההשעיה הכנה
- Centrifuge התליה תא (שהושג לאחר הטיפול טריפסין) 60 x g ו- RT במשך 5 דקות.
- להסיר את תגובת שיקוע באמצעות פיפטה של פסטר חיבור לקו ואקום והשהה בגדר תא ב- 3-5 מ של 10% (w/v) סוכרוז באמצעות של micropipette. להמשיך לספור תאים באמצעות מונה תא הידנית או האוטומטית.
הערה: הפתרון סוכרוז 10% (w/v) היא מדיום מול, ללא יונית זה מאפשר תחזוקה התא ומונעת פפטיד gelation במהלך תהליך ערבוב. - Centrifuge התליה תא 60 x g ו- RT עבור 5 דק. הסר תגובת שיקוע והשהה בגדר תא שוב בהיקף הדרוש של 10% (w/v) סוכרוז להשיג להכפיל את הריכוז תא הסופי הרצוי (recommendable כ 4 x 106 תאים / mL).
- הכנס מספר הרצוי של תרביות רקמה מוסיף כל טוב של צלחת 6-טוב (אחד insert לכל כימוס).
- Sonicate הפתרון פפטיד מוכן בשלב 1 כוח מרבי, RT במשך 5 דקות.
- פיפטה, המקום µL 40 של התליה תא (להשיג ב- 2.3) עבור כל כימוס הרצוי ובנוסף כ- 10 – 15% נפח נוסף לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה רגילה.
3. תלת-ממד תא כימוס לתוך לטמבלים
- לערבב של נפח שווה RAD16-אני הפתרון ב 10% סוכרוז (w/v) (40 µL לכל כימוס) עם אמצעי אחסון שווה של התליה תא (40 µL לכל כימוס) מוכן בשלב 2 כדי לקבל השעיה של תאים ירידה בריכוז פפטיד הרצוי (ב 10% סוכרוז). מערבבים על-ידי pipetting באיטיות לאורך כ 10 פעמים. למנוע היווצרות בועה במהלך ערבוב.
הערה: שלב זה הוא קריטי, חייב להתבצע בזהירות רבה מאז התאים נמצאים בתנאים עוינים עקב פפטיד pH נמוך (כ 3.5-4.0). - שימוש של micropipette, טען בקפידה µL 80 של ההשעיה כל הוספה.
- להוסיף 0.5 מ"ל של תרבות התקשורת לתחתית הבאר להרטיב את הכנס רפידה, המאפשר תקשורת דיפוזיה לקדם פפטיד הרכבה עצמית ויצירת הידרוג. תן את פפטיד ג'ל למשך כ 20 דקות בארון זרימה.
הערה: המניפולציה של הדגימות במהלך הגדרת זמן יכול להסתיים שבירת ג'ל. - לאט לאט להוסיף 40 µL בינוני הכנס ולתת לו להחליק החומה הפנימית לג'ל.
הערה: בדרך כלל, הטעינה של אמצעי אחסון זה צריך לקחת בין 20 – 30 s. - מקם את הצלחת בחממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, אווירה humidified) במשך 20 דקות. זה שלב ותוספות בינוני רצופים יעדיפו שטיפת של סוכרוז, equilibration של תאים עם תרבות בינוני.
- להוסיף µL 60 בינוני החומה הפנימית של הקדמי, ולאפשר לו לזרום מטה לאורך הקיר. האחות המדיום של הבאר, שהינו עשיר סוכרוז, ולהוסיף 0.5 מיליליטר בינוני טריים.
- להוסיף µL 60 בינוני לאט הכנס ולמקם את הצלחת בחממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, אווירה humidified) למשך 10 דקות.
- האחות המדיום היטב ולהוסיף 2.5 מ ל בינוני טריים לתוך הבאר. להוסיף 200 µL בינוני תותב. מקם את הצלחת בחממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, אווירה humidified) כדי לשמור את התאים בתנאים המתאימים.
- לשנות את המדיום כל יום. הסר את המדיום הישן מתחתית הבאר. להוסיף 2.5 מ ל בינוני טריים µL טוב ל- 200 הכנס.
הערה: אם תאית התמיינות נמשכת, התקשורת inducing ספציפיים יתווספו התרבויות, וכתוצאה מכך המחויבות סוג התא הרצוי (ראה להלן, תא בידול).
4. תא הכדאיות ב- 3D-לטמבלים
- הערה: תא הכדאיות וזמינותו ידועה בשם המתים/Live — הכדאיות/Cytotoxicity assay גם כן.
