Prøvetagningsmetoder og forarbejdning af Biobank vævsprøver fra svin biomedicinsk modeller

Summary

Den praktiske anvendelse og ydeevne metoder til generering af repræsentative vævsprøver af svin dyremodeller for et bredt spektrum af downstream analyser i biobank projekter er demonstreret, herunder volumetry, systematisk stikprøveudtagning, og differentieret behandling af vævsprøver af kvalitative og kvantitative morfologiske og molekylære analyser former.

Abstract

I translationel medicinsk forskning blevet svin modeller stadigt mere populære. Overvejer den høje værdi af individuelle dyr, især af genmanipulerede svin, modeller, og det ofte begrænset antal tilgængelige dyr af disse modeller, etablering af (biobank) samlinger af tilstrækkeligt forarbejdede vævsprøver egner sig til en bredt spektrum af efterfølgende analyser metoder, herunder analyser ikke angivet på tidspunkt for prøvetagning, repræsenterer meningsfuld tilgange til at drage fuld fordel af translationel værdien af modellen. Om særlige forhold for svin anatomi oprettet omfattende retningslinjer for nylig for standardiseret generation af repræsentant, høj kvalitet prøver fra forskellige svin organer og væv. Disse retningslinjer er afgørende forudsætninger for reproducerbarhed af resultaterne og deres sammenlignelighed mellem forskellige undersøgelser og efterforskere. Registrering af grundlæggende data, såsom orgel vægte og diskenheder, bestemmelse af prøveudtagning placeringer og antal af vævsprøver skal genereres, samt deres orientering, størrelse, forarbejdning og trimning retninger, er relevante faktorer bestemmelse af generalizability og anvendeligheden af modellen for Molekylær, kvalitative og kvantitative morfologiske analyser. Her, en illustrativ, praktiske, trin for trin demonstration af de vigtigste teknikker for generation af repræsentant, multi-purpose biobank modellen fra svin væv er præsenteret. De metoder, der beskrives her omfatter bestemmelse af organ/væv diskenheder og tætheder, anvendelsen af en bind-vægtede systematisk stikprøveudtagning procedure for parenkymalt organer ved punkt-tælling, bestemmelse af omfanget af væv svind relateret til histologisk indlejring af prøver og generering af tilfældigt orienterede prøver for kvantitative analyser, stereological, såsom isotropic ensartede tilfældige (IUR) sektioner genereret af "Orientering" og "Isector" metoder og lodret uniform tilfældig (VUR) sektioner.

Introduction

I translationel medicin, svin er i stigende grad fælles til brug som store dyre modeller^1,2,3,4,5, på grund af flere fordelagtige ligheder mellem de svin og Human Anatomi og fysiologi og tilgængeligheden af etablerede Molekylær biologiske metoder giver mulighed for generation af skræddersyet, genetisk modificerede gris modeller for en bred vifte af sygdom betingelser^1,4.

Men i forhold til gnavere modeller, antallet af dyr af et respektive gris model, der kan være fastsat eksperimenter til enhver tid er begrænset. Dette er på grund af svin generation interval på ca. et år, og de finansielle og tidskrævende indsats kræves for generation af svin modeller og husdyrhold. Enkelte dyr af et svin model, samt de prøver, der kan genereres fra disse svin, er derfor meget værdifulde, især hvis genmanipulerede svin modeller og/eller langsigtede eksperimentelle emner (f.eks., sene komplikationer af kroniske sygdomme) er undersøgt i alderen enkeltpersoner^2,6,7.

I forbindelse med enhver undersøgelse, udførelsen af yderligere analyser, som ikke havde været planlagt i den oprindelige eksperimenterende design af undersøgelsen kunne senere vise sig for at være relevante, f.eks., at adresse særskilte spørgsmål som følge af tidligere opdaget uventede resultater. Hvis der ikke findes egnede prøver for sådanne yderligere forsøg, kan uforholdsmæssigt høje omkostninger og tidskrævende udgifter være nødvendigt at generere yderligere svin og vævsprøver. For at være forberedt på sådanne eventualiteter, betragtes generation af biobank samlinger af velbevarede back-up prøver af forskellige organer, væv eller bio-væsker, kvantitativt og kvalitativt egnet til en bred vifte af efterfølgende analyser, som en vigtig tilgang^2,6,7. Der følger optimale fordele fra et svin dyremodel, tilgængeligheden af tilstrækkelige biobank prøver også tilbyder den unikke mulighed for at udføre et bredt spektrum af forskellige analysemetoder på identiske prøvematerialer på en multi orgel niveau i den selvsamme individuelle dyr, f.eks.ved uddeling af vareprøver til forskere af forskellige arbejdsgrupper organiseret i en forskning netværk^2,6,7. Derudover bidrager de '' fremadskuende '' prøvetagningsmetode i biobanking også til en reduktion af antallet af dyr i en undersøgelse. Fordelene ved svin model biobanking har for nylig påvist i en multi orgel, multiomics undersøgelse, undersøge orgel krydstale i en genetisk modificerede svin model af langsigtede diabetes mellitus, ved hjælp af prøver fra München MIDY gris Biobank ².

