Summary
यहां, हम स्वयं में 3d संस्कृति प्रणालियों-कोडांतरण पेप्टाइड पाड़ों को उपास्थि की तरह ऊतक में विभेदित मानव जोड़दार chondrocytes के भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं ।
Abstract
एक स्व-कोडांतरण nanofiber तीन आयामी (3 डी) पाड़ में संवर्धन कोशिकाओं के लिए एक उपयोगी तकनीक का वर्णन किया गया है । इस संस्कृति प्रणाली को बारीकी से गैर-ध्रुवीय ऊतक के संरचनात्मक सुविधाओं की नकल है कि एक वातावरण recreates । इसके अलावा, पाड़ के विशेष आंतरिक nanofiber संरचना यह दृश्य प्रकाश, जो माइक्रोस्कोपी के तहत नमूना के आसान दृश्य के लिए अनुमति देता है के लिए पारदर्शी बनाता है । यह लाभ काफी हद तक सेल प्रवास, संगठन, प्रसार, और भेदभाव और इस प्रकार विशिष्ट रंजक या जांच के साथ धुंधला द्वारा अपने विशेष सेलुलर समारोह के किसी भी विकास के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया था । इसके अलावा, इस काम में, हम इस प्रणाली के अच्छे प्रदर्शन का वर्णन करने के लिए आसानी से उपास्थि ऊतक में विस्तारित मानव जोड़दार chondrocytes के अंतर का अध्ययन । कोशिकाओं को आत्म में समझाया पेप्टाइड पाड़ों कोडांतरण और विशिष्ट परिस्थितियों में chondrogenesis को बढ़ावा देने के लिए किया गया । तीन आयामी संस्कृतियों प्रयोग के 4 हफ्तों के दौरान अच्छी व्यवहार्यता दिखाया । के रूप में की उंमीद है, नमूनों chondrogenic उत्प्रेरण के साथ प्रसंस्कृत (गैर प्रेरित नियंत्रण की तुलना में) toluidine नीले रंग के लिए जोरदार सकारात्मक दाग (जो दाग glycosaminoglycans (परिहास) कि अत्यधिक उपास्थि extracellular मैट्रिक्स में मौजूद हैं) और व्यक्त विशेष आणविक मार्करों, कोलेजन प्रकार मैं, द्वितीय और एक्स सहित, पश्चिमी ब्लाट विश्लेषण के अनुसार । इस प्रोटोकॉल के लिए प्रदर्शन आसान है और अनुसंधान प्रयोगशालाओं, उद्योगों में और प्रयोगशाला पाठ्यक्रमों में शैक्षिक उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Introduction
कई दशकों के लिए, स्तनधारी सेल संस्कृति प्रयोगात्मक शर्तों के तहत किया गया है शास्त्रीय दो आयामी (2d) संस्कृति व्यावहारिक और आर्थिक मुद्दों के कारण गैर शारीरिक पहलुओं की परवाह किए बिना का उपयोग कर । हालांकि इस संस्कृति प्रणाली के अध्ययन और सबसे आणविक और सेलुलर तंत्र को समझने में मदद करता है, हम आज पता है कि नए सेल संस्कृति मानदंड को और अधिक जटिल सेलुलर सिस्टम का अध्ययन करने की जरूरत है । इसलिए, तीन आयामी (3 डी) संस्कृति प्रणालियों के लिए एक microenvironment है कि शारीरिक रूप से, यांत्रिक और जैविक रूप से अधिक प्राकृतिक ऊतकों के समान है बहलाना की जरूरत है । हाल के वर्षों में, 3 डी संस्कृति प्रणालियों, सामांय में, शोधकर्ताओं और उद्योग के बीच अधिक प्रचलित हो गए है क्योंकि वे अध्ययन या स्क्रीनिंग जो कोशिकाओं में अंतरिक्ष में वृद्धि कर सकते है के एक नए मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं, सेल बनाने के लिए सेल या सेल करने वाली मैट्रिक्स बातचीत, पलायन और अंत में विशिष्ट कोशिका वंश में अंतर ।