- בשפופרת 15 מ"ל, להכין את אמצעי האחסון הדרושים של פתרון טריים של calcein מיקרומטר 2 בבוקר ו- 2 מיקרומטר של אתידיום homodimer-1 (EthD-1) ב- PBS מאת vortexing עבור 10 ס' לשמור בחושך.
הערה: עוצמת הקול כדי לשמש עבור כל דגימה יהיה תלוי בגודל טוב על פי האפשרויות הבאות: mL 2 עבור כל טוב של צלחת 6-multiwell; 1 מ"ל לכל אחד טוב של צלחת 12-multiwell ו- 0.5 מ עבור כל טוב של צלחת 24-multiwell. - שימוש של micropipette, לשטוף את הדגימות 3D-לטמבלים 3 פעמים עם 2 מ"ל ל- PBS, ואז, לכסות את זה עם הפתרון המוכן בשלב 4.1. תקופת דגירה זה ב RT של 40 דקות בחושך.
- שימוש של micropipette, יש לשטוף את בונה עם 2 מ של PBS 5 פעמים.
- דמיינו את הדגימות תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות באמצעות 10 X או 20 X הגדלה.
5. תאית התמיינות
- התרבות תאים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, אווירה humidified) ב Chondrocyte הבזליים בינוני (CBM) עם צמיחה תוספי.
הערה: הכנת המדיום מתואר בהוראות היצרנים (ראו טבלה חומרים). - זירוז תאית התמיינות ביום 2 עם chondrogenic בינוני המכיל רקומביננטי האדם צורה של גורם גדילה-b1 [TGFb1] (10 ng/mL), חומצה אסקורבית L 2-פוספט [AA2P] (25 µg/mL), דקסמתזון (100 ננומטר).
- לשמור על התרבות 4 שבועות באינקובטור עם אווירה humidified-CO 37 ° C ו-5%2. שינוי chondrogenic בינוני בכל יום אחר.
6. טולדין כחול (TB) מכתים
- לשטוף את התרבויות 3D-לטמבלים פעמיים על-ידי הוספה והסרה ואז 2 מ של PBS עם micropipette. לתקן אותם על-ידי הוספת 2 מ של 2% (w/v) p-פורמלדהיד ב- PBS עבור 2 h-RT.
- לשטוף פעמיים עם 2 מ של 0.1% X-100 Triton ב- PBS (PBST).
- דגירה 2 מ של טרה-בתים 0.05% במים למשך 20 דקות ב- RT.
- לשטוף מספר פעמים (לפחות 3 פעמים) עם 2 מ של PBS עד הפתרון PBS הוסר ברור.
- ניתוח דוגמאות על ידי בדיקה חזותית תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי11,13,14.
הערה: טרה-בתים יוצרת קומפלקסים עם glycoconjugates anionic-מטריצה חוץ-תאית, כגון proteoglycans (עמוד), glycosaminoglycans (איסור פרסום), אשר מופרשים בעיקר על ידי תאים, כמו chondrocyte. דוגמאות חיוביות הן מוכתם כחול.
7. תספיג חלבון
הערה: ההליך בשימוש פרוטוקול זה תוארה בעבר התייחסות11.
- Lyse 3D-בונה ב ריפה מאגר המכיל פרוטאז מעכב קוקטייל על-ידי pipetting.
- הכנת ג'ל אקרילאמיד בהתאם לדרישות של אמצעי אחסון ג'ל (של ציוד ריצה ג'ל ספציפי) ולהפעיל את lysates תא במשך 90 דקות ב 150 V16.
הערה: ג'ל אקרילאמיד מוכן בדרך כלל בריכוז של 7.5-10% (w/v), תלוי משקל מולקולרי של החלבון. - העברת החלבונים הכלול את הג'ל לתוך קרום difluoride (PVDF) polyvinylidene על-ידי החלת ארבעים V 2 h-RT.
- דגירה קרום PVDF-RT עבור 2 h במאגר חסימה (4% (w/v) ללא שומן אבקת חלב ב- PBST) במיכל נפרד עם נפח מספיק כדי לכסות את הקרום.
- דגירה הקרום-RT מאובטח עם נוגדנים ראשי-ריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל ב- PBST. עיין בטבלה חומרים.
- להוסיף נוגדנים משניים ריכוז של 1 מ"ג/מ"ל. ראו טבלת חומרים.
- הכינו את הקרום לגילוי hP עם המצע Chemiluminescent16. עיין בטבלה חומרים.
- קח תמונות chemiluminescent16.
