Summary
Aquí, presentamos un protocolo para obtener sistemas 3D-cultura en uno mismo-montaje de andamios péptido para promover la diferenciación de condrocitos articulares humanos dedifferentiated en tejido similar al cartílago.
Abstract
Se describe una técnica útil para el cultivo de células en un uno mismo-montaje andamio nanofibras de (3D) tridimensional. Este sistema de cultivo recrea un entorno que imita muy de cerca las características estructurales del tejido no polarizado. Además, la estructura particular de nanofibras intrínseca del andamio es transparente a luz visible, que permite la fácil visualización de la muestra bajo microscopio. Esta ventaja en gran parte se utilizó para estudiar la migración de la célula, organización, proliferación y diferenciación y así cualquier desarrollo de su función celular mediante tinción con colorantes específicos o sondas. Además, en este trabajo, describimos el buen funcionamiento de este sistema para estudiar fácilmente la redifferentiation de condrocitos articulares humanos ampliado en tejido cartilaginoso. Las células fueron encapsuladas en uno mismo-montaje de andamios de péptido y cultivadas bajo condiciones específicas para promover la condrogénesis. Las culturas tridimensionales demostraron buena viabilidad durante las 4 semanas del experimento. Como era de esperar, las muestras cultivadas con inductores condrogénica (en comparación con controles no inducido) teñido fuertemente positivas para el azul de toluidina (que tiñe los glicosaminoglicanos (GAGs) que están muy presentes en la matriz extracelular del cartílago) y expresó los marcadores moleculares específicos, incluyendo colágeno tipo I, II y X, según análisis de Western Blot. Este protocolo es fácil de realizar y puede utilizarse en los laboratorios de investigación, industrias y propósitos educativos en los cursos de laboratorio.
Introduction
Por muchas décadas, se ha realizado cultivo celular mamífero bajo condiciones experimentales utilizando sistemas de dos dimensiones clásicas de la cultura (2D) debido a problemas prácticos y económicos sin tener en cuenta los aspectos no-fisiológico. Aunque este sistema de cultivo ayuda a estudiar y comprender los mecanismos moleculares y celulares más, hoy sabemos que son necesarios nuevos paradigmas de la cultura de célula para el estudio de sistemas celulares más complejos. Por lo tanto, los sistemas de cultivo (3D) tridimensional son necesarios para recrear un microambiente que es basada, biomecánicamente y biológicamente más similar a la de los tejidos naturales. En los últimos años, los sistemas de cultivo 3D, en general, se han convertido en más frecuentes entre los investigadores y la industria puesto que representan un nuevo modelo de estudio o investigación en la que las células pueden crecer en el espacio, crean célula a célula o célula a matriz interacciones, migrar y Finalmente diferenciarse en linajes de células específicas.
El objetivo general de esta metodología es recrear una en vitro microambiente celular que está más cerca el microambiente en vivo . En particular, el andamio peptide uno mismo-montaje sintético (PAE) es un tipo de biomaterial con propiedades únicas; forma una red de poros de tamaño nanómetro hecha de interacciones débiles entre péptidos con propiedades mecánicas y estructurales similares de matrices extracelulares naturales. En otras palabras, la racionalidad detrás del uso de este material es que se crea un verdadero entorno en 3D que es ideal para obtener unidades de órganos o tejidos de pseudo-3D. Sin embargo, lo más importante, el contexto 3D permite la estructura 3D ganar nuevas funciones biológicas que normalmente no están presentes en las plataformas 2D de la cultura, tales como propiedades relacionadas con la arquitectura del tejido, fenómenos de transferencia de masa, patrón de la célula y eventualmente morfogénesis de tejidos, que son factores clave en futuras investigaciones y desarrollo de los tejidos funcionales y órganos1,2. Por otra parte, una ventaja de SAPS sobre sus contrapartes naturales (colágeno, Matrigel) es que son muy estables a temperatura ambiente y no requieren condiciones especiales de post producción, distribución o almacenamiento3,4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. programas de ajuste estructural es fácil de manejar, cuando se desee; Geles 3D pueden obtenerse simplemente aumentando la fuerza iónica o ajustando el pH a la neutralidad1,2. Finalmente, la metodología aquí descrita ha sido ampliamente utilizado en vitro para promover el mantenimiento, crecimiento y diferenciación de varios tipos celulares, incluyendo condrocitos, hepatocitos, células endoteliales, osteoblastos, células neuronales, así como las células madre embrionarias y somáticas3,4,5,6,7,8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14 , 15. en el presente trabajo, describimos el uso de un sistema de 3D-cultura humana condrocitos articulares Ampliadas (hACh) se diferencian en tejido similar al cartílago como se describió anteriormente11.