इस पद्धति का समग्र लक्ष्य एक इन विट्रो सेलुलर microenvironment है कि vivo microenvironment में के करीब है बहलाना है । विशेष रूप से, सिंथेटिक स्वयं कोडांतरण पेप्टाइड पाड़ (SAPS) अद्वितीय गुणों के साथ एक प्रकार का पदार्थ है; यह नैनोमीटर के एक नेटवर्क रूपों-यांत्रिक और संरचनात्मक गुणों के साथ पेप्टाइड्स के बीच कमजोर बातचीत से बाहर कर दिया pores आकार प्राकृतिक extracellular मैट्रिक्स के समान । दूसरे शब्दों में, इस सामग्री के उपयोग के पीछे तर्क यह है कि यह वास्तव में एक 3 डी वातावरण है कि छद्म 3 डी ऊतकों या अंग इकाइयों को प्राप्त करने के लिए आदर्श है बनाता है । हालांकि, सबसे महत्वपूर्ण बात, 3 डी संदर्भ 3 डी संरचना नए जैविक कार्य है कि सामांय रूप से 2d संस्कृति प्लेटफार्मों में मौजूद नहीं है लाभ के लिए अनुमति देता है, जैसे ऊतक वास्तुकला से संबंधित गुण, बड़े पैमाने पर स्थानांतरण घटनाएं, सेल स्वरूप और अंततः ऊतक morphogenesis, जो भविष्य के अनुसंधान और कार्यात्मक ऊतकों और अंगों के विकास में महत्वपूर्ण कारक हैं1,2. इसके अलावा, अपने प्राकृतिक समकक्षों (कोलेजन, Matrigel) पर SAPS का एक फायदा यह है कि वे कमरे के तापमान पर बहुत स्थिर है और पद के लिए विशेष शर्तों की आवश्यकता नहीं है उत्पादन, वितरण या3,4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. SAPS को संभालना आसान है, जब वांछित; 3 डी जैल बस ईओण ताकत में वृद्धि या तटस्थता1,2के लिए पीएच समायोजन द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । अंत में, यहां वर्णित पद्धति बड़े पैमाने पर इन विट्रो में इस्तेमाल किया गया है रखरखाव, विकास को बढ़ावा देने के लिए, और chondrocytes, हेपैटोसाइट्स, endothelial कोशिकाओं, osteoblasts, न्यूरॉन कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह से सहित सेल प्रकार की एक संख्या के भेदभाव, भ्रूण और दैहिक स्टेम कोशिकाओं के रूप में3,4,5,6,7,8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14 , 15. वर्तमान कार्य में, हम मानव विस्तारित जोड़दार chondrocytes (hACh) को उपास्थि की तरह ऊतक में अंतर करने के लिए 3d संस्कृति प्रणाली के उपयोग का वर्णन पहले11वर्णित के रूप में करते हैं ।
यहाँ, SAPS का उपयोग कर एक 3d सिस्टम में संस्कृति कोशिकाओं के लिए एक विधि वर्णित है. इस सिंथेटिक सामग्री में, कोशिकाओं को पहले एक पेप्टाइड समाधान के साथ मिश्रित कर रहे हैं, जो बाद में स्वयं को प्रेरित है इकट्ठा, कोशिकाओं के आसपास nanometric आयामों का एक नेटवर्क बनाने और इसलिए वास्तव में एक 3 डी वातावरण बनाने (चित्रा 1) । यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि सेलुलर व्यवहार मैट्रिक्स कठोरता मूल्यों (यानी, प्रसार, प्रवास और भेदभाव) से प्रभावित है । इसलिए, एक आम methodological नियंत्रण एक ही कठोरता मूल्यों (संस्कृति दो आयामों पर) के साथ पेप्टाइड पाड़ के शीर्ष पर संस्कृति कोशिकाओं के लिए है ।
Protocol
1. स्व-कोडांतरण पेप्टाइड पाड़ (SAPS) की तैयारी
- पेप्टाइड RAD16 का एक ०.५% समाधान तैयार-मैं 20% (डब्ल्यू/वी) सुक्रोज में, एक माइक्रो-ट्यूब में । Sonicate के लिए पेप्टाइड समाधान 20 मिनट में एक अल्ट्रासोनिक स्नान में अधिकतम शक्ति और कमरे के तापमान पर (RT) सजातीय मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए ।
