Summary
ここでは、自己組織化ペプチドのひと関節軟骨細胞の脱分化型軟骨への分化を促進する足場の 3 D 培養システムを取得するためのプロトコルを提案する.
Abstract
自己組織化ナノファイバーの三次元 (3 D) の足場に細胞を培養するための便利な方法を説明します。この培養システムは、非偏光組織の構造的特徴によく似た環境を再現します。さらに、足場の特定の組み込みナノファイバー構造、透明視覚的な光、顕微鏡の下でサンプルの簡単な可視化を可能にします。この利点は、特定の染料やプローブの染色による細胞遊走・組織、増殖と分化・従って彼らの特定の細胞機能の開発を研究に使用された主。さらに、この作業で簡単に軟骨組織に展開された人間の関節軟骨の再分化を研究するこのシステムの良好なパフォーマンスをについて説明します。細胞が自己ペプチドの足場の組み立てにカプセル化され、軟骨分化を促進するため、特定の条件下で培養しました。三次元培養実験の 4 週間の間に良い生存率を示した。予想通り、培養軟骨細胞誘導因子 (非誘導コントロールと比較して) のサンプル (これは高い軟骨の細胞外マトリックスに存在するグリコサミノグリカン (Gag) の汚れ) トルイジン ブルー強く陽性し、表現コラーゲンを含む特定の分子マーカーは、西部のしみの分析によると I、II、X を入力します。このプロトコルは、簡単に実行し、産業研究所と実験室のコースで教育の目的のために使用できます。
Introduction
数十年、哺乳類の細胞の文化は非生理的な側面に関係なく実用的、経済的問題のため古典的な 2次元 (2 D) 培養システムを用いた実験の条件下で実行されています。この培養系は、勉強し、最も細胞の分子機構を理解するのに役立ちます、我々 知って今日より複雑な細胞システムを勉強する新しい細胞文化パラダイムが必要であります。したがって、三次元 (3 D) 培養システム、生物物理学、生体力学的微小環境を再作成するために必要な生物学的自然組織のそれに類似。近年、3次元培養システム、一般となっている研究者や業界の間で流行研究の新しいモデルを表すのでまたはセルをすることができますスペースで成長、細胞間を作成または細胞-マトリックスの相互作用のスクリーニングに移行し、最終的に特定の細胞系統に分化します。
この方法論の全体的な目標は、体外細胞微小環境生体内微小環境に近いを再作成することです。特に、合成の自己組織化ペプチド足場 (SAP) は独自のプロパティを持つ生体材料の種類作ったペプチド力学的特性の間の弱い相互作用と同様自然な細胞外マトリックスのナノサイズ気孔のネットワークを形成します。つまり、この物質の使用の背後にある合理性は本当に 3 D 環境を作成それを擬似 3次元組織や臓器単位の取得に最適です。しかし、最も重要なは、3 D のコンテキストにより、通常は存在しない二次元文化のプラットフォームのような組織構造、物質移動現象に関連するプロパティへの細胞の新しい生物学的機能を得るために 3 D 構造と最終的に組織の形態形成、今後の研究で機能的な組織・臓器1,2の開発の重要な要因であります。また、SAP の (コラーゲン、マトリゲル) 自然相手以上の利点は常温で非常に安定していてポスト プロダクション、配布またはストレージ3,4,のための特別な条件を必要としません。5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. 液汁は簡単な操作で必要なとき3 D ジェル イオン強度を増やすことによってまたは中立1,2に pH を調整することによって単に得られます。最後に、ここで説明した方法論は維持、成長、そして数セルなど、軟骨細胞、肝細胞、血管内皮細胞、骨芽細胞、神経細胞と同様の分化を促進するために広く使用された生体外でされています。胚と体細胞の幹細胞3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. 本研究では前述11軟骨様組織に人間の拡張された関節軟骨 (ハック) を区別するために 3 D 培養システムの使用について述べる。
ここでは、SAP を使用して 3 D システムでの培養細胞に対するメソッドを説明します。この合成の生体材料で細胞は自己組織誘導されその後、ペプチドのソリューションと混合では最初セルの周りナノメートル寸法のネットワークを作成し、したがって、真の 3 D 環境 (図 1) を作成します。細胞挙動はマトリックス剛性値 (すなわち拡散・移行・分化) によって影響を受けることを考慮することが重要です。したがって、一般的な方法論的制御は、同じ剛性値 (2 つの次元に文化) を持つペプチドの足場の上に細胞を培養することです。
Protocol