Der er nogle ufravigelige krav biobank prøver skal generelt opfylde for pålidelighed og interpretability af resultaterne af de efterfølgende udført analyser. Prøverne skal genereres reproducerbar, og de skal være repræsentant, dvs, tilstrækkeligt afspejler de interesserede morfologiske og molekylære funktioner i væv/organ prøverne blev taget fra⁷. For at være egnet til en bred vifte af downstream analysetyper, skal prøverne indtages i tilstrækkelige mængder og forarbejdet i henhold til krav (herunder tid og temperaturforhold) af de forskellige analytiske metoder, herunder beskrivende histopatologisk analyser, såsom cryohistology, paraffin og plast histologi, immunhistokemi, i situ hybridisering, ultrastrukturelle elektron mikroskopisk analyser og klinisk diagnostisk laboratorieanalyser, såvel som Molekylær analyser af DNA, RNA, proteiner og metabolitter.

For at muliggøre vurdering af en bred vifte af forskellige kvantitative morfologiske parametre som tal, mængder, længder eller overfladen områder af forskellige væv strukturer af kvantitative stereological analyser, randomiseret afsnit fly af den histologiske prøver af de respektive organer/væv skal være forberedt^7,8,9,10,11. I kvantitative morfologiske undersøgelser, præcis bestemmelse af den samlede mængde af væv, orgel eller orgel rum, prøverne blev taget fra (dvs.reference pladsen) er afgørende betydning^{7,9 , 12} for at beregne de absolutte mængder af de interesserede parametre inden for de respektive orglet, væv eller organisme. Til sidst, har effekten af embedding-relateret væv krympning under forberedelse af histologiske sektioner til bestemmes og tages i betragtning¹³. Kvantitative analyser, stereological, navnlig af arkiveret prøver (fast vævsprøver, indlejrede væv blokke, histologiske sektioner, osv.) fra tidligere undersøgelser er derfor undertiden stærkt begrænsede eller endda umuligt¹², især hvis volumetry af de respektive organer/væv ikke blev udført, hvis ingen passende stikprøver design blev anvendt for at berettige repræsentative prøver, hvis tal og mængder af tilgængelige enkelte prøver er utilstrækkelige, eller hvis behandlingen af den prøverne er uforenelig med vurdering af den kvantitative morfologiske parametre af interesse. På grund af de mangfoldige mulige påvirke faktorer, egnetheden af arkiv-prøven materialer til analyser af forskellige kvantitative morfologiske parametre kan ikke besvares entydigt, men afhænger af omhyggelig vurdering af hvert enkelt tilfælde.

Således som beliggenhed, størrelse, antal, forarbejdning, trimning retning og orientering af prøver vil potentielt påvirke resultaterne af de efterfølgende analyser, disse faktorer er af stor betydning og skal tages i betragtning i den eksperimentelle design af enhver undersøgelse. Med hensyn til disse aspekter og de særlige træk ved de svin anatomi, omfattende, detaljeret og omfattende prøvetagning retningslinjer tilpasses svin dyremodeller har for nylig blevet etableret, leverer en robust henvisning til standardiserede, reproducerbare , og effektiv generation af redundante, tilstrækkeligt forarbejdede, høj kvalitet prøver fra mere end 50 forskellige svin organer og væv^6,7.

De metodologiske beskrivelser og den video tutorial i denne artikel giver detaljerede, illustrative, forståelige, trin for trin instruktioner for praktiske udførelsen af forskellige teknikker til volumetry, prøvetagning af svin væv og organer, og behandlingen af vævsprøver for forskellige downstream analysemetoder. De fremhævede teknikker omfatter metoder til bestemmelse af organ/væv diskenheder og tætheder baseret på principperne om Archimedes og Cavalieri⁹, herunder bestemmelse af dimensioner af tre-dimensionelle svind af væv i forbindelse med den indlejring i forskellige indlejring medier¹⁴ under forarbejdningen til histologisk undersøgelse, anvendelse af praktisk volumen-vægtede systematisk tilfældige stikprøver tilgange, behandling af stikprøven væv prøver for forskellige efterfølgende analyser^7,8,9,15, og generation af behørigt orienteret og forarbejdede prøver for potentielle kvantitative stereological analyser^{7,8, 9,10,11}. Ved siden af deres anvendelse i svin biobank projekter er de påviste metoder generelt egnede for alle studier undersøger kvantitative Histò-morfologiske egenskaber af organer/væv. Desuden er systematisk stikprøveudtagning designs især gavnligt for generation af repræsentative prøver i eksperimenter af molekylære analysemetoder til påvisning af overflod, ændringer, fx, RNA'er, proteiner eller metabolitter i forskellige organer og væv.