नोट: समाधान की मात्रा वांछित encapsulates की संख्या पर निर्भर करेगा तैयार किया जाना है । RAD16-I पेप्टाइड्स इन sonication शर्तों के तहत गिरावट पीड़ित नहीं है । - सुक्रोज वांछित अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 10% (डब्ल्यू/वी) की आवश्यक मात्रा के साथ १.१ कदम में तैयार पेप्टाइड समाधान पतला ।
ध्यान दें: एक महत्वपूर्ण कारक को ध्यान में रखना प्रारंभिक पेप्टाइड एकाग्रता का समायोजन अंतिम मैट्रिक्स कठोरता के बाद से इस पैरामीटर पर निर्भर करेगा है । RAD16-मैं पेप्टाइड समाधान 3 डी के वांछित अंतिम एकाग्रता की तुलना में अधिक ध्यान केंद्रित किया जाना चाहिए निर्माण । आम तौर पर, अंतिम RAD16-मैं पेप्टाइड का इस्तेमाल किया सांद्रता 0.15-0.5% (डब्ल्यू/ - सूक्ष्म मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए 20 मिनट के लिए आरटी में एक अल्ट्रासोनिक स्नान में पेप्टाइड समाधान युक्त माइक्रो-केंद्रापसारक ट्यूब रखें ।
नोट: पेप्टाइड समाधान, अगर तुरंत इस्तेमाल नहीं किया, 4 डिग्री सेल्सियस पर कई महीनों के लिए संग्रहीत किया जा सकता है ।
2. सेल सस्पेंशन की तैयारी
- सेल निलंबन केंद्रापसारक (trypsin उपचार के बाद प्राप्त) पर ६० x जी और आरटी के लिए 5 मिनट ।
- एक वैक्यूम लाइन से जुड़े एक पाश्चर पिपेट का उपयोग कर supernatant निकालें और 3 में सेल गोली निलंबित-10% (डब्ल्यू/वी) सुक्रोज एक micropipette का उपयोग कर के 5 मिलीलीटर । मैन्युअल या स्वचालित कक्ष काउंटर का उपयोग करके कक्षों की गणना करने के लिए आगे बढ़ें.
नोट: 10% (डब्ल्यू/वी) सुक्रोज समाधान एक isotonic और गैर ईओण मध्यम है कि सेल के रखरखाव के लिए अनुमति देता है और मिश्रण की प्रक्रिया के दौरान पेप्टाइड जमाना से बचा जाता है । - 5 मिनट के लिए ६० x g और RT पर सेल निलंबन की शुरुआत करें । supernatant निकालें और सेल गोली फिर से निलंबित 10% (डब्ल्यू/वी) के आवश्यक मात्रा में सुक्रोज को प्राप्त करने के लिए डबल वांछित अंतिम कोशिका एकाग्रता (सिफारिश लगभग 4 x 106 कोशिकाओं/ मिलीलीटर) ।
- एक 6-अच्छी तरह से थाली (encapsulation प्रति एक डालने) के एक अच्छी तरह से में ऊतक संस्कृति आवेषण की एक वांछित संख्या प्लेस ।
- 5 मिनट के लिए अधिकतम पावर और RT पर चरण 1 में तैयार पेप्टाइड समाधान Sonicate ।
- पिपेट और प्लेस ४० सेल निलंबन के µ एल (२.३ में प्राप्त) प्रत्येक encapsulation वांछित प्लस लगभग 10-अतिरिक्त मात्रा के 15% के लिए एक मानक माइक्रो-केंद्रापसारक ट्यूब में ।
3. SAPS में 3d सेल encapsulation
- मिश्रण RAD16 के एक बराबर मात्रा-मैं समाधान में 10% सुक्रोज (w/v) (४० µ l encapsulation प्रति) की एक बराबर मात्रा के साथ सेल निलंबन (४० µ l encapsulation प्रति) वांछित पेप्टाइड एकाग्रता में कोशिकाओं का निलंबन प्राप्त करने के लिए चरण 2 में तैयार (10% सुक्रोज में). pipetting धीरे से ऊपर और नीचे लगभग 10 बार मिश्रण । मिश्रण के दौरान बुलबुला गठन से बचें ।
नोट: यह कदम महत्वपूर्ण है और बहुत सावधानी से किया जाना चाहिए के बाद से कोशिकाओं कम पीएच पेप्टाइड (लगभग 3.5-4.0) के कारण शत्रुतापूर्ण शर्तों के तहत कर रहे हैं । - एक micropipette का प्रयोग, ध्यान से प्रत्येक डालने में निलंबन के ८० µ एल लोड ।