Aquí, se describe un método para células en cultivo en un sistema 3D usando programas de ajuste estructural. En este biomaterial sintético, las células se mezclan primero con una solución del péptido, que posteriormente se induce a la uno mismo-montar, crear una red de dimensiones nanométricas alrededor de las células y por lo tanto, crear un ambiente verdaderamente 3D (figura 1). Es importante considerar que el comportamiento celular está afectada por valores de rigidez de matriz (es decir, proliferación, migración y diferenciación). Por lo tanto, un control metodológico común es a células en cultivo en la parte superior del andamio del péptido con los mismos valores de rigidez (cultura en dos dimensiones).
Protocol
1. uno mismo-montaje preparación de andamio (SAPS) de péptido
- Preparar una solución de 0,5% del péptido RAD16-I en 20% (p/v) de sacarosa, en un tubo de microcentrífuga. Someter a ultrasonidos la solución del péptido por 20 min en un baño de ultrasonidos a la máxima potencia y a temperatura ambiente (RT) para asegurar una mezcla homogénea.
Nota: El volumen de solución a preparar dependerá de la cantidad de encapsulados deseado. RAD16-me péptidos no sufren degradación en estas condiciones de sonicación. - Diluir la solución de péptido preparada en el paso 1.1 con el volumen necesario de sacarosa al 10% (w/v) para obtener la concentración final deseada.
Nota: Un factor importante a tener en cuenta es el ajuste de la concentración de péptido inicial ya que este parámetro depende de la rigidez de la matriz final. El RAD16-I solución péptido debe ser 2 x más concentrados que la concentración final deseada de la construcción 3D. Normalmente, el RAD16 final-las concentraciones de péptidos utilizadas son entre 0.15-0.5% (p/v). - Coloque el tubo de microcentrífuga que contiene la solución del péptido en un baño de ultrasonidos a temperatura ambiente durante 20 minutos para asegurar una mezcla homogénea.
Nota: La solución de péptidos, si no se utiliza inmediatamente, puede almacenarse durante varios meses a 4 ° C.
2. preparación de suspensión de célula
- Centrifugue la suspensión de células (obtenida después del tratamiento de la tripsina) en 60 x g y RT durante 5 minutos.
- Quite el sobrenadante con una pipeta Pasteur conectada a una línea de vacío y suspender el precipitado de células en 3 – 5 mL de sacarosa al 10% (w/v) utilizando una micropipeta. Proceder a contar las células usando un contador de células manual o automática.
Nota: La solución de sacarosa al 10% (p/v) es un medio isotónico y no iónico que permite el mantenimiento de células y evita la congelación del péptido durante el proceso de mezcla. - Centrifugue la suspensión de células a 60 x g y RT por 5 min, retirar el sobrenadante y suspender el precipitado de células otra vez en el volumen necesario de sacarosa al 10% (w/v) para obtener doble la concentración celular final deseada (recomendable aproximadamente 4 x 106 células / mL).
- Coloque un número deseado de inserciones de cultivo de tejidos en cada pocillo de una placa de 6 pozos (uno insertar por encapsulación).
- Someter a ultrasonidos la solución péptido preparada en el paso 1 a potencia máxima y RT durante 5 minutos.