De næste afsnit giver en kort introduktion til disse metoder, mens deres praktiske resultater er beskrevet i afsnittet protokol.

Bestemmelse af organ/væv diskenheder
Bestemmelse af orgel vægte og diskenheder er vigtige i flere eksperimentelle indstillinger, da disse faktorer kan indikere ændringer, potentielt relateret til eksperimentelt undersøgt faktorer af interesse. Det samlede volumen af et organ/væv er også almindeligt kræves for at beregne absolutte kvantitative parametre, (fx, samlede celle nummer), fra stereologically anslåede numeriske volumen tætheder (dvs., at antallet af celler pr. volumen enhed af væv)^7,12. Ud over teknikker, der anvender komplekse teknisk udstyr, herunder computertomografi, der er grundlæggende tre praktiske metoder almindeligvis anvendes til at bestemme den absolutte volumen af et organ eller væv. Volumen af et organ kan bestemmes ved "direkte volumetrisk måling" i henhold til princippet om Archimedes, dvs., måle mængden af vand eller saltvand fordrevet af strukturen, når helt neddykket. Men for forholdsvis store svin organer, disse tilgange er upraktisk og udsat for upræcise, da de kræver meget store volumetriske/måling kolber. Mere bekvemt, volumen af et organ/væv kan beregnes ud fra sin vægt og massefylde^7,12,16, som effektivt kan bestemmes ved hjælp af "submersion metode"^{7,12 ,16} (protokol trin 1.1.). Organ/væv diskenheder kan også estimeres ved hjælp af volumetry tilgange baseret på "princippet om Cavalieri" (1598-1647). I enkle vendinger, Cavalieri princippet fastslår, at hvis to objekter er opdelt i planer parallelt med en stelplade, og profiler af sektionerne skære igennem de to objekter på tilsvarende afstande fra stelpladens har de samme områder, de to objekter har den samme mængde. Således kan omfanget af vilkårligt formede objekter estimeres som produktet af deres afsnit profil områder i parallel, lige så Fjern sektion fly og afstanden mellem afsnit planer. Dette er forståeligt med de følgende analogi: overveje to stakke består af det samme antal identiske mønter er placeret side om side, en stak med mønter ordnet stablet oven på hinanden giver en cylindrisk form af mønt stack, og den anden stakken af mønter med off-center placeret mønter (figur 3A). Selv om figurer af begge mønt stakke er forskellige, deres diskenheder er de samme, siden områderne af mønter på et tilsvarende niveau af både stakke (dvs.områder af profiler for parallelle strækninger skære igennem begge mønt stakke i samme afstand fra den jorden) er identiske. Skøn over mængden af svin organer og væv ved hjælp af Cavalieri princip^7,12,15 er beskrevet i trin 1.2.

Bestemmelse af omfanget af væv svind relateret til histologisk indlejring
I analyser af flere kvantitative morfologiske parametre måles i histologiske væv sektioner, har effekt af embedding-relateret væv svind opstår under væv behandling for histologi at bestemmes og tages i betragtning. Udstrækningen af integrering-relateret væv svind kan være variabel og afhænger af både på vævet, forarbejdningen og den indlejring medium^{8,13,17,18,19}. Generelt, embedding-relaterede ændringer af mængden af en vævsprøve (dvs., for det meste svind) forekomme i alle tre dimensioner af rummet, og derfor påvirker alle dimensionelle parametre anslået af kvantitative stereological analyser⁸ . Dybest set, udstrækningen af integrering-relateret væv svind, udtrykt som den lineære væv svind faktor (f_S), kan estimeres som vist i trin 1.3. og anvendes til korrektion af (svind-følsomme) kvantitative morfologiske parametre¹⁴.

Volumen-vægtede systematisk stikprøvekontrol af organer/væv
For etablering af en biobank samling af svin orgel/vævsprøver, volumen-vægtede systematisk stikprøveudtagning tilgange som beskrevet i trin 2 har vist sig for at være praktisk tidsbesparende og effektiv teknikker for generation af repræsentant, multi-purpose væv prøver^7,8,9,15.