- संमिलित झिल्ली गीला करने के लिए अच्छी तरह के नीचे करने के लिए संस्कृति मीडिया के ०.५ मिलीलीटर जोड़ें, मीडिया प्रसार पेप्टाइड स्व विधानसभा और hydrogel गठन को बढ़ावा देने के लिए अनुमति दी । लगभग 20 मिनट के लिए पेप्टाइड जेल प्रवाह कैबिनेट में चलो ।
नोट: सेटिंग समय के दौरान नमूनों की हेरफेर जेल तोड़ने में समाप्त हो सकता है । - बहुत धीरे से डालने के लिए मध्यम के ४० µ एल जोड़ने और इसे जेल के भीतर दीवार नीचे स्लाइड ।
नोट: आम तौर पर, इस मात्रा की लोडिंग के बीच ले जाना चाहिए 20 – 30 एस. - 20 मिनट के लिए मशीन (३७ ° c, 5% सह2, humidified वातावरण) में थाली प्लेस । इस कदम और परवर्ती मध्यम वर्धन सुक्रोज और संस्कृति माध्यम के साथ कोशिकाओं के equilibration के नमकीन पानी एहसान होगा ।
- डालने की भीतरी दीवार को मध्यम के ६० µ एल जोड़ें, यह दीवार के नीचे प्रवाह करने के लिए अनुमति देता है । महाप्राण के माध्यम को अच्छी तरह से, जो सुक्रोज में समृद्ध है, और ताजा माध्यम की ०.५ मिलीलीटर जोड़ें ।
- जोड़ें ६० µ एल मध्यम धीरे डालने के लिए और मशीन में थाली जगह (३७ ° c, 5% सह2, humidified वातावरण) 10 मिनट के लिए ।
- महाप्राण को अच्छी तरह से मीडियम करें और २.५ मिलीलीटर ताजे मीडियम में अच्छी तरह से डालें । संमिलित करें में मध्यम के २०० µ l को जोड़ें । मशीन में थाली प्लेस (३७ ° c, 5% CO2, humidified वातावरण) के लिए उपयुक्त परिस्थितियों के तहत कोशिकाओं को बनाए रखने ।
- हर दिन माध्यम बदल जाते हैं । पुराने मीडियम को कुआं के नीचे से निकाल दें । अच्छी तरह से २.५ मिलीलीटर ताजा मध्यम और २०० µ एल डालने के लिए जोड़ें ।
नोट: यदि सेल भेदभाव जारी है, विशिष्ट उत्प्रेरण मीडिया संस्कृतियों में जोड़ दिया जाएगा, वांछित सेल प्रकार प्रतिबद्धता में जिसके परिणामस्वरूप (नीचे देखें, सेल भेदभाव) ।
4.3 डी में सेल व्यवहार्यता-SAPS
- नोट: सेल व्यवहार्यता परख के रूप में अच्छी तरह से जीवित/मृत-व्यवहार्यता/Cytotoxicity परख के रूप में जाना जाता है ।
- एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में, 10 एस के लिए भंवर द्वारा 2 µ m calcein AM और ethidium homodimer-1 (EthD-1) के 2 µ मीटर के एक ताजा समाधान की आवश्यक मात्रा तैयार करें । अंधेरे में रखें ।
नोट: प्रत्येक नमूने के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए मात्रा में निम्नलिखित के अनुसार अच्छी तरह से आकार पर निर्भर करेगा: एक 6-multiwell प्लेट के प्रत्येक कुआं के लिए 2 मिलीलीटर; एक 12-multiwell प्लेट और एक 24 multiwell प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह के लिए ०.५ मिलीलीटर की प्रत्येक अच्छी तरह के लिए 1 मिलीलीटर । - एक micropipette का उपयोग करना, 3 डी-SAPS नमूने 3 बार पंजाब के 2 मिलीलीटर के साथ कुल्ला, और फिर, यह कदम ४.१ में तैयार समाधान के साथ कवर किया । अंधेरे में ४० मिनट के लिए आरटी पर यह मशीन ।
- एक micropipette का उपयोग कर, 5 बार पंजाब के 2 मिलीलीटर के साथ निर्माण कुल्ला ।
- एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत नमूनों की कल्पना 10x या 20X आवर्धन का उपयोग कर ।
5. कोशिका विभेद
- विकास की खुराक के साथ Chondrocyte बेसल मध्यम (सीबीएम) में संस्कृति कोशिकाओं (३७ ° c, 5% CO2, humidified वायुमंडल) ।