- Pipeta y coloque 40 μl de la suspensión de células (obtenida en 2.3) para cada encapsulación deseada además de aproximadamente 10 – 15% de volumen adicional en un tubo de microcentrífuga estándar.
3. encapsulación de la célula 3D en SAPS
- Mezclar un volumen igual de la RAD16-I solución de sacarosa al 10% (w/v) (40 μl por encapsulación) con un volumen igual de la suspensión celular (40 μl por encapsulación) preparado en el paso 2 para obtener una suspensión de células en la concentración de péptido deseado (en el 10% de sacarosa). Mezclar mediante pipeteo lentamente arriba y abajo de aproximadamente 10 veces. Evitar formación de burbujas durante la mezcla.
Nota: Este paso es fundamental y debe realizarse con mucho cuidado ya que las células están bajo condiciones hostiles debido al péptido de bajo pH (aproximadamente 3.5 – 4.0). - Usando una micropipeta, cuidadosamente cargar 80 μl de la suspensión en cada inserto.
- Agregar 0,5 mL de medio de cultivo en el fondo del pozo para mojar la membrana insertar, permitiendo medios de difusión promover el peptide uno mismo-Asamblea y formación del hidrogel. Que el péptido gel durante aproximadamente 20 minutos en el gabinete de flujo.
Nota: La manipulación de las muestras durante el ajuste de tiempo podría terminar en la fractura del gel. - Muy lentamente agregar 40 μl de medio a la estufa y deje que se deslice hacia abajo la pared interna al gel.
Nota: Normalmente, la carga de este volumen debe tomar entre 20-30 s. - Colocar la placa en la incubadora (37 ° C, 5% CO2ambiente humidificado) durante 20 minutos. Este paso y sucesivas adiciones medio favorecerá la lixiviación de la sacarosa y equilibrado de las células con medio de cultivo.
- Añadir 60 μL de medio a la pared interna del parte movible, permitiendo que fluya hacia abajo de la pared. Aspire el medio del pozo, que es rico en sacarosa, y añadir 0,5 mL de medio fresco.
- Añadir 60 μL de medio poco a poco el prospecto y colocar la placa en la incubadora (37 ° C, 5% CO2ambiente humidificado) durante 10 minutos.
- Aspire el medio del pozo y agregar 2,5 mL de medio fresco en el pozo. Añadir 200 μL de medio en el inserto. Colocar la placa en la incubadora (37 ° C, 5% CO2, ambiente humidificado) para mantener las células en condiciones adecuadas.
- Cambiar el medio cada día. Quitar el viejo medio de la parte inferior del pozo. Añadir 2,5 mL de medio fresco para el bien y 200 μL para la inserción.
Nota: Si continúa la diferenciación de la célula, los medios de comunicación induce específica se añadirá a las culturas, dando como resultado el compromiso del tipo de célula deseada (véase abajo, diferenciación celular).
4. célula viabilidad en 3D-SAPS
- Nota: El ensayo de viabilidad celular se conoce como vivos o muertos, así como ensayos de viabilidad/citotoxicidad.
- En un tubo de 15 mL, preparar el volumen necesario de una solución fresca de calceína AM de 2 μm y 2 μm de etidio homodímero-1 (EthD-1) en PBS con un vórtex para 10 s. Mantenga en la oscuridad.
Nota: El volumen a utilizar para cada muestra dependerá el tamaño del bien según lo siguiente: 2 mL por cada pocillo de una placa multiwell de 6; 1 mL por cada pozo de una placa multiwell 12 y 0.5 mL para cada pocillo de una placa multiwell de 24. - Usando una micropipeta, enjuagar las muestras 3D-SAPS 3 veces con 2 mL de PBS y a continuación, cubrirla con la solución preparada en el paso 4.1. Incubar a temperatura ambiente durante 40 minutos en la oscuridad.
- Usando una micropipeta, enjuague las construcciones con 2 mL de PBS 5 veces.
- Visualizar las muestras bajo un microscopio de fluorescencia utilizando 10 X o 20 aumentos.