1. 自己組織化ペプチド足場 (SAP) 準備
- ペプチド RAD16 の 0.5% 溶液を準備-20% (w/v) スクロース、マイクロ遠心管中の私。最大電力で室温均一な混合を確実に (RT) での超音波風呂で 20 分間ペプチド ソリューションを超音波照射します。
注: 準備するソリューションのボリュームが必要なカプセル化の数によって異なります。RAD16-私ペプチドこれら超音波照射条件下で劣化することはありません。 - 望ましい最終的な集中を取得するでは必要な量の 10% (w/v) ショ糖、1.1 準備ペプチド ソリューションを希釈します。
メモ: 最終的な行列剛性、このパラメーターによって異なりますので、考慮する重要な要因は初期ペプチド濃度の調整です。RAD16-私ペプチド ソリューションはより集中の 3 D 構築の目的の最終的な集中よりも x 2 をする必要があります。通常、最終的な RAD16-私使用されるペプチド濃度は 0.15-0.5% (w/v)。 - 均一な混合を確実に 20 分間常温超音波浴にペプチド ソリューションを含むマイクロ遠心チューブを配置します。
注: ペプチド ソリューションは、すぐに使用しない場合格納できる 4 ° C で数ヶ月
2. 細胞懸濁液の準備
- 遠心分離機の 5 分 x g と RT 60 セル中断 (トリプシン処理後に得られる)。
- 真空ラインに接続されているパスツール ピペットを使用して上澄みを除去し、マイクロ ピペットを使用して 10% (w/v) スクロースの 3-5 mL の細胞ペレットを中断します。手動または自動のセルのカウンターを使用してセルをカウントに進みます。
注: 10% (w/v) ショ糖液は、細胞維持のためでき、混合プロセスの間のペプチドのゲル化を避ける等張性および非イオン性媒体です。 - 5 分削除清 x g と RT 60 細胞懸濁液を遠心し、二重目的の最終セルの濃度を取得する 10% (w/v) ショ糖に必要な量の細胞ペレットを再度中断 (推奨約 4 x 106セル/mL)。
- 6 ウェル プレート (カプセル化毎 1 つ挿入) の各ウェルに組織培養挿入の必要な数を配置します。
- 5 分間最大消費電力と RT で手順 1 で、ペプチド溶液を超音波照射します。
- ピペット、標準マイクロ遠心チューブに余分なボリュームの約 10-15% プラス必要なカプセル化細胞懸濁液 (2.3 で得られた) の 40 μ L を配置します。
3. SAP に 3 D の細胞のカプセル化
- RAD16 の等量をミックス-私 (10% ショ糖溶液) で目的のペプチド濃度で細胞の懸濁液を入手する手順 2 で準備して 10% スクロース (w/v) (カプセル化毎 40 μ L) 細胞懸濁液 (40 μ L/カプセル化) の等量とのソリューション。上下に約 10 回ゆっくりとピペッティングで混ぜます。気泡の混合時を避けてください。
注: この手順は非常に重要です、低 pH ペプチド (約 4.0 3.5-) による敵対的な条件下での細胞のため、非常に慎重に行う必要があります。 - 各挿入に懸濁液の 80 μ L を読み込む慎重にマイクロ ピペットを使用して。
- ウェット挿入膜、自己組織化ペプチドを促進する拡散メディアを許して、ハイドロゲル形成に井戸の底に 0.5 mL の培地を追加します。流れのキャビネットで約 20 分のためのゲルのペプチドをしましょう。
注: ゲルの破断で時間設定中のサンプルの操作になるかもしれない。 - 非常にゆっくりと挿入する媒体の 40 μ L を追加し、せてゲル内部の壁をスライドさせます。
注: 通常、このボリュームのロードは、20-30 秒間かかる必要があります。 - 20 分のためのインキュベーター (37 ° C、5% CO2、加湿雰囲気) でプレートを配置します。このステップおよび連続する中追加は、ショ糖と細胞培養培地との平衡の溶出が優先されます。
- 壁をフローすることができます、挿入の内壁に媒体の 60 μ L を追加します。ショ糖が豊富であるだけでなく、培地を吸引し、新鮮な媒体の 0.5 mL を追加します。
- ゆっくりと挿入する媒体の 60 μ L を追加し、10 分のためのインキュベーター (37 ° C、5% CO2、加湿雰囲気) でプレートを配置します。
- 井戸の中を吸引し、井戸の中に新鮮な媒体の 2.5 mL を追加します。インサート中の 200 μ L を追加します。インキュベーター (37 ° C、5% CO2、加湿雰囲気) 適切な条件下で細胞を維持するために、プレートを配置します。
- 毎日、メディアを変更します。井戸の底から、古いメディアを削除します。挿入するも、200 μ L に新鮮な媒体の 2.5 mL を追加します。