नोट: माध्यम की तैयारी निर्माताओं के निर्देश में वर्णित है ( सामग्री तालिकादेखें) । - chondrogenic मध्यम रिकॉमबिनेंट मानव रूपांतरित विकास फैक्टर-b1 [TGFb1] (10 एनजी/एमएल), एल Ascorbic एसिड 2-फॉस्फेट [AA2P] (25 µ g/एमएल) और डेक्समेतएसॉनी (१०० एनएम) युक्त माध्यम से 2 दिन में सेल भेदभाव प्रेरित ।
- ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2पर एक humidified वातावरण के साथ एक मशीन में 4 सप्ताह के लिए संस्कृति को बनाए रखने । chondrogenic माध्यम हर दूसरे दिन बदलें ।
6. Toluidine ब्लू (टीबी) धुंधला
- 3 डी-SAPS संस्कृतियों को दो बार जोड़कर धो लें और फिर एक micropipette के साथ पंजाब के 2 मिलीलीटर निकाल दें । उंहें 2% की 2 मिलीलीटर (डब्ल्यू/वी) पी-formaldehyde में 2 ज के लिए आर टी में जोड़कर ठीक करें ।
- पंजाब (PBST) में ०.१% ट्राइटन X-१०० के 2 मिलीलीटर के साथ दो बार धो लें ।
- आरटी में 20 मिनट के लिए पानी में ०.०५% टीबी के 2 मिलीलीटर के साथ मशीन ।
- पंजाब के हल निकाले जाने तक कई बार धो लें (कम से कम 3 बार) पंजाब के 2 मिलीलीटर के साथ ।
- एक त्रिविम माइक्रोस्कोप के तहत दृश्य निरीक्षण द्वारा नमूनों का विश्लेषण11,13,14.
नोट: टीबी extracellular मैट्रिक्स, जैसे proteoglycans (स्नातकोत्तर) और glycosaminoglycans (झूठ) है, जो मुख्य रूप से chondrocyte की तरह कोशिकाओं द्वारा स्रावित कर रहे है पर anionic glycoconjugates के साथ परिसर रूपों । सकारात्मक नमूनों नीले दाग रहे हैं ।
7. वेस्टर्न ब्लाटर
नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग की गई कार्यविधि पहले संदर्भ11में बताई गई थी ।
- लाइसे 3d RIPA बफर pipetting द्वारा छेड़ने अवरोधक कॉकटेल युक्त में constructs ।
- जेल मात्रा आवश्यकताओं (विशिष्ट जेल चल उपकरण के) के अनुसार acrylamide जेल तैयार करने और १५० V16पर ९० मिनट के लिए सेल lysates चलाते हैं ।
नोट: Acrylamide जेल आमतौर पर 7.5 की एकाग्रता पर तैयार है-10% (डब्ल्यू/वी), है प्रोटीन आणविक वजन पर निर्भर करता है । - एक polyvinylidene difluoride (PVDF) झिल्ली में जेल में निहित प्रोटीन ४० वी के लिए 2 ज आरटी पर लागू करने से स्थानांतरण ।
- 2 एच के लिए आरटी पर PVDF झिल्ली बफर अवरुद्ध में मशीन (4% (डब्ल्यू/वी) PBST में नोनफेट पाउडर दूध) झिल्ली को कवर करने के लिए पर्याप्त मात्रा के साथ एक अलग कंटेनर में ।
- PBST में 1 मिलीग्राम/एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ 1 एच के लिए आरटी पर झिल्ली गर्मी । सामग्री तालिकादेखें ।
- 1 मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता में माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें । सामग्री तालिकादेखें ।
- एक Chemiluminescent सब्सट्रेट16के साथ हिमाचल प्रदेश का पता लगाने के लिए झिल्ली तैयार । सामग्री तालिकादेखें ।
- ले chemiluminescent छवियां16।
Representative Results