5. diferenciación de la célula
- Células en cultivo (37 ° C, 5% CO2ambiente humidificado) en condrocitos Basal media (CBM) con crecimiento suplementos.
Nota: La preparación del medio se describe en las instrucciones del fabricante (vea la Tabla de materiales). - Inducir la diferenciación celular en el día 2 con condrogénica medio humano recombinante que contiene transformación de factor de crecimiento-b1 [TGFb1] (10 ng/mL), ácido L-ascórbico 2-fosfato [AA2P] (25 μg/mL) y dexametasona (100 nM).
- Mantener la cultura por 4 semanas en una incubadora con un ambiente humidificado a 37 ° C y 5% CO2. Cambiar condrogénica medio día.
6. toluidina azul (TB) tinción
- Lave las culturas SAPS 3D dos veces por agregar y quitar luego 2 mL de PBS con una micropipeta. Corregir agregando 2 mL de 2% (w/v) p-formaldehído en PBS durante 2 h a TA.
- Lavar dos veces con 2 mL de 0,1% Tritón X-100 en PBS (SAFT).
- Incubar con 2 mL de la TB de 0.05% en agua por 20 min a TA.
- Lavar varias veces (por lo menos 3 veces) con 2 mL de PBS hasta que la solución de PBS quitada es clara.
- Análisis de las muestras por inspección visual bajo un microscopio estereoscópico11,13,14.
Nota: TB forma complejos con aniónicos glicoconjugados en la matriz extracelular, proteoglicanos (PG) y glicosaminoglicanos (GAG), que principalmente son secretadas por células condrocitos. Las muestras positivas se tiñen de azul.
7. Western Blot
Nota: El procedimiento utilizado en este protocolo fue descrito en la referencia11.
- Lyse 3D-construcciones en RIPA buffer que contiene inhibidor de la proteasa cóctel mediante pipeteo.
- Preparar el gel de acrilamida según los requisitos de volumen de gel (de los equipos corrientes de gel específico) y correr los lysates de la célula durante 90 minutos a 150 V16.
Nota: Gel de acrilamida es generalmente preparado a una concentración de 7.5 – 10% (w/v), dependiendo del peso molecular de la proteína. - Transferencia de las proteínas contenidas en el gel a una membrana (PVDF) de difluoruro de polivinilideno aplicando 40 V durante 2 h a TA.
- Incubar la membrana PVDF a temperatura ambiente por 2 h en buffer de bloqueo (4% (p/v) en polvo leche descremada en SAFT) en un contenedor separado con suficiente volumen para cubrir la membrana.
- Incubar la membrana a temperatura ambiente durante 1 h con anticuerpos primarios a una concentración final de 1 mg/mL en SAFT. Ver la tabla de materiales.
- Añadir anticuerpos secundarios a una concentración de 1 mg/mL. Consulte la tabla de materiales.
- Preparar la membrana para la detección de hP con un sustrato quimioluminiscente16. Ver la tabla de materiales.
- Tomar imágenes de quimioluminiscencia16.
Representative Results
En el presente trabajo se describe un protocolo simple y rápido a células en cultivo en 3D usando programas de ajuste estructural para obtener datos cualitativos y cuantitativos fiables. SAP crea un microambiente 3D con propiedades únicas que permiten a las células cultivadas bajo condiciones deseadas para proceder al mantenimiento celular, proliferación y diferenciación3,4,5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12. en nuestro grupo, varios estudios se han realizado con células progenitoras de tejido adiposo humano derivado (hAPC), condrocitos articulares humanos ampliado (hACh) y fibroblastos dérmicos normales humanos (hNDF) a la cultura, ampliar y diferenciarlos en tejido similar a cartílago10,11,12. Aquí, describimos la cultura 3D y rediferenciación de hACh ampliado en tejido similar a cartílago, como se describió anteriormente11. Por lo tanto, nos encapsulan las células en 3D-programas de ajuste estructural y la cultura les en medio de inducción condrogénica, como se describe en la figura 1 (y en el protocolo). Después de 24 h, las muestras se evaluaron la viabilidad con el ensayo de viabilidad de la citotoxicidad de vivos o muertos. Los resultados indican que un pequeño porcentaje de células fueron muerto (rojo) después de 5 días de encapsulación y casi células muertas no fueron observadas después de 4 semanas de la cultura (figura 2). A continuación, mancharon para el depósito de glicosaminoglicanos (GAG) en la matriz extracelular mediante la tinción de azul de toluidina. Como era de esperar, el grupo de inducción respondió adecuadamente al tratamiento, mostrando fuerte tinción (figura 2).
