Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para obter sistemas 3D-cultura na auto montagem de andaimes de peptídeo para promover a diferenciação de condrócitos articulares humanas condrossarcoma em tecido de cartilagem, como.
Abstract
Uma técnica útil para o cultivo de células em um auto-montagem andaime nanofibras tridimensional (3D) é descrita. Este sistema de cultura recria um ambiente que imita pròxima as características estruturais do tecido não-polarizado. Além disso, a estrutura particular de nanofibras intrínseca do cadafalso torna transparente à luz visual, que permite a fácil visualização da amostra sob microscopia. Esta vantagem foi largamente usada para estudar a migração celular, organização, proliferação e diferenciação e, portanto, qualquer desenvolvimento de sua função celular específica pela coloração com corantes específicos ou sondas. Além disso, neste trabalho, descrevemos o bom desempenho deste sistema facilmente estudar o redifferentiation de condrócitos articulares humanos expandidos no tecido cartilaginoso. As células foram encapsuladas em auto montagem de andaimes de peptídeo e cultivadas sob condições específicas para promover a condrogênese. Culturas tridimensionais mostraram boa viabilidade durante as 4 semanas do experimento. Como esperado, amostras cultivadas com indutores de chondrogenic (comparados aos controles não-induzida) manchado fortemente positivas para o azul de toluidina (que manchas de glicosaminoglicanos (GAGs) altamente presentes na matriz extracelular da cartilagem) e expressa marcadores moleculares específicos, incluindo o colágeno tipo I, II e X, de acordo com a análise de Western Blot. Este protocolo é fácil de executar e pode ser usado em laboratórios de pesquisa, indústrias e para fins educacionais em cursos de laboratório.
Introduction
Por muitas décadas, cultura de células de mamíferos foi realizada sob condições experimentais usando sistemas clássica bidimensional (2D) cultura devido a problemas de práticos e econômicos, independentemente dos aspectos não-fisiológica. Embora este sistema de cultura ajuda a estudar e entender mais os mecanismos moleculares e celulares, hoje sabemos que novos paradigmas de cultura de células são necessárias para estudar sistemas celulares mais complexos. Portanto, sistemas tridimensionais (3D) cultura são necessários para recriar um microambiente que é base, biomecanicamente e biologicamente mais semelhante dos tecidos naturais. Nos últimos anos, sistemas de cultura 3D, em geral, tornaram-se mais prevalentes entre pesquisadores e indústria desde que eles representam um novo modelo de estudo ou de triagem em que as células podem crescer no espaço, criar célula a célula ou interacções célula-a-matriz, migrar e eventualmente se diferencie em linhagens de células específicas.
O objetivo geral desta metodologia é recriar um em vitro microambiente celular que está mais perto do microambiente no vivo . Em particular, o andaime de peptídeo de auto-montagem sintético (SAPS) é um tipo de biomaterial com propriedades únicas; forma uma rede de poros nanômetros de tamanho feito de interações fracas entre peptídeos com propriedades mecânicas e estruturais semelhantes as de matrizes extracelulares naturais. Em outras palavras, a racionalidade por trás o uso deste material é que ele cria um verdadeiramente 3D-ambiente que é ideal para a obtenção de tecidos de pseudo-3D ou unidades do órgão. No entanto, mais importante ainda, o contexto 3D permite que a estrutura 3D ganhar novas funções biológicas que normalmente não estão presentes em plataformas 2D de cultura, tais como propriedades relacionadas à arquitetura do tecido, fenômenos de transferência de massa, a padronização de células e, eventualmente, morfogênese de tecido, que são fatores-chave em futuras pesquisas e desenvolvimento de tecidos funcionais e órgãos1,2. Além disso, uma vantagem de sucos sobre os seus homólogos naturais (colágeno, Matrigel) é que eles são muito estáveis à temperatura ambiente e não necessitam de condições especiais para a pós-produção, distribuição ou armazenamento3,4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. sucos é fácil de manusear, quando desejado; Géis 3D podem ser obtidos simplesmente pelo aumento da força iônica ou ajustando o pH a neutralidade1,2. Finalmente, a metodologia descrita aqui tem sido extensivamente usado em vitro para promover a manutenção, crescimento e diferenciação de vários tipos de células, incluindo condrócitos, hepatócitos, células endoteliais, osteoblastos, células neuronais também como as células-tronco embrionárias e somática3,4,5,6,7,8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14 , 15. no presente trabalho, descrevemos a utilização de um sistema 3D-cultura para diferenciar condrócitos articulares expandidos humanos (HAC) em tecido de cartilagem-como, como descrito anteriormente,11.