वर्तमान काम में, SAPS का उपयोग कर 3 डी में संस्कृति कोशिकाओं के लिए एक सरल और तेजी से प्रोटोकॉल विश्वसनीय गुणात्मक और मात्रात्मक डेटा प्राप्त करने के लिए वर्णन किया गया है । SAPS अद्वितीय गुण है कि वांछित शर्तों के तहत प्रसंस्कृत कोशिकाओं की अनुमति के लिए सेल के रखरखाव के लिए आगे बढ़ना है, प्रसार और/ , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12. हमारे समूह में, कई अध्ययनों से मानव वसा ऊतक व्युत्पंन जनक कोशिकाओं (hAPC) का उपयोग किया गया है, मानव जोड़दार chondrocytes (hACh) और मानव सामान्य अधययन fibroblasts (hNDF) के लिए संस्कृति का विस्तार, विस्तार और उंहें में अंतर उपास्थि की तरह ऊतक10,11,12. यहाँ, हम 3 डी संस्कृति और फिर से विस्तार hACh उपास्थि की तरह ऊतक में भेदभाव का वर्णन, के रूप में पहले11वर्णित. इसलिए, हम 3 डी में कोशिकाओं encapsulate-SAPS और उंहें chondrogenic प्रेरण माध्यम में संस्कृति, के रूप में चित्रा 1 में वर्णित (और प्रोटोकॉल में) । 24 घंटे के बाद, नमूनों की व्यवहार्यता के लिए जीना/मृत व्यवहार्यता के साथ मूल्यांकन किया गया/Cytotoxicity परख । परिणाम संकेत मिलता है कि कोशिकाओं के कुछ प्रतिशत (लाल) encapsulation के 5 दिनों के बाद मर चुके थे और लगभग कोई मृत कोशिकाओं संस्कृति के 4 सप्ताह (चित्रा 2) के बाद मनाया गया । अगले, हम उंहें glycosaminoglycan के लिए दाग (झूठ) extracellular मैट्रिक्स में बयान Toluidine नीला धुंधला विधि का उपयोग कर । जैसा कि उंमीद थी, प्रेरण समूह उपचार के लिए ठीक से जवाब दिया, मजबूत धुंधला (चित्रा 2) दिखा ।
अंत में, chondrogenesis और अतिवृद्धि मार्करों के आणविक मार्करों, कोलेजन प्रकार मैं, द्वितीय और एक्स सहित, पश्चिमी दाग (चित्रा 3) द्वारा विश्लेषण किया गया । कोलेजन प्रकार मैं (COL1) 2d और 3 डी सिस्टम में मनाया गया था, लेकिन ~ १३० केडीए के एक कम बैंड (प्रसंस्कृत परिपक्व COL1 प्रोटीन का प्रतिनिधित्व करने extracellular मैट्रिक्स में इकट्ठे हो) केवल 3 डी में मनाया गया । यह परिणाम स्पष्ट रूप से इंगित करता है कि तीन आयामों में भिंनता के चलते कोशिकाओं को अधिक शारीरिक तरीके से आगे बढ़ना है । उल्लेखनीय है, कोलेजन प्रकार द्वितीय (COL2) का पता लगाया गया था-extracellular मैट्रिक्स में मौजूद की उंमीद आणविक वजन के एक एकल बैंड के रूप में-केवल 3 डी में chondrogenic शर्तों के तहत संस्कृति का निर्माण । अंत में, कोलेजन प्रकार एक्स (COL10) दोनों 2d और 3 डी chondrogenic शर्तों के तहत संस्कृति का निर्माण में पता चला था, संस्कृति के 4 सप्ताह के बाद अतिवृद्धि के कुछ डिग्री का संकेत है ।
चित्रा 1:3 डी में सेल encapsulation के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व-SAPS । hACh encapsulation के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व बेतरतीब ढंग से 3d SAPS के भीतर फैलाया कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए वर्णित है. 1. स्व-कोडांतरण पेप्टाइड पाड़ (SAPS) की तैयारी; 2. सेल निलंबन की तैयारी; और 3. 3d सेल SAPS में encapsulation । ध्यान दें कि योजनाबद्ध केवल चरण ३.१ ३.४ करने के लिए दिखाता है ।