注: 細胞分化が引き続き発生する場合特定の誘導メディアは目的のセル型コミットメント (以下、細胞分化を参照) の結果、文化に追加されます。
4 3 D 液汁でセル実行可能性
- 注: セル実行可能性の試金のライブ/デッドとして知られている-生存率/細胞毒性の試金と同様。
- 15 mL チューブでは 2 μ M カルセイン AM と 2 の新鮮なソリューションに必要な量を準備エチジウム ホモ-1 (EthD-1) PBS で暗闇の中で 10 s. 維持のボルテックスの μ M。
注: 各サンプルに使用するボリュームが以下の通りよくサイズによって決まる: 6 汚損プレートの各ウェルに 2 mL各 1 mL も 12 汚損プレート、24 汚損プレートの各ウェルに 0.5 mL。 - マイクロ ピペットを使用して、3 回に 2 mL の PBS、3 D SAP サンプルをすすいで、4.1 準備したソリューションでそれをカバーします。暗闇の中で 40 分間の室温でインキュベートします。
- マイクロ ピペットを使用して、リンス 2 ml の PBS の 5 回の構成です。
- 10 倍や 20 倍の倍率を使用して蛍光顕微鏡下で試料を可視化します。
5. 細胞分化
- 成長と培養細胞 (37 ° C、5% CO2、加湿雰囲気) 軟骨細胞基底媒体 (CBM) で補足します。
注: 媒体の準備説明はメーカーの指示 (表を参照)。 - 軟骨中含む組換え人間成長因子-b1 [TGFb1] の変換と 2 日目で細胞の分化を誘導する (10 ng/mL)、L-アスコルビン酸 2-リン酸 [AA2P] (25 μ g/mL) ・ デキサメタゾン (100 nM)。
- 37 ° C、5% CO2で加湿雰囲気のインキュベーターで 4 週間の文化を維持します。軟骨中に他の毎日を変更します。
6. トルイジン青染色 (TB)
- 3 D SAP 文化を追加およびマイクロ ピペットで 2 mL の PBS を削除することによって 2 回洗います。2% (w/v) pの 2 mL を追加することによってそれらを修正-室温 2 時間 PBS のホルムアルデヒド
- トリトン X-100 PBS (PBST) 0.1 %2 mL で 2 回洗浄します。
- 室温に 20 分間水の TB の 0.05 %2 mL と孵化します。
- 2 mL の PBS で、削除 PBS ソリューションがクリアされるまで (3 回以上) を複数回に洗います。
- 実体顕微鏡11,13,14の下で目視によるサンプルを分析します。
注: TB の複合体を形作る主に軟骨細胞のような細胞によって分泌される細胞外マトリックスのプロテオグリカン (PG) やグリコサミノグリカン (GAG) などの陰イオンの複合糖質と。肯定的なサンプルは青いステンド グラスが。
7 西部のしみ
注: このプロトコルで使用されるプロシージャ以前参照11説明だった。
- ピペッティングで RIPA バッファー含むプロテアーゼ抑制剤のカクテルで 3 D 構造を溶解させます。
- (特定のゲルのランニング用品) のゲル ボリューム要件に従ってアクリルアミドゲルを準備し、150 V16で 90 分のセル lysates を実行します。
注: アクリルアミドゲルは通常 7.5-10% (w/v)、タンパク質の分子量に応じて濃度を調製します。 - 室温 2 時間 40 V を適用することによって (PVDF) ブロッティングにゲルに含まれる蛋白質を転送します。
- 膜をカバーする十分なボリュームを別の容器に 2 時間ブロック バッファー (4% (w/v) 脱脂粉乳の pbst;) RT で PVDF 膜を孵化させなさい。
- 最終濃度 1 mg/mL PBST で一次抗体と 1 h の RT で膜を孵化させなさい。材料表を参照してください。
- 1 Mg/ml の濃度で二次抗体を追加します。材料表を参照してください。
- 化学発光基質16hP 検出のための膜を準備します。材料表を参照してください。
- 化学発光画像16を取る。
Representative Results