Aqui, um método para células de cultura em um sistema 3D usando sucos é descrito. Neste biomaterial sintético, células primeiro são misturadas com uma solução de peptídeo, que posteriormente é induzida a auto-montagem, criando uma rede de dimensões nanométricas ao redor das células e, portanto, criar um ambiente verdadeiramente 3D (Figura 1). É importante considerar que o comportamento celular é afetado pelos valores de rigidez de matriz (ou seja, proliferação, migração e diferenciação). Portanto, um controle metodológico comum é células de cultura em cima do andaime de peptídeo com os mesmos valores de rigidez (cultura em duas dimensões).
Protocol
1. auto-montagem peptídeo andaime (SAPS) preparação
- Preparar uma solução de 0,5% de peptídeo RAD16-I em sacarose 20% (p/v), num tubo de centrífuga de micro. Proceda à sonicação a solução de peptídeo por 20 min em um banho ultra-sônico na potência máxima e à temperatura ambiente (RT) para garantir a mistura homogênea.
Nota: O volume da solução a ser preparada dependerá do número de encapsulamentos desejado. RAD16-eu peptídeos não sofrem degradação sob essas condições sonication. - Dilua a solução de peptídeo preparada no passo 1.1 com o volume necessário de sacarose 10% (p/v) para obter a concentração final desejada.
Nota: Um factor importante a ter em consideração é o ajuste da concentração inicial do peptide desde que a rigidez da matriz final dependerá este parâmetro. O RAD16-eu peptídeo solução deve ser 2x mais concentrado do que a concentração final desejada da construção de 3D. Normalmente, o RAD16 final-são concentrações de peptídeo usadas entre 0,15-0,5% (p/v). - Coloca o tubo de centrífuga de micro contendo a solução de peptídeo em um banho ultra-sônico em RT por 20 min para garantir a mistura homogênea.
Nota: A solução de peptídeo, se não usado imediatamente, pode ser armazenada por vários meses a 4 ° C.
2. preparação de suspensão de célula
- Centrifugar a suspensão de célula (obtida após o tratamento de tripsina) 60 x g e RT por 5 min.
- Remover o sobrenadante com uma pipeta Pasteur, conectada a uma linha de vácuo e suspender o centrifugado em 3-5 mL de sacarose 10% (p/v), utilizando uma micropipeta. Prossiga para contar células usando um contador de células manual ou automático.
Nota: A solução de sacarose a 10% (p/v) é um meio isotônico e não-iônicos que permite a manutenção da célula e evita a gelificação do peptide durante o processo de mistura. - Centrifugar a suspensão de eritrócitos em 60 x g e RT 5 min. Retire o sobrenadante e suspender o centrifugado novamente no volume necessário de sacarose 10% (p/v) para obter o dobro da concentração celular final desejado (recomendável aproximadamente 4 x 106 células / mL).
- Coloque um número desejado de inserções de cultura de tecido em cada poço de uma placa de 6 (uma inserção por encapsulamento).
- Proceda à sonicação a solução de peptídeo preparada na etapa 1 na potência máxima e RT por 5 min.
- Pipetar e coloque 40 µ l da suspensão celular (obtida no ponto 2.3) para cada encapsulamento desejado e mais cerca de 10 a 15% do volume extra em um tubo de centrífuga de micro padrão.