चित्रा 2: सेल प्रदर्शन और 3d SAPS संस्कृतियों में chondrogenic भेदभाव । सेल व्यवहार्यता 5 दिन और संस्कृति के 4 सप्ताह में प्रदर्शन एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप (लाल रंग में हरी और मृत कोशिकाओं में रहते कोशिकाओं) के तहत पता चला । स्केल पट्टियां = २०० µm. जनरल chondrogenesis प्रतिबद्धता द्वारा मूल्यांकन Toluidine नीला दाग (सल्फेट glycosaminoglycans नीले रंग में) 3d-SAPS का निर्माण कल्चरल कंट्रोल और chondrogenic मीडिया में होता है. स्केल बार्स = ५०० µm । यह आंकड़ा एल रेचा-साँचो एट अल से संशोधित किया गया है । 11. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: कोलेजन मैं, द्वितीय और एक्स अभिव्यक्ति hACh के दौर से गुजर chondrogenesis । hACh में एक 2d-monolayer में और 3 डी-SAPS chondrogenic मीडिया और नियंत्रण में 4 सप्ताह के बाद कोलेजन प्रकार मैं (COL1), कोलेजन प्रकार द्वितीय (COL2) और कोलेजन प्रकार एक्स (COL10) की अभिव्यक्ति के लिए मूल्यांकन किया गया । Actin अभिव्यक्ति एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया गया था । यह आंकड़ा एल रेचा-साँचो एट अल से संशोधित किया गया है । 11. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
Discussion
पहले, हमारे समूह और दूसरों को विविध सेल सिस्टम3,4,5,6,7,8 के साथ तीन आयामी (3 डी) संस्कृति प्लेटफार्मों के उपयोग का वर्णन किया है ,9,10,11,12,13,14,15। वर्तमान काम में, हम 3d कल्चर सिस्टम प्राप्त करने की एक आसान और विश्वसनीय विधि का वर्णन करते हैं जो किसी भी प्रकार के कार्यात्मक कोशिका, भ्रूण या वयस्क स्टेम कोशिकाओं, या अंततः, बेकार कोशिकाओं से पृथक सहित स्तनधारी कोशिकाओं के लिए लागू होते हैं बायोप्सी या ट्यूमर, और इतने पर। इसके अलावा, स्वतंत्र रूप से, यदि स्टेम सेल भ्रूण या वयस्क मूल के है वे 3 डी वातावरण में एक बेहतर वंश प्रतिबद्धता की क्षमता की तुलना में शास्त्रीय 2d संस्कृति व्यंजन10,11,12, 13,14,15. इसलिए, इस प्रणाली में कोशिका संस्कृति कार्यात्मक ऊतक में भेदभाव के लिए नेतृत्व की तरह संरचनाओं कि विभिंन अनुप्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है, प्रतिकारक या reअपक्षय से विषाक्तता और औषधीय प्लेटफार्मों के लिए है ।
हम सेल समारोह में एक स्पष्ट लाभ पता चला है क्योंकि सेलुलर microenvironment मैट्रिक्स संरचना और जैव यांत्रिक, भौतिक और जैविक मापदंडों के संदर्भ में प्राकृतिक ऊतकों के समान है । फिर भी, के रूप में प्रणाली और अधिक जटिल हो जाता है, मानकों की जरूरत है कि विनियमित किया जा करने की आवश्यकता है, जो एक बाहरी समर्थन मंच (जैसे कि एक सक्रिय छिड़काव प्रणाली जन स्थानांतरण घटना से बचने के लिए-जुड़े मुद्दों के रूप में शामिल है की जरूरत है ). तीन-आयामी प्रसंस्कृत कोशिकाएँ आवश्यक गतिविधियों को विनियमित करने के मामले में बेहतर प्रदर्शन करती हैं, जैसे कि प्रवास, प्रसार और विभेद. वे जटिल सेलुलर crosstalk, जो अब तक बढ़ रहा है और 3 डी में अंतर का एक अनिवार्य परिणाम है अनुमति नेटवर्क फार्म सकता है । तथ्य यह है कि SAPS उन extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन के समान इन विट्रो में शर्तों बना सकता है एक लाभ का प्रतिनिधित्व करता है प्रत्येक घटक के लिए उत्पादित प्रभाव का एक तर्कसंगत अध्ययन के बाद से पाड़ (विकास फैक्टर, polysaccharide या संकेतन करने के लिए जोड़ा पेप्टाइड) आसानी से किया जा सकता है ।