Finalmente, marcadores moleculares de los marcadores de la condrogénesis y la hipertrofia, incluyendo colágeno tipo I, II y X, se analizaron por western blot (figura 3). Colágeno de tipo que i (COL1) fue observado en los sistemas 2D y 3D, pero una banda inferior de ~ 130 kDa (que representa la proteína de COL1 madura procesada para ser ensamblada en la matriz extracelular) se observó sólo en 3D. Este resultado indica claramente que las células en diferenciación en tres dimensiones se debe proceder de una manera más fisiológica. Notable, colágeno tipo II (COL2) fue detectado - como una sola banda del esperado peso molecular presente en la matriz extracelular - sólo en construcciones 3D cultivadas bajo condiciones condrogénica. Por último, colágeno de tipo X (COL10) fue detectado en 2D y 3D construcciones cultivadas bajo condiciones condrogénica, indicando cierto grado de hipertrofia después de 4 semanas de la cultura.
Figura 1: representación esquemática de la encapsulación de la célula en 3D-SAPS. Representación esquemática de la encapsulación de hACh se describe para obtener las células dispersadas al azar dentro de las 3D-SAPS. 1. uno mismo-montaje preparación de andamio (SAPS) péptido; 2. célula de preparación de la suspensión; y 3. 3D-cell la encapsulación en SAPS. Observe que el esquema sólo muestra pasos 3.1 a 3.4.
Figura 2: rendimiento y condrogénica diferenciación en cultivos 3D-SAPS celular. Tinción de viabilidad celular se realiza en 5 días y 4 semanas de la cultura detectadas bajo un microscopio de fluorescencia (células vivas en las células verdes y muertas en rojo). Barras de escala = 200 μm. compromiso General condrogénesis por azul de toluidina tinción (sulfatados glycosaminoglycans en azul) de construcciones 3D savias cultivadas en medios de control y condrogénica. Barras de escala = 500 μm. Esta figura ha sido modificada desde la L. Recha-Sancho et al. 11. por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: colágeno I, II y X expresión de hACh en condrogénesis. hACh cultivada en una monocapa de 2D y en 3D-programas de ajuste estructural después de 4 semanas en condrogénica medios y controles se evaluaron la expresión de colágeno tipo I (COL1), colágeno tipo II (COL2) y colágeno de tipo X (COL10). Expresión de actina se utilizó como control interno. Esta figura ha sido modificada desde la L. Recha-Sancho et al. 11. por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Anteriormente, nuestro grupo y otros han descrito el uso de plataformas de la cultura (3D) tridimensional con célula diversos sistemas3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13,14,15. En el presente trabajo se describe un método sencillo y confiable de obtener cultura 3D sistemas que son aplicables a cualquier tipo de células de mamíferos incluyendo cualquier tipo de célula funcional, embrionaria o adulto células de vástago, o eventualmente, aislaron células disfuncionales de biopsias o tumores y así sucesivamente. Además, independientemente, si las células madre son de origen embrionario o adulto tendrían una mejor capacidad de compromiso de linaje en el entorno 3D que en 2D clásica de la cultura platos10,11,12, 13,14,15. Por lo tanto, el cultivo celular en este sistema daría lugar a la diferenciación en las estructuras como tejido funcionales que podrían ser utilizadas en diferentes aplicaciones, desde la biomedicina regenerativa o reparativa a plataformas toxicológicas y farmacológicas.