3. 3D celular encapsulamento em sucos
- Misturar um volume igual do RAD16-solução de sacarose 10% (p/v) (40 µ l por encapsulamento) com um volume igual da suspensão de eritrócitos (40 µ l por encapsulamento) preparada na etapa 2 para obter uma suspensão de células da concentração de peptídeo desejada (em 10% de sacarose). Misture pipetando lentamente subindo e descendo cerca de 10 vezes. Evite a formação de bolhas durante a mistura.
Nota: Este passo é fundamental e deve ser realizado com muito cuidado, desde que as células estão sob condições hostis devido o peptídeo de baixo pH (aproximadamente 3.5 – 4.0). - Utilizando uma micropipeta, cuidadosamente carrega 80 µ l da suspensão em cada inserção.
- Adicione 0,5 mL de meio de cultura para o fundo do poço para molhar a inserção da membrana, permitindo mídia de difusão promover o peptídeo auto-montagem e formação de hidrogel. Deixe o peptídeo gel para aproximadamente 20 min no gabinete fluxo.
Nota: A manipulação das amostras durante o tempo de presa pode acabar em gel de quebra. - Muito lentamente, adicionar 40 µ l de meio para a inserção e deixá-lo deslizar para baixo a parede interna para o gel.
Nota: Normalmente, o carregamento desse volume deve demorar entre 20 a 30 s. - Coloque a placa na incubadora (37 ° C, 5% de CO2, ambiente umidificado) por 20 min. Este passo e sucessivas adições médias favorecerá a lixiviação da sacarose e equilibrio de células com meio de cultura.
- Adicione 60 µ l de meio para a parede interna da inserção, permitindo que fluem para baixo da parede. Aspire o meio do poço, que é rico em sacarose, e adicionar 0,5 mL de meio fresco.
- Adicionar 60 µ l de meio devagar para a inserção e coloque a placa na incubadora (37 ° C, 5% de CO2, ambiente umidificado) por 10 min.
- Aspire o meio do poço e adicionar 2,5 mL de meio fresco dentro do poço. Adicione 200 µ l de meio para a inserção. Coloque a placa na incubadora (37 ° C, 5% de CO2, ambiente umidificado) para manter as células sob condições adequadas.
- Mude o meio todos os dias. Remova o antigo médio do fundo do poço. Adicione 2,5 mL de meio fresco para o bem e 200 µ l para a inserção.
Nota: Se a diferenciação celular continua, a mídia induzindo específica será adicionada para as culturas, originando o compromisso do tipo de célula desejado (veja abaixo, a diferenciação de células).
4. célula viabilidade em 3D-SAPS
- Nota: O ensaio da viabilidade celular é conhecido como Live/mortos — ensaio de viabilidade/citotoxicidade também.
- Em um tubo de 15 mL, preparar o volume necessário de solução fresca de 2 µM calceína AM e 2 µM de etídio homodímero-1 (EthD-1) em PBS por num Vortex para manter s. 10, no escuro.
Nota: O volume a ser usado para cada amostra dependerá do tamanho bem de acordo com o seguinte: 2 mL para cada poço de uma placa de 6-multiwell; 1 mL para cada bem de uma placa de 12-multiwell e 0,5 mL para cada poço da placa 24-multiwell. - Utilizando uma micropipeta, enxágue as amostras 3D-SAPS 3 vezes com 2 mL de PBS e em seguida, cubra-o com a solução preparada no passo 4.1. -Incube RT por 40 min no escuro.
- Utilizando uma micropipeta, enxágue as construções com 2 mL de PBS 5 vezes.
- Visualize as amostras sob um microscópio de fluorescência usando 10 X ou 20 X de ampliação.
5. diferenciação celular
- Células de cultura (37 ° C, 5% de CO2, ambiente umidificado) em condrócitos Basal Medium (CBM) com crescimento de suplementos.