Representative Results
בשנת העבודה הנוכחית, פרוטוקול פשוט ומהיר לתאים תרבות תלת-ממד באמצעות לטמבלים מתואר כדי לקבל נתונים כמותיים אמינים. לטמבלים יוצר microenvironment תלת-ממד עם מאפיינים ייחודיים המאפשרים תאים בתרבית בתנאים הרצויים כדי להמשיך תחזוקה התא, הפצה ו/או בידול3,4,5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12. בקבוצה שלנו, מספר מחקרים בוצעו באמצעות רקמת שומן אנושי הנגזר ובתאים (hAPC), chondrocytes במפרק האנושי המורחב (הע ח) ואנושי נורמלי עורי fibroblasts (hNDF) לתרבות, להרחיב, להבדיל אותם לתוך רקמת הסחוס כמו10,11,12. כאן, אנו מתארים את תרבות תלת-ממד, הבידול מחדש של האץ המורחב לתוך רקמות כמו סחוס, כפי שתואר לעיל11. לפיכך, אנו לתמצת התאים ב- 3D-לטמבלים, תרבות אותם במדיום אינדוקציה chondrogenic, כמתואר באיור 1 (ו בפרוטוקול). לאחר 24 שעות, הדגימות היו שקובעת הכדאיות עם וזמינותו הכדאיות/Cytotoxicity חי/מת. התוצאות מצביעות על אחוזים בודדים של תאים מתים (אדום) לאחר 5 ימים של כימוס, כמעט אין תאים מתים נצפו לאחר 4 שבועות של תרבות (איור 2). בשלב הבא, אנחנו מוכתם אותם גליקוזאמינוגליקן (איסור פרסום) להפקדה ב מטריצה חוץ-תאית באמצעות את טולדין כחול מכתימה את השיטה. כצפוי, הקבוצה אינדוקציה הגיב כראוי לטיפול, מראה חזק מכתים (איור 2).
לבסוף, סמנים מולקולריים של סמנים chondrogenesis ואת יתר, כולל קולגן מסוג I, II ו- X, נותחו על ידי תספיג חלבון (איור 3). סוג הקולגן שאני (COL1) נצפתה ב המערכות 2D and 3D אבל להקה התחתון של kDa ~ 130 (ייצוג החלבון COL1 בוגרת מעובד הניתנים להרכבה על מטריצות) נצפתה רק ב- 3D. תוצאה זו עולה בבירור כי תאים שעברו התמיינות בשלושה ממדים להמשיך בדרך יותר פיזיולוגית. למרבה הפלא, קולגן מסוג II (COL2) זוהה - כלהקה יחיד של מולקולרית המשקל הצפוי הנוכחי-מטריצה חוץ-תאית - רק ב מבנים תלת-ממד תרבותי בתנאים chondrogenic. לבסוף, קולגן מסוג X (COL10) התגלה ב- 2D ו- 3D בונה תרבותי בתנאים chondrogenic, המציינת מידה מסוימת של היפרטרופיה לאחר 4 שבועות של תרבות.
איור 1: ייצוג סכמטי של כימוס תא לתוך 3D-לטמבלים. ייצוג סכמטי העטיפה הע ח מתואר להשיג התאים התפזרו באופן אקראי בתוך 3D-הטיפשים. 1. הרכבה עצמית פפטיד לגרדום (לטמבלים) הכנה; 2. התא הכנה ההשעיה; 3- 3D-תא כימוס לתוך אידיוטים. שימו לב כי התרשים מראה רק צעדים 3.1 ל 3.4.
איור 2: תא chondrogenic וביצועים בידול בתרבויות 3D-לטמבלים. תא מכתים הכדאיות בנטילת 5 ימים ו- 4 שבועות של תרבות זוהה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (תאים חיים תאים מתים וירוק באדום). גודל ברים = 200 מיקרומטר. גנרל chondrogenesis מחויבות לאומדן טולדין כחולים מוכתמים (sulfated glycosaminoglycans בכחול) של מבנים תלת-ממד-לטמבלים בתרבית בתקשורת ובקרה chondrogenic. גודל ברים = 500 מיקרומטר. איור זה שונה מ- Recha ל'-סנצ'ו. et al. 11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: קולגן, ביטוי II ו- X של האץ שעברו chondrogenesis. הע ח תרבותי של טפט-2D, 3D-לטמבלים לאחר 4 שבועות ב chondrogenic מדיה ופקדים היו שקובעת את הביטוי של קולגן מסוג I (COL1), קולגן מסוג II (COL2) ו קולגן מסוג X (COL10). הביטוי אקטין שימש של בקרה פנימית. איור זה שונה מ- Recha ל'-סנצ'ו. et al. 11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
בעבר, הקבוצה שלנו ואחרים תיארו את השימוש פלטפורמות תרבות תלת מימדי (3D) עם תא מגוון מערכות3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13,14,15. בשנת העבודה הנוכחית, אנו מתארים שיטה קלה ומהימנה של קבלת התרבות 3D תאי גזע מערכות המתאימים לכל סוג של תאים בתרבית של כולל לכל סוג של תא פונקציונלי, עובריים או למבוגרים, או בסופו של דבר, תאים מתפקדות מבודד ביופסיות או גידולים, וכן הלאה. בנוסף, באופן עצמאי, אם בתאי גזע עובריים או מבוגר המקור יהיה להם קיבולת מחויבות שושלת היוחסין טוב יותר בסביבת 3D מאשר התרבות הקלאסית 2D מנות10,11,12, 13,14,15. לכן, התרבות תאים במערכת זו תוביל בידול לתוך מבנים דמויי רקמה תפקודית שיכול לשמש ביישומים שונים, מן וההתערבות תיקוני או משובי כדי רעילות פלטפורמות תרופתי.