Generation af Isotropic ensartede tilfældige sektioner og lodret ensartede tilfældige sektioner for kvantitative stereological analyser
Biobank vævsprøver skal være egnet til en lang række forskellige kvantitative stereological analysemetoder for estimation af parametre, kunne ikke bestemmes uden et tilstrækkeligt forberedt modellen maksimalt. Næsten alle kvantitative stereological parametre kan bestemmes, ved hjælp af "isotropic (uafhængige) ensartede tilfældige (IUR) afsnit"^8,9. I IUR sektioner, er den tredimensionale orientering af sektionsplan af vævsprøve randomiseret. Dette kan opnås ved randomisering af vævsprøve i forhold til placeringen af sektionsplan, stilling, som anvendes i "Isector" metode¹¹ (protokol trin 3.1) eller ved randomisering af orientering af sektionsplan forhold til den vævsprøve, som i "Orientering" metode¹⁰ (protokol trin 3.2). I vævsprøver, såsom hud- eller slimhinde modellen viser et naturligt er til stede, eller definerede og korrekt identificerbare lodrette akse, forberedelse af "lodret ensartede tilfældige (VUR) afsnit" (protokol trin 3.3.) strengt sectioned i flyet for deres lodrette akse er fordelagtige^8,20. For en komplet diskurs af det teoretiske grundlag for IUR/VUR prøveudtagning og en omfattende diskussion af potentielle downstream kvantitative stereological analyser omtales den interesserede læser lærebøger af kvantitative Stereologi i livet Sciences^8,9.

Protocol

Alle metoder, der beskrives bruge her vævsprøver fra døde dyr og fuldt ud overholde de tyske retsforskrifter om dyrevelfærd.