Nota: A preparação do meio é descrita nas instruções dos fabricantes (ver Tabela de materiais). - Induzir a diferenciação celular, no dia 2 com chondrogenic médio contendo recombinante humana transformando o fator de crescimento-b1 [TGFb1] (10 ng/mL), ácido L-ascórbico 2-fosfato [AA2P] (25 µ g/mL) e dexametasona (100 nM).
- Manter a cultura por 4 semanas na incubadora com um ambiente umidificado a 37 ° C e 5% de CO2. Alterar chondrogenic médio todos os dias.
6. toluidina azul coloração (TB)
- Lave as culturas 3D-SAPS duas vezes, adicionando e removendo 2 mL de PBS com uma micropipeta. Corrigi-los, adicionando 2 mL de 2% (p/v) p-formaldeído em PBS por 2 h no RT
- Lave duas vezes com 2 mL de 0.1% Triton X-100 em PBS (PBST).
- Incube com 2 mL de 0.05% TB na água por 20 min no RT
- Lave várias vezes (pelo menos 3 vezes) com 2 mL de PBS até a solução de PBS removida é clara.
- Analise as amostras por inspeção visual, sob um microscópio estereoscópico11,13,14.
Nota: TB forma complexos com aniônicos glicoconjugados na matriz extracelular, como (PG) de proteoglicanos e glicosaminoglicanos (GAG), que principalmente são secretadas por células condrócitos. Amostras positivas são manchadas de azuis.
7. Western Blot
Nota: O procedimento utilizado no presente protocolo foi descrito anteriormente na referência11.
- Lyse 3D-construções em RIPA tampão contendo inibidor da protease cocktail pipetando.
- Prepare o gel do acrilamido de acordo com exigências de gel de volume (do equipamento funcionando gel específico) e executar os lisados celulares para 90 min em 150 V16.
Nota: O gel do acrilamido é usualmente preparado em uma concentração de 7,5 a 10% (p/v), dependendo do peso molecular da proteína. - Transferir as proteínas contidas no gel para uma membrana (PVDF) de difluoreto de polivinilideno aplicando 40 V para h 2 a RT
- Incube a membrana PVDF no RT para 2h em tampão de bloqueio (4% (p/v) de leite em pó desnatado em PBST) em um recipiente separado com volume suficiente para cobrir a membrana.
- Incube membrana no RT para 1 h com anticorpos primários em uma concentração final de 1 mg/mL em PBST. Consulte tabela de materiais.
- Acrescente os anticorpos secundários em uma concentração de 1 mg/mL. Consulte a tabela de materiais.
- Prepare a membrana para detecção de hP com um substrato quimioluminescente16. Consulte tabela de materiais.
- Tire fotos quimioluminescente16.
Representative Results
No presente trabalho, um protocolo simples e rápido para células de cultura em 3D usando sucos é descrito para obter dados qualitativos e quantitativos confiáveis. RPUS cria um microambiente 3D com propriedades únicas que permitem que as células cultivadas sob condições desejadas para proceder à manutenção da célula, proliferação e/ou diferenciação3,4,5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12. no nosso grupo, vários estudos têm sido realizados utilizando as células progenitoras do tecido adiposo humano derivado (hAPC), condrócitos articulares humanos expandidos (HAC) e fibroblastos dérmicos normais humanos (hNDF) para a cultura, expandir em diferenciá-los em tecido de cartilagem, como10,11,12. Aqui, descrevemos a cultura 3D e re-diferenciação de hACh expandido em tecido de cartilagem-como, como descrito anteriormente,11. Daí, podemos encapsular células em 3D-SAPS e cultura-los no meio de indução de chondrogenic, conforme descrito na Figura 1 (e no protocolo). Após 24 h, as amostras foram avaliadas para viabilidade com o ensaio de citotoxicidade de viabilidade/Live/mortos. Os resultados indicam que uma pequena porcentagem de células foram morta (vermelho), após 5 dias de encapsulamento e quase sem células mortas foram observadas após 4 semanas da cultura (Figura 2). Em seguida, nós lhes manchado para deposição de glicosaminoglicano (GAG) na matriz extracelular usando a azul método de coloração de toluidina. Como esperado, o grupo de indução respondeu corretamente ao tratamento, mostrando a forte coloração (Figura 2).