Hemos demostrado una ganancia clara en función de la célula porque el microambiente celular es similar a la de los tejidos naturales en cuanto a la estructura de la matriz y parámetros biomecánicos, biofísicos y biológicos. Sin embargo, como el sistema se vuelve más complejo, el número de parámetros que necesitan ser regulados también aumentos, que incluye la necesidad de una plataforma de apoyo externa (como un sistema de activa perfusión para evitar problemas asociados a fenómenos de transferencia de masa ). Las células cultivadas tridimensionalmente se desempeñan mejor en cuanto a la regulación de las actividades esenciales, como la migración, proliferación y diferenciación. Podrían formar redes complejas permitiendo mayor interferencia celular, que es en gran medida una consecuencia esencial de crecimiento y diferenciación en 3D. El hecho de que jugos podría crear condiciones en vitro similares a ésos matriz extracelular proteínas representa una ventaja desde un estudio racional del efecto producida por cada componente añadido al andamio (factor de crecimiento, polisacárido o señalización péptido) podría ser fácilmente realizado.
Las claras ventajas del uso de programas de ajuste estructural en comparación con otros andamios naturales, tales como colágeno tipo I y Matrigel, son los siguientes: 1) SAPS es un biomaterial sintético con mínima variación de lote a producción de hornada; 2) SAPS tiene la capacidad de ser funcionalizados con secuencias de péptidos específicos; y 3) presenta programas de ajuste estructural baja biodegradabilidad en vitro, que permite el mantenimiento de la construcción 3D con las mismas propiedades biofísicas, biomecánicas y estructurales en el tiempo. Sin embargo, la limitación del uso de jugos versus otros andamios se encuentra en la etapa de encapsulación, donde las células están en un ambiente hostil debido a bajo pH. Por lo tanto, este es un paso crítico en la metodología descrita. Por otra parte, es importante establecer la concentración de programas de ajuste estructural para cada tipo de célula específica antes de empezar cualquier experimento. Esto es, de hecho, esencial cuando las células se cultivan en o en estos biomateriales, ya que cada tipo de célula particular se presentan condiciones de crecimiento óptimo de biomecánica.
Por último, creemos que el diseño y la fabricación de este tipo de andamio de biomaterial mejoraría el desarrollo de modelos de tejido 3D más fisiológica y confiable para ayudar a la industria farmacéutica para desarrollar mejores enfoques terapéuticos para medicina regenerativa, cáncer o tratamiento médico.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
La investigación realizada por los autores fue apoyada en parte por subvenciones de la Unión Europea séptimo programa marco (FP7/2007-2013) bajo acuerdo de concesión no. 229239 y de la Fundación AO, exploratoria investigación colaborativa investigaciones programa aguda Cartílago daños/lesión, defecto (CRP ACI) bajo el proyecto Bioactive y biomiméticos andamios para regeneración de cartílago (BIOCART).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human articular chondrocytes (Ach) | Lonza | CC-2550 | |
| RAD16-I peptide solution (PuraMatrix) | Corning | 354250 | |
| Sucrose (tissue culture grade) | Sigma | S0389 | |
| Cell culture inserts (0.4 µm pore, 12 mm diameter) | Millipore | PICM01250 | |
| Chondrocyte Basal Medium (CBM) | Lonza | CC-3217 | |
| SingleQuots of Growth Supplements | Lonza | CC-4409 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Lonza | DE14-801F | |
| Dexamethasone | Sigma | D8893 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate (AA2P) | Sigma | A8960 | |
| Human transforming growth factor-β1 (TGF-β1) | Millipore | GF111 | |
| RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Invitrogen | LC 2005 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34080 | |
| Anti-Actin | SCBT | sc-1615 | |
| Anti-Collagen I | Abcam | ab138492 | |
| Anti-Collagen II | Abcam | ab3092 | |
| Anti-Collagen X | Abcam | ab182563 | |
| Antigoat IgG-HRP | Abcam | ab97100 | |
| Anti-mouse IgG-HRP | Abcam | ab97023 | |
| Anti-rabbit IgG-HRP | Abcam | ab97051 |
References
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