הראו לנו רווח ברור בתפקוד התא. כי microenvironment תאית דומה לזה של רקמות טבעי מבחינת מבנה מטריצה של ביו-מכני, biophysical, ביולוגי פרמטרי. יחד עם זאת, המערכת הופך מורכב יותר, מספר הפרמטרים שצריכים להיות מוסדרים גם עליות, אשר כוללת את הצורך פלטפורמה התומכת חיצוניים (כגון מערכת זלוף פעיל כדי למנוע בעיות תופעות הקשורות בהעברת המוני ). תאים בתרבית three-dimensionally לבצע טוב יותר מבחינת וויסות פעולות חיוניות, כגון העברה, התפשטות, בידול. הם יכולים יוצרים רשתות מורכבות ומאפשר crosstalk הסלולר משופרת, וזה עד כה חיוניים תולדה של וגדל המבדילים ב- 3D. העובדה כי הורס יכול ליצור תנאים במבחנה דומה מייצג חלבונים אלה מטריצה חוץ-תאית יתרון שכן מחקר רציונלי של האפקט הפיק עבור כל רכיב המתווסף לגרדום (פקטורי גדילה, רב-סוכר או איתות פפטיד) יכולים להיות מועברים בקלות.
היתרונות ברורים של השימוש של אידיוטים בהשוואה פיגומים טבעיים אחרים, כגון קולגן מסוג I ו- Matrigel, הם הבאים: 1) לטמבלים הוא biomaterial סינתטי עם וריאציה מינימלי של אצוות ייצור אצווה; 2) לטמבלים יש את היכולת להיות functionalized עם מוטיבים פפטיד ספציפי; ו 3) מתנות לטמבלים נמוך biodegradability במבחנה, דבר המאפשר שמירה על הבונה 3D עם אותם מאפיינים biophysical, ביו-מכני, מבניים לאורך זמן. עם זאת, המגבלה של שימוש הורס לעומת אחרים פיגומים נמצאו במהלך השלב כימוס, שבו התאים נמצאים סביבה עוינת בשל ה-pH נמוך. לכן, זה צעד קריטי המתודולוגיה המתוארת. יתר על כן, חשוב לקבוע ריכוז לטמבלים עבור כל סוג תאים מסוים לפני התחלת כל ניסוי. זה חיוני, למעשה, כאשר תאים מתורבתים או לתוך אלה biomaterials, מאז כל סוג לתא מסוים יציגו תנאי הגידול biomechanical אופטימלית.