1. Volumetry

1. Submersion teknik til bestemmelse af væv/Organ tætheder (figur 1 og figur 2) ^{7 , 12 , 16}
   1. Forberede materialer: skalpel vinger, papirhåndklæder, fine pincet, standard laboratorium skalaer, glas eller plast bægre, 0,9% saltvand og selv konstrueret modellen indehavere (figur 2A).
   2. -Punktafgifter et stykke væv (maksimal størrelse: 2 x 2 x 2 cm³) fra organ/væv, specielt fra orgel rum af interesse. Små organer, hypofysen og pinealkirtlen, er målt i toto.
      Forsigtig: Sikre, at Stikprøvens størrelse er især mindre end den indvendige diameter af bægerglas (trin 1.1.5 FF.), og dens påfyldning niveau at tillade fuldstændig nedsænkning af prøven uden at kontakte den indvendige vægge af bægerglas taktfast 1.1.7.
   3. Omhyggeligt svaber prøve med et stykke køkkenrulle til at fjerne overskydende blod/vævsvæske.
   4. Vejer prøven på en præcision skala og optage vægten af prøven (m_S). Bestemme vægten af små vævsprøver til den nærmeste mg (figur 1A).
   5. Placere et bægerglas fyldt med stuetemperatur 0,9% saltvand på skalaen. Ikke helt fylde bægerglasset, at give mulighed for en nedsænkningen af vævsprøve i de efterfølgende trin uden overløb.
      Forsigtig: Brug et bægerglas størrelse passende til størrelsen og vægten af væv stikprøveudvælgelsen skal måles og effektiv måleområdet af skalaen. For større prøver op til 2 x 2 x 2 cm³, et bægerglas størrelse 50 – 100 ml er passende i kombination med en skala, der måler fra ca. 100 mg til 500 g, mens små prøver at bruge bægre af 5-10 mL volumen i kombination med præcision skalaer med måleområder mellem ca 0,1 mg og 20 g.
   6. Dykke prøveholderen (dvs, en tilstrækkelig stift loop af tynde wire eller noget lignende, figur 2A) i saltvand til en markant position (pile i fig. 1B, figur 2Bog figur 2 c). Derefter nulstille (Tara) visning af skalaen til nul.
   7. Omhyggeligt tillægger prøveholderen vævsprøve og helt nedsænkes prøven i saltvand, indtil den afmærkede position på prøveholderen er nået (pile i fig. 1B, figur 2Bog figur 2 c).
      Forsigtig: Neddykket prøven og prøveholderen må ikke have kontakt med de indre vægge eller bunden af bægerglasset eller overfladen af saltvand.
   8. Mens du holder prøveholderen og undersøiske prøven i position, optage vægt vises på skalaen (m_L), henviser til vægten af saltvand fordrevet af vævsprøve (figur 1 C, figur 2B, og Figur 2 c).
   9. Beregn rumfanget af prøven (V_S) fra m_L, og tætheden af saltvand ved stuetemperatur (20 ° C) (Rho_saltvand = 1.0048 g/cm³) som V_S = m_L/ Rho_saltvand [g/g/cm³] (Figur 1).
   10. Beregne massefylden af vævsprøve (Rho_prøve) fra vægten (dvs.masse) af prøven (m_S) og dens volumen (V_S): Rho_prøve = m_S /V_S[g/cm³] (figur 1).
   11. For organer målt i toto, gentage målingen tre gange og beregne den gennemsnitlige orgel tæthed fra enkelt målingsværdier. For store organer/væv, udføre gentagne målinger med forskellige prøver af samme organ/væv/organ rum og beregne den gennemsnitlige tæthed fra de enkelte målinger i overensstemmelse hermed.
   12. Beregning af det samlede volumen af organ/væv/organ rum fra sin vægt og massefylde (figur 1).
2. Anvendelse af Cavalieri-metode til bestemmelse af svin orgel diskenheder ⁷
   1. Forberede materialer: lineal, caliper, kniv, saks, pincet, vandtæt pen, plast transparenter, scanner, foto kamera, og kryds Grid trykt på plastic transparenter.
   2. Placer den hele organ/væv på en almindelig overflade (skæring base) og måle længde (l) for orgel langs deres længdeakse (figur 3B, figur 5A).
   3. Skær den komplette organ/væv i ækvidistante parallelle skiver ortogonale med langsgående orgel akse (figur 3 c, figur 5B). Vælg en afstand d mellem to afsnit (dvs., skæring interval/snittykkelsen, normalt ca. 1 cm) tilstrækkelig lille til at modtage et tilstrækkeligt antal væv/organ plader. Tilfældigt placere den første afsnit inden for en afstand mellem 0 og skære intervallet fra margenen af orglet. Mens udskæring, visuelt bedømme den placering og orientering af hver sektionsplan at opnå ca parallelle organ/væv plader af nogenlunde ensartet tykkelse.
      Bemærk: Det nødvendige antal væv/organ plader afhænger af formen og størrelsen af de undersøgte organ/væv. Hvis små organer eller prøver skal være opdelt i tynde plader af ≤5 mm, integrere prøverne i agar før skæring (Se trin 1.3.3.) og bruge en teknisk anordning til udskæring af agar-embedded prøven. Empirisk anbefalelsesværdig skæring intervaller for mest svin organer og væv, såvel som eksempler for udskæring enheder, er angivet i "Væv prøveudtagning vejledninger for svin biomedicinsk modeller"⁷supplerende materiale.
   4. Placere alle organ/væv plader på samme overfladen nedad på skæring base (dvs., konsekvent på enten højre eller venstre sektion planet af hvert organ slab, figur 3D, figur 5 c) og tælle plader (n).
   5. Få afsnit profiler af væv plader af en af følgende fremgangsmåder:
      1. Omhyggeligt placere væv plader på behørigt mærket plast transparenter, samtidig opretholde retningen af deres øvre og nedre sektion overflader. Spore omridset af væv plader på plast transparenterne med en vandtæt pen (figur 3E1-2).
      2. Tage fotografiske billeder af væv plader, holder kameraet lodret over afsnit overflader (figur 3F). For kalibrering, placere en størrelse lineal ved siden af væv plader.
      3. Skan væv plader på en flatbed-scanner samtidig bevare retningen af deres øvre og nedre sektion overflader (figur 3 g). For kalibrering, placere en størrelse lineal ved siden af væv plader.
   6. Måle områder i (røbestof, fotograferede eller scannede) sektion profiler af alle væv plader af en af følgende fremgangsmåder:
      1. Overlay eller sammenkopiere røbestof orgel slab profiler med en passende størrelse, kalibreret gitter af jævnt fordelt krydser trykt oven på en plastik gennemsigtighed og tælle alle krydser rammer området profil (figur 3E3-4, sammenligne til Figur 5 d). Beregne afsnit profil inden for hvert organ slab ved at multiplicere antallet af krydser rammer området profil af det areal, der svarer til et kors.
         Bemærk: For at modtage tilstrækkeligt nøjagtige volumen skøn, vælge et kryds grid med en tilpas lille afstand mellem tilstødende Kors, så at et gennemsnit på mindst 100 krydser ramte afsnit overflader af plader af et organ i hver undersøgt sagen om undersøgelsen . Empirisk anbefalelsesværdig kryds grid størrelser for mest svin organer og væv er angivet i "Væv prøveudtagning vejledninger for svin biomedicinsk modeller"⁷supplerende materiale.
      2. Måle områderne af væv plader i de digitale billeder af billeder/scanninger ved hjælp af passende kommercielt tilgængelige eller freeware morfometri soft- og hardware applikationer (figur 3 H), som en kommerciel billede analyse system²¹, eller ImageJ²².
         Forsigtig: Bemærk at en væv slab (enten først eller sidst) er placeret på den scanner, der hviler på dens naturlige overflade, henholdsvis, vender kameraet med dens naturlige overflade. Derfor, det scannede billede, billedet af denne plade, vil ikke vise en punkt overflade. Derfor er ingen sektion område profil målt i det scannede billede/Foto billede af dette væv slab (figur 3I). Også note over projektion præsenterer i scannede billeder og fotografier af organ/væv plader, dvs., kun måle områderne af de faktiske afsnit profiler, men ikke af væv i billedet liggende bag slab afsnit overflade (figur 12 G-H).
   7. Det anslåede orgel volumen beregnes som et produkt af summen af alle tilsvarende afsnit profil områder af alle væv plader pr. sag (dvs., konsekvent af enten højre eller venstre, henholdsvis den øvre eller nedre sektion overfladen af hver orgel slab og den gennemsnitlige tykkelse af plader (dvs., kvotienten af den målte længde af den vertikale orgel akse (l) og antallet af plader)¹⁵.
3. Bestemmelse af omfanget af tre-dimensionelle Embedding-relateret væv krympning under behandling af vævsprøver til histologi
   1. Forberede materialer: mikrotomen vinger, pincet, agar, metal støbning forme, digital scanner og størrelse lineal (fx, kvadreret papir).
   2. Skær en frisk, flyet afsnit overflade fra en fast vævsprøve.
      Bemærk: Hvis bruger prøver af let deformerbare (bløde) væv (fedtvæv, geléagtige væv), integrere de faste vævsprøve i agar før skæring (figur 4A).
   3. At integrere prøve i agar:
      1. Bland standard agar pulver som anvendes til mikrobiologi dyrkningsmedium med en passende mængde vand (ca. 0,5-1 g agar/10 mL vand) i et glas bægerglas. Blandingen omrøres og varme den i en mikrobølgeovn på 700 W indtil kogende i 3-5 s. blandingen omrøres og bring i kog igen for 3-5 s.
      2. Eventuelt for at forøge kontrasten i agar til vævsprøve, farve den flydende agar, fxmed sort blæk (tilsættes 1 mL blæk 10 mL varm flydende agar og rør kraftigt).
      3. Hæld den varm agar i en casting mold (fx, en metal skimmelsvamp bruges til paraffin indlejring, figur 10A-D) og nedsænkes den faste vævsprøve i den varm agar. Lad agar køle indtil størkning, fjerne formen og skæres agar blok med indlejrede væv ved hjælp af en mikrotomen eller barberblad.
         Forsigtig: Mens håndtering af varme flydende agar, bære beskyttelsesbriller og handsker. Processen vævsprøver fast i formaldehyd løsning under en udstødning hætte og bære beskyttelsesbriller og laboratorium handsker.
   4. Prøven anbringes med dens afdeling overflade vender nedad på en flatbedscanner, sammen med en størrelse lineal og scanne afsnit overflade (figur 4AB).
   5. Bestemme området i afsnittet overfladen af den faste vævsprøve (en_f) i digital scan, ved hjælp af en af de teknikker, der beskrives i trin 1.2.6 (figur 4B).
   6. Integrere prøven i plast indlejring medium, såsom epoxy (fxEpon) eller glycolmethacrylate/methylmethacrylate (GMA/MMA)²³, følgende standardprotokoller^23,24,25 ) Figur 4 c). Sikre, at afsnit overfladen af faste prøven scannet i det foregående trin (1.3.4) bevares i plast-embedded prøven.
      Bemærk: For at bevare retningen af afsnit overfladen af prøven under behandling af prøven, konsekvent prøven anbringes med dets tilsigtede afsnit overflade vender nedad i indlejring kassetten eller casting skimmel, eller markere den ønskede sektion overflade (eller den modsatte side af prøven) med blæk.
   7. Skære en histologiske sektion fra plastik blok svarende til den oprindelige sektion overfladen af den faste vævsprøve (trin 1.3.2) ved hjælp af en mikrotom (figur 4D), montere afsnittet på et glas dias (figur 4D) og bejdse det rutinemæssigt) fx, hæmatoxylin og eosin pletten, H & E)^24,25.
      Forsigtig: For at modtage en histologiske sektion omtrent i samme plan som den oprindelige sektion overfladen af den faste vævsprøve, nøje justere placeringen af plast blokken i mount af mikrotomen før skæring.
   8. Placer diasset med afsnittet farves vender nedad på en flatbed-scanner med en størrelse lineal og scanne afsnittet (figur 4E).
   9. Bestemme området af del af plast-embedded vævsprøve (A_e) i digital scan, ved hjælp af en af de teknikker, der er beskrevet i trin 1.2.6 (figur 4F).
   10. Beregne den gennemsnitlige embedding-relateret væv svind (for de respektive væv og indlejring medium) fra de målte områder af tilsvarende sektion profiler af vævsprøver, før og efter indkapslet i plast indlejring medium. Lineær svind faktor f_s beregnes som kvadratroden af kvotienten af områder af sektion profiler af n vævsprøver efter indkapslet i plast indlejring medium (en_e) og inden for de tilsvarende sektion profiler af de samme vævsprøver før indkapslet i plast indlejring medium (en_f) (figur 4 g)¹⁴.