Finalmente, marcadores moleculares de marcadores condrogênese e hipertrofia, incluindo colágeno tipo I, II e X, foram analisadas por western blot (Figura 3). Colágeno tipo que eu (COL1) foi observada em sistemas de 2D e 3D, mas a banda inferior de kDa ~ 130 (representando a proteínas transformadas de COL1 madura para ser montado na matriz extracelular) observou-se apenas em 3D. Este resultado indica claramente que as células em fase de diferenciação em três dimensões avançar de forma mais fisiológica. Notavelmente, colágeno tipo II (COL2) foi detectado - como uma única banda do esperado peso molecular presente na matriz extracelular - somente em construções 3D cultivadas sob condições de chondrogenic. Finalmente, colágeno tipo X (COL10) foi detectado em construções de 2D e 3D, cultivadas sob condições de chondrogenic, indicando algum grau de hipertrofia após 4 semanas da cultura.
Figura 1: representação esquemática de encapsulamento de células em 3D-SAPS. Representação esquemática de encapsulamento a hACh é descrita para obter células aleatoriamente dispersadas dentro do 3D-SAPS. 1. auto montagem preparação de andaime (SAPS) peptídeo; 2. célula preparação de suspensão; e 3. 3D-célula encapsulamento em sucos. Observe que o diagrama esquemático mostra apenas passos 3.1 a 3.4.
Figura 2: celular diferenciação de desempenho e chondrogenic em culturas de 3D-SAPS. Coloracao de viabilidade celular realizada em 5 dias e 4 semanas de cultura detectado sob um microscópio fluorescente (células vivas nas células e inoperante em vermelho). Escala de barras = 200 µm. compromisso geral condrogênese avaliado pelo azul de toluidina coloração (sulfatados glicosaminoglicanos em azul) de construções 3D-SAPS cultivadas em meios de controle e chondrogenic. Escala de barras = 500 µm. Esta figura foi modificada de L. Recha-Sancho et al . 11. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: colágeno, expressão de hACh submetidos a condrogênese II e X. hACh cultivada em um monolayer-2D e em 3D-SAPS depois de 4 semanas em chondrogenic mídia e controles foram avaliados para a expressão do colágeno tipo I (COL1), colágeno tipo II (COL2) e colágeno tipo X (COL10). Expressão da actina foi usado como um controle interno. Esta figura foi modificada de L. Recha-Sancho et al . 11. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Anteriormente, o nosso grupo e outros descreveram o uso de plataformas tridimensionais (3D) cultura com célula diversos sistemas3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13,14,15. No presente trabalho, descrevemos um método fácil e confiável de se obter cultura 3D sistemas que são aplicáveis a qualquer tipo de células de mamíferos incluindo qualquer tipo de célula funcional, embrionário ou adulto células-tronco, ou eventualmente, disfuncionais células isolaram de biópsias ou tumores e assim por diante. Além disso, independentemente, se as células estaminais são de origem embrionária ou adulta têm uma melhor capacidade de compromisso linhagem no ambiente 3D do que na cultura 2D clássica pratos10,11,12, 13,14,15. Portanto, a cultura de pilha neste sistema conduziria à diferenciação em estruturas de tecido-como funcionais que podem ser utilizadas em aplicações diferentes, de Biomedicina reparativa ou regenerativa para plataformas toxicológicas e farmacológicas.