現在の仕事で SAP を使用して 3 D で培養細胞に対するシンプルでより高速なプロトコルは、信頼性の高い質的および量的なデータを取得する記述されています。SAP は、細胞維持、増殖や分化3,4,5,6に進むに必要な条件の下で培養細胞ことができるユニークな特性を 3次元微小環境を作成します,7,8,9,10,11,12. 当社グループでいくつかの研究ひと脂肪組織由来幹細胞 (hAPC)、拡張された人間の関節軟骨 (ハック) と通常真皮線維芽細胞 (hNDF) の文化を使用して実行されている、展開し、それらを区別するため軟骨のような組織の10、11,12。ここでは、上記11として 3次元培養し、軟骨のような組織に展開されたハックの再分化を説明します。したがって、我々 は、3 D SAP 内のセルをカプセル化し、前述の図 1 (とプロトコル) 軟骨誘導培地でそれらを文化します。24 h 後サンプルにライブ/デッド生存率/細胞毒性の試金の実行可能性の評価されました。結果を示す細胞の数パーセントが死んだ (赤) 文化 (図 2) の 4 週間後死んだ細胞は認められなかった 5 日、ほとんどのカプセル化の後。次に、我々 はトルイジン ブルー染色法を用いた細胞外マトリックス グリコサミノグリカン (GAG) 降下のそれらを染色しました。予想通り、誘導グループに対して正しく治療、強い染色 (図 2) を示します。
最後に、コラーゲンを含む軟骨分化・肥大症判別マーカーの分子マーカーはタイプ I、II、X、西部のしみ (図 3) によって分析されました。(COL1) で観察された 2 D と 3 D のシステムが (細胞外マトリックスで組み立てられるように処理された成熟した COL1 タンパク質を表す) ~ 130 kDa の低帯域型コラーゲンは、3 D でだけ観察されました。この結果は、3 つの次元で差別化を経るセルはより生理学的な方法で進むことを明らかに示します。驚くことに、軟骨の条件下で培養した 3 D 構造でのみ - 細胞外マトリックスで期待の分子量の存在の単一のバンドとして - コラーゲン タイプ II (COL2) が検出されました。最後に、X 型コラーゲン (COL10) は軟骨の条件下で培養した 2 D および 3 D の構造で検出された文化の 4 週間後肥大の程度を示します。
図 1: 3 D 液汁に電池を封止材の模式。3 D SAP 内でランダムに分散した細胞を取得するハック カプセル化の概略を説明します。1自己組織化ペプチド足場 (SAP) の準備;。2細胞の懸濁液の準備;。3.液汁に 3 D セル封止。図 3.1 に 3.4 の手順のみ表示することに注意してください。
図 2: 細胞 3 D SAP 文化パフォーマンスと軟骨分化します。細胞生存率染色蛍光顕微鏡 (赤で緑と死んだ細胞で生きているセル) で検出された文化の 4 週間と 5 日間で実行されます。スケール バー = 200 μ m. 一般的な軟骨コミットメント トルイジン ブルー染色 (硫酸化グリコサミノグリカン ブルー) 培養 3 D SAP 構造の制御と軟骨のメディアに評価。スケール バー = 500 μ m。この図は、L. Recha サンチョらから変更されています。11.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: コラーゲン、軟骨分化を受けてハックの II と X の式。2次元単層と 3 D 液汁を培養軟骨の 4 週間メディアとコントロール コラーゲンの発現を評価した後ハック タイプ I (COL1)、コラーゲン タイプ II (COL2) および X 型コラーゲン (COL10)。アクチンの発現は、内部統制として使用されました。この図は、L. Recha サンチョらから変更されています。11.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
以前は、私達のグループと他の人はさまざまな細胞システム3,4,5,6,7,8 三次元 (3 D) 文化のプラットフォームの使用を説明しました。、9,10、11,12,13,14,15。現在の仕事では、簡単で信頼性の高い方法を述べる三次元培養を取得のシステム機能を細胞、胚または大人の任意の種類を含む哺乳類セルの任意の型に適用される幹細胞、または機能不全の細胞がから分離された最終的には、生検、腫瘍などの.さらに、独立して、幹細胞は、胚や大人の場合彼らがない、リネージュ コミットメント能力に優れている古典的な 2D 文化料理10、11,12より 3 D 環境で 13,14,15。したがって、このシステムの細胞培養は、毒性学的及び薬理学的プラットフォームに修復や再生医学から、別のアプリケーションで使用できる機能の組織のような構造に分化に 。
細胞の微小環境は matrix 構造体と生体力学的、生物物理学的、生物学的パラメーターの面で自然な組織に似ているので、我々 は細胞機能の明確な利得を示しています。それにもかかわらず、システムが複雑になると、する必要があるパラメーターの数規制も増加、(物質移動現象に関連する問題を回避するアクティブな灌流システムなど外部サポート プラットフォームの必要性を含む).三次元培養細胞を移行、増殖、分化などの本質的な活動を規制する面でより良い実行します。彼らは、成長と 3 D での差別化の重要な結果ははるかに強化された細胞のクロストークが可能な複雑なネットワークを形成できます。樹液という事実が効果の合理的な研究から利点を足場 (成長因子、多糖類または通知に追加された各コンポーネントの生産それは細胞外マトリックス蛋白質表すと同様の培養条件作成ペプチド) が簡単に実施できます。