2. bind-vægtede systematisk tilfældige stikprøver af punkt optælling og forarbejdning af væv delprøver til forskellige Downstream analysetyper⁷

1. Forberede materialer: lineal, caliper, kniv, saks, pincet, vandtæt pen, punkt/cross gitre trykt på plastic transparenter, og tilfældige tal tabeller.
   Bemærk: Kopi skabeloner for grænseoverskridende net (5-60 mm) leveres i "Væv prøveudtagning vejledninger for svin biomedicinsk modeller"⁷supplerende materiale.
2. Placer organ/væv på en almindelig overflade (skæring base) og måle længde (l) for orgel langs deres længdeakse (figur 5A, figur 6A).
3. Skær den komplette organ/væv i ækvidistante parallelle skiver ortogonale sin længderetning (figur 5B). Vælg en afstand d mellem to afsnit (dvs.skæring interval/snittykkelse, normalt ca. 1 cm) lille nok til at opnå et tilstrækkeligt antal væv/organ skiver. Tilfældigt placere den første afsnit inden for en afstand mellem 0 og skære intervallet fra margenen af orglet. Mens udskæring, visuelt bedømme den placering og orientering af hver sektionsplan at opnå omtrent parallelt organ/væv plader af nogenlunde ensartet tykkelse.
   Bemærk: Det nødvendige antal væv/organ plader afhænger af størrelsen af de undersøgte organ/væv og antallet af stikprøven væv lokationer. Hvis små organer eller prøver skal være opdelt i tynde plader af ≤5 mm, integrere prøverne i agar før skæring (Se trin 1.3.3.) og bruge tekniske hjælpemidler til udskæring af agar-embedded prøven. Empirisk anbefalelsesværdig skæring intervaller for mest svin organer og væv, såvel som eksempler for udskæring enheder er angivet i "Væv prøveudtagning vejledninger for svin biomedicinsk modeller"⁷supplerende materiale.
4. Placere alle organ/væv plader på samme overfladen nedad på skæring base (fig. 6B).
5. Overlejring af væv plader med en passende størrelse kryds grid udskrives på en plastik gennemsigtighed ved at placere den yderste venstre øverste på tværs af nettet over en tilfældig punkt ud af væv (figur 5 c-D, figur 6B).
   Bemærk: Vælg et kryds grid med en tilpas lille afstand mellem tilstødende Kors, så i hvert undersøgt sagen om undersøgelsen, mindst dobbelt så mange Kors vil ramme afsnit tredjedel af væv til kabinen kan udtages, som antallet af prøver, der skal tages fra væv rum. Empirisk anbefalelsesværdig kryds grid størrelser for mest svin organer og væv er angivet i "Væv prøveudtagning vejledninger for svin biomedicinsk modeller"⁷supplerende materiale.
6. Mark og tælle alle krydser rammer væv (henholdsvis væv sub rummet skal udtages). Konsekvent anvende en ensartet tilstand af optælling og nummerering af Kors rammer væv rum skal udtages i alle væv plader, fxaf fortløbende nummerering af de respektive Kors i hver linie for linie, fra venstre mod højre og fra top til bund eller, fxved nummerering Kors i et væv slab efter den anden i urets retning, begyndende med korset tættest på tolv o'clock position, som eksemplarisk demonstreret i figur 5E.
7. Opdele antallet af krydser rammer væv/væv rum skal stikprøven (n) af antallet af prøver der skal genereres for at få systematisk prøveudtagning interval (i).
8. Bestemme den første prøveudtagning holdning ved at vælge en tilfældig tal x i intervallet mellem 1 og jeg. Til dette, bruge en tilfældige tal tabel. Markere den første prøveudtagning position (x) og hver næste x , + i, x + 2jeg, x + 3i, osv., krydse rammer væv/væv rum skal udtages på plast gennemsigtighed med en vandtæt pen (figur 5F).
   Bemærk: Random antal tabeller kan være bekvemt og hurtigt genereret ved hjælp af en online generator af tilfældige tal.
9. Tag væv steder svarende til de markerede krydser ved lidt hæve den plast gennemsigtighed og placere et lille stykke ren, Tom konfetti papir på overfladen af væv pladen med en pincet (figur 5 g, figur 6E ).
10. Punktafgifter eksemplar af væv fra stikprøven placeringer (figur 5 H, figur 6F, figur 7A) og yderligere Underinddel dem for forskellige typer af efterfølgende analyser (figur 6 g, figur 7A-B), som angivet i Tabel 1.
11. Efter prøvetagning, ren plast transparenterne med varmt vand og sæbe, tør, og genbruge dem.

3. generation af Isotropic ensartede tilfældige (IUR) sektioner og lodret ensartede tilfældige (VUR) sektioner for kvantitative Stereological analyser