इस तरह के कोलेजन प्रकार मैं और Matrigel के रूप में अंय प्राकृतिक पाड़, की तुलना में SAPS के उपयोग के स्पष्ट लाभ, निंनलिखित हैं: 1) SAPS बैच उत्पादन के लिए बैच से ंयूनतम परिवर्तन के साथ एक सिंथेटिक सामग्री है; 2) SAPS विशिष्ट पेप्टाइड रूपांकनों के साथ कार्यात्मक होने की क्षमता है; और 3) SAPS इन विट्रो मेंकम biodegradability प्रस्तुत करता है, जो 3d के रखरखाव को समय के साथ ही, भौतिक, यांत्रिक और संरचनात्मक गुणों से निर्मित करने के लिए परमिट देता है । हालांकि, SAPS बनाम अंय पाड़ों का उपयोग करने की सीमा encapsulation कदम है, जहां कोशिकाओं को एक शत्रुतापूर्ण कम पीएच के कारण वातावरण में है के दौरान पाया जाता है । इसलिए, यह वर्णित पद्धति में एक महत्वपूर्ण कदम है । इसके अलावा, यह किसी भी प्रयोग शुरू करने से पहले प्रत्येक विशिष्ट कोशिका प्रकार के लिए SAPS एकाग्रता सेट करने के लिए महत्वपूर्ण है । यह है, वास्तव में, आवश्यक है जब कोशिकाओं पर या इन में, एक विशेष रूप से सेल प्रकार इष्टतम यांत्रिक विकास की स्थिति पेश करेंगे इन भौतिक भौतिकवाद में, संस्कृति रहे हैं ।
अंत में, हम मानते है कि डिजाइन और इस प्रकार के निर्माण के लिए और अधिक शारीरिक और विश्वसनीय 3d ऊतक मॉडल के विकास को बढ़ाने के लिए दवा उद्योग के लिए बेहतर चिकित्सकीय दृष्टिकोण विकसित करने में मदद करेगा अपक्षय चिकित्सा, कैंसर या किसी भी चिकित्सा उपचार ।
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखकों द्वारा की गई अनुसंधान अनुदान समझौते No. २२९२३९ के तहत यूरोपीय संघ सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (FP7/2007-२०१३) से अनुदान द्वारा भाग में समर्थित किया गया था, और ए ओ फाउंडेशन, खोजपूर्ण अनुसंधान सहयोगी अनुसंधान कार्यक्रम तीव्र से उपास्थि पुनर्जनन (स्कार्ट) के लिए परियोजना के लिए सक्रिय और Biomimetic पाड़ों के तहत एसीआई (सीआरपी) चोट/
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human articular chondrocytes (Ach) | Lonza | CC-2550 | |
| RAD16-I peptide solution (PuraMatrix) | Corning | 354250 | |
| Sucrose (tissue culture grade) | Sigma | S0389 | |
| Cell culture inserts (0.4 µm pore, 12 mm diameter) | Millipore | PICM01250 | |
| Chondrocyte Basal Medium (CBM) | Lonza | CC-3217 | |
| SingleQuots of Growth Supplements | Lonza | CC-4409 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Lonza | DE14-801F | |
| Dexamethasone | Sigma | D8893 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate (AA2P) | Sigma | A8960 | |
| Human transforming growth factor-β1 (TGF-β1) | Millipore | GF111 | |
| RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Invitrogen | LC 2005 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34080 | |
| Anti-Actin | SCBT | sc-1615 | |
| Anti-Collagen I | Abcam | ab138492 | |
| Anti-Collagen II | Abcam | ab3092 | |
| Anti-Collagen X | Abcam | ab182563 | |
| Antigoat IgG-HRP | Abcam | ab97100 | |
| Anti-mouse IgG-HRP | Abcam | ab97023 | |
| Anti-rabbit IgG-HRP | Abcam | ab97051 |
References
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