לבסוף, אנו מאמינים פבריקציה נוספת לסוג זה של biomaterial לגרדום ועיצוב לשפר את פיתוח מודלים 3D רקמות פיזיולוגיים ואמין יותר כדי לעזור תעשיית התרופות לפתח גישות טיפוליות טוב יותר עבור רפואה רגנרטיבית, סרטן או כל טיפול רפואי.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
למחקר שמתבצע על ידי המחברים נתמך בחלקה על ידי מענקים מן האיחוד האירופי תכנית המסגרת השביעית (האיחוד FP7/2007-2013) תחת גרנט הסכם מס 229239 ומן קרן אאו, גישוש מחקר שיתופי מחקר תוכנית חריפה הסחוס פציעה/הנגע/פגם (ה-CRP ACI) תחת הפרויקט Bioactive, פיגומים ביונים עבור התחדשות הסחוס (BIOCART).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human articular chondrocytes (Ach) | Lonza | CC-2550 | |
| RAD16-I peptide solution (PuraMatrix) | Corning | 354250 | |
| Sucrose (tissue culture grade) | Sigma | S0389 | |
| Cell culture inserts (0.4 µm pore, 12 mm diameter) | Millipore | PICM01250 | |
| Chondrocyte Basal Medium (CBM) | Lonza | CC-3217 | |
| SingleQuots of Growth Supplements | Lonza | CC-4409 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Lonza | DE14-801F | |
| Dexamethasone | Sigma | D8893 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate (AA2P) | Sigma | A8960 | |
| Human transforming growth factor-β1 (TGF-β1) | Millipore | GF111 | |
| RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Invitrogen | LC 2005 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34080 | |
| Anti-Actin | SCBT | sc-1615 | |
| Anti-Collagen I | Abcam | ab138492 | |
| Anti-Collagen II | Abcam | ab3092 | |
| Anti-Collagen X | Abcam | ab182563 | |
| Antigoat IgG-HRP | Abcam | ab97100 | |
| Anti-mouse IgG-HRP | Abcam | ab97023 | |
| Anti-rabbit IgG-HRP | Abcam | ab97051 |
References
- Aggeli, A., et al. Responsive gels formed by the spontaneous self-assembly of peptide into polymeric β-sheet tapes. Nature. 386, 259-262 (1997).
- Semino, C. E. Can we build artificial stem cell compartments? Journal of Biomedicine and Biotechnology. 3, 164-169 (2003).
- Kisiday, J., et al. Self-assembling peptide hydrogel fosters chondrocyte extracellular matrix production and cell division: implications for cartilage tissue repair. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 99, 9996-10001 (2002).
- Narmoneva, D. A., Vukmirovic, R., Davis, M. E., Kamm, R. D., Lee, R. T. Endothelial cells promote cardiac myocyte survival and spatial reorganization: implications for cardiac regeneration. Circulation. 110, 962-968 (2004).
- Genové, E., Shen, C., Zhang, S., Semino, C. E. The effect of functionalized self-assembling peptide scaffolds on human aortic endothelial cell function. Biomaterials. 26, 3341-3351 (2005).
- Garreta, E., Genové, E., Borrós, S., Semino, C. E. Osteogenic differentiation of mouse embryonic stem cells and mouse embryonic fibroblasts in a three-dimensional self-assembling peptide scaffold. Tissue Engineering. 12, 2215-2228 (2006).
- Sieminski, A. L., Semino, C. E., Gong, H., Kamm, R. D. Primary sequence of ionic self-assembling peptide gels affects endothelial cell adhesion and capillary morphogenesis. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 87 (2), 494-504 (2008).
- Semino, C. E. Self-assembling peptides: from bio-inspired materials to bone regeneration. Journal of Dental Research. 87 (2008), 606-616 (2008).
- Hernández Vera, R., et al. Interstitial fluid flow intensity modulates endothelial sprouting in restricted Src-activated cell clusters during capillary morphogenesis. Tissue Engineering Part A. 15 (1), 175-185 (2009).
- Castells-Sala, C., Martínez-Ramos, C., Vallés-Lluch, A., Monleón Pradas, M., Semino, C. In vitro development of bioimplants made up of elastomeric scaffolds with peptide gel filling seeded with human subcutaneous adipose tissue-derived progenitor cells. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (11), 3419-3430 (2015).
- Recha-Sancho, L., Semino, C. E. Heparin-based self-assembling peptide scaffold reestablish chondrogenic phenotype of expanded de-differentiated human chondrocytes. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (7), 1694-1706 (2016).
- Bussmann, B. M., et al. Chondrogenic potential of human dermal fibroblasts in a contractile, soft, self-assembling, peptide hydrogel. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10 (2), E54-E62 (2016).
- Recha-Sancho, L., Moutos, F. T., Abellà, J., Guilak, F., Semino, C. E. Dedifferentiated Human Articular Chondrocytes Redifferentiate to a Cartilage-Like Tissue Phenotype in a Poly (ε-Caprolactone)/Self-Assembling Peptide Composite Scaffold. Materials. 9 (6), 472 (2016).
- Recha-Sancho, L., Semino, C. E. Chondroitin Sulfate and Decorin based self-assembling scaffolds for cartilage tissue engineering. PlosOne. 11 (6), e0157603 (2016).
- Aloy-Reverté, C., Moreno-Amador, J. L., Nacher, M., Montanya, E., Semino, C. E. Use of RGD-Functionalized Sandwich Cultures to Promote Redifferentiation of Human Pancreatic Beta Cells After In Vitro Expansion. Tissue Engineering Part A. , (2017).
- Kurien, B. T., Scofield, R. H.