コラーゲン タイプ I およびマトリゲルなど他の自然な足場と比較して SAP の使用の明確な利点は、次: 1) SAP がバッチからバッチ生産に変化が少なく合成生体材料2) SAP; 特定のペプチドをモチーフに機能する容量があります。・ 3) SAP プレゼント生分解性低生体外で時間をかけて同じ生物物理学的、生体力学的、構造のプロパティを持つ 3 D 構造の維持を可能にします。対その他の使用制限がただし、樹液足場に細胞が低 pH による敵対的な環境の中で、カプセル化のステップの間にあります。したがって、これは記述の方法論の重要なステップです。さらに、実験を開始する前に特定のセル タイプごとに SAP 濃度を設定することが重要です。これは、実際には、細胞を培養しているまたはこれらの生体材料に特定のセル タイプごと最適な生体力学的成長条件が表示されますので、必須。
最後に、設計と生体材料足場のこのタイプの試作がに対するより良い治療法を開発する製薬業界を支援するより生理学的で信頼性の高い 3 D 組織モデルの開発を高めるだろうと考えてください。再生医療、癌または任意の治療。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者によって実行される研究は助成契約第 229239 の下で欧州連合第 7 フレームワーク プログラム (FP7/2007-2013) と、探索的研究共同研究プログラム急性 AO 財団からの助成金によって部分で支えられました軟骨損傷/病変/欠陥 (CRP ACI) 再建プロジェクトの下、バイオミメティック足場の軟骨再生 (BIOCART)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human articular chondrocytes (Ach) | Lonza | CC-2550 | |
| RAD16-I peptide solution (PuraMatrix) | Corning | 354250 | |
| Sucrose (tissue culture grade) | Sigma | S0389 | |
| Cell culture inserts (0.4 µm pore, 12 mm diameter) | Millipore | PICM01250 | |
| Chondrocyte Basal Medium (CBM) | Lonza | CC-3217 | |
| SingleQuots of Growth Supplements | Lonza | CC-4409 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Lonza | DE14-801F | |
| Dexamethasone | Sigma | D8893 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate (AA2P) | Sigma | A8960 | |
| Human transforming growth factor-β1 (TGF-β1) | Millipore | GF111 | |
| RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Invitrogen | LC 2005 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34080 | |
| Anti-Actin | SCBT | sc-1615 | |
| Anti-Collagen I | Abcam | ab138492 | |
| Anti-Collagen II | Abcam | ab3092 | |
| Anti-Collagen X | Abcam | ab182563 | |
| Antigoat IgG-HRP | Abcam | ab97100 | |
| Anti-mouse IgG-HRP | Abcam | ab97023 | |
| Anti-rabbit IgG-HRP | Abcam | ab97051 |
References
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