Mostramos um claro ganho em função da célula porque o microambiente celular é semelhante dos tecidos naturais em termos de estrutura matricial e parâmetros biomecânicos, biofísicos e biológicos. No entanto, como o sistema se torna mais complexo, o número de parâmetros que precisam ser regulamentados também aumenta, que inclui a necessidade de uma plataforma de apoio externa (por exemplo, um sistema de perfusão ativo para evitar problemas de associada a fenómenos de transferência de massa ). Tridimensionalmente culturas de células de melhor desempenho em termos de regulação de atividades essenciais, tais como a migração, proliferação e diferenciação. Eles podem formar redes complexas, permitindo a interferência celular reforçada, que é, de longe, uma consequência essencial do crescimento e diferenciação em 3D. O facto de sucos poderia criar condições em vitro semelhante a essas proteínas de matriz extracelular representa uma vantagem desde um estudo racional do efeito produzida por cada componente adicionado para o cadafalso (fator de crescimento, polissacarídeo ou sinalização peptídeo) poderia ser facilmente realizado.
As claras vantagens do uso de sucos em comparação com outros andaimes naturais, tais como colágeno tipo I e o Matrigel, são os seguintes: 1) SAPS é um biomaterial sintético com variação mínima do lote de produção de lotes; 2) sucos tem a capacidade de ser acrescida com motivos de peptídeo específico; e 3) presentes sucos de baixa biodegradabilidade em vitro, que permita a manutenção da construção 3D com as mesmas propriedades biofísicas, biomecânicas e estruturais ao longo do tempo. No entanto, a limitação do uso de sucos contra outros andaimes é encontrado durante a etapa de encapsulamento, onde as células estão em um ambiente hostil devido ao baixo pH. Portanto, este é um passo crítico na metodologia descrita. Além disso, é importante definir a concentração de sucos para cada tipo de célula específica antes de iniciar qualquer experimento. Isto é, de facto, essencial quando as células são cultivadas sobre ou para dentro esses biomateriais, desde que cada tipo de célula específica apresentará condições de crescimento biomecânica ideal.
Finalmente, acreditamos que o projeto e a fabricação deste tipo de andaime biomaterial aumentaria o desenvolvimento de modelos de tecido 3D mais fisiológica e de confiança para ajudar a indústria farmacêutica para desenvolver melhor as abordagens terapêuticas para medicina regenerativa, câncer ou qualquer tratamento médico.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
A pesquisa realizada pelos autores foi apoiada em parte por subsídios da União Europeia sétimo programa-quadro (FP7/2007-2013) sob Grant acordo n. º 229239 e da Fundação AO, exploratória pesquisa colaborativa pesquisa programa aguda Cartilagem ferimento/lesão/defeito (CRP ACI) no âmbito do projecto Bioactive e andaimes biomimético para regeneração de cartilagem (BIOCART).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human articular chondrocytes (Ach) | Lonza | CC-2550 | |
| RAD16-I peptide solution (PuraMatrix) | Corning | 354250 | |
| Sucrose (tissue culture grade) | Sigma | S0389 | |
| Cell culture inserts (0.4 µm pore, 12 mm diameter) | Millipore | PICM01250 | |
| Chondrocyte Basal Medium (CBM) | Lonza | CC-3217 | |
| SingleQuots of Growth Supplements | Lonza | CC-4409 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Lonza | DE14-801F | |
| Dexamethasone | Sigma | D8893 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate (AA2P) | Sigma | A8960 | |
| Human transforming growth factor-β1 (TGF-β1) | Millipore | GF111 | |
| RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Invitrogen | LC 2005 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34080 | |
| Anti-Actin | SCBT | sc-1615 | |
| Anti-Collagen I | Abcam | ab138492 | |
| Anti-Collagen II | Abcam | ab3092 | |
| Anti-Collagen X | Abcam | ab182563 | |
| Antigoat IgG-HRP | Abcam | ab97100 | |
| Anti-mouse IgG-HRP | Abcam | ab97023 | |
| Anti-rabbit IgG-HRP | Abcam | ab97051 |
References
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