1. "Isector" teknik
   1. Forberede materialer: Razor eller mikrotomen vinger, agar, sfæriske støbning forme (f.eks.casting forme for Praliner, som kan fås fra Konditor leverandører), foldback klemmer og pincet.
   2. Placer en passende størrelse stykke (1 x 1 x 1 cm³) af faste, systematisk tilfældigt udtages væv i en sfærisk casting skimmel, holde sammen ved foldback klemmer og fylde formen med varmt flydende agar (figur 8A-E).
   3. Fjerne agar sfære (figur 8F) fra casting skimmel efter størkning af agaren.
   4. Roll agar kugle med den integrerede vævsprøve hen over bordet, stop, og del det på en tilfældig position.
      Bemærk: Den resulterende sektionsplan er en IUR sektion (figur 8F-G).
   5. Gå videre til at integrere vævsprøve i plast harpiks såsom GMA/MMA, opretholde orientering af afsnittet IUR fly (Se 1.3.5).
2. "Orientering" teknik
   1. Forberede materialer: Razor eller mikrotomen knive, agar, pincet, random nummer tabel(ler), udskrifter af equiangular og cosinus-vægtede cirkler.
      Bemærk: Kopi skabeloner af cirkler leveres i tidligere publikationer^8,26.
   2. Placer stikprøve af faste væv (eller agar-embedded faste væv) på en udskrift af en equiangular cirkel med én kant parallelt med 0-180 ° retning (figur 9A, figur 10E).
   3. Bestemme en tilfældig vinkel ved hjælp af tabellen tilfældige tal. Find de tilsvarende mærker på omfanget af den equiangular cirkel, som prøven hviler på. Ved hjælp af disse mærker, skåret en del gennem prøven (eller gennem agar omkring den integrerede vævsprøve), med sektionsplan bliver orienteret parallelt med retningen af tilfældige vinklen angivet på omfanget af den equiangular kreds, og lodret til den hvilende overfladen af prøven (figur 9B-C, figur 10F).
   4. Placer væv blok med afsnit overfladen genereret i det foregående trin mod nedadrettede på en cosinus-vægtede cirkel med kanten af hvilende overfladen placeret parallelt med 1-1 (figur 9 d, fig. 10 H).
   5. Gentag trin 3.2.3 og skære et nyt afsnit gennem prøven på en tilfældig vinkel bestemmes ved hjælp af tilfældige tal tabel (figur 9E-F, finde 10I-J).
      Bemærk: Den resulterende sektionsplan er en IUR sektion.
   6. Hvis det er relevant, bestemme området for IUR afsnit profil af den faste vævsprøve til bestemmelse af embedding-relateret væv svind (figur 9 g-J) som beskrevet i trin 1.3, og fortsætte hen til indkapsle vævsprøve i plast harpiks såsom GMA/MMA.
3. Generation af lodrette ensartede tilfældige (VUR) afsnit
   1. Forberede materialer: Razor eller mikrotomen vinger, agar, pincet, random nummer tabel(ler) og udskrifter af equiangular kredse.
      Bemærk: Kopi skabeloner af cirkler leveres i tidligere publikationer^8,26.
   2. Definere en lodret akse inden for den faste vævsprøve, der er altid genkendelige i stikprøven/afsnittene under de efterfølgende trin.
      Bemærk: Typisk akse lodrette vævsprøve naturlige overflade er valgt som den lodrette akse.
   3. Hvis det er hensigtsmæssigt, integrere prøven i agar (fig. 11B).
      Bemærk: Agar-embedding før VUR - eller IUR-skæring af faste prøven er generelt anbefalelsesværdig til små, tynde, skrøbelige eller bløde prøver. Også bruge agar-indlejring af prøver for at lette placering af VUR sektioneret prøven under den efterfølgende integrering af prøven i plast harpiks medium.
   4. Prøven anbringes på en udskrift af en equiangular cirkel, med den lodrette akse er vinkelret orienterede symmetriplan i tabellen tabel/papir (figur 11C).
   5. Skær prøven på en tilfældig vinkel (bestemmes ved hjælp af en tilfældig nummer tabel) med sektionsplan ortogonale til tabellen og parallelt med den lodrette akse til at modtage en VUR sektionsplan (figur 11D).
   6. Hvis det er relevant, bestemme området for IUR afsnit profil af den faste vævsprøve til bestemmelse af embedding-relateret væv svind som beskrevet i trin 1.3 (Sammenlign med figur 9 g-J) og fortsætte med at integrere vævsprøve i plast harpiks såsom GMA/MMA.

Representative Results

Neddykning teknik til bestemmelse af væv/organ densitet

Fig. 12A -B viser den repræsentative bestemmelse af tætheden og volumen af et svin nyre ved hjælp af submersion teknik beskrevet taktfast 1.1 (figur 1, figur 2). Mere repræsentative resultater af tæthed målinger af yderligere svin organer og væv er præsenteret i tabel 2. En mere omfattende liste over reference tætheder af forskelligartede svin væv og organer er vist i "Væv prøveudtagning vejledninger for svin biomedicinsk modeller"⁷. Gyldigheden af væv tæthed målingsværdier opnået ved hjælp af metoden submersion kan estimeres ved gentagne målinger af den samme prøve og af uafhængige enheder. Mest svin væv vise tæthedsværdier lidt højere end vand (Rho_vand ≈ 1.0), der henviser til, at væv svømning i saltvand (fedtvæv, lungevæv) vise tætheder < 1.0.

Cavalieri metode til bestemmelse af orgel diskenheder

Figur 12C -F viser den repræsentative bestemmelse af mængden af svin nyre (samme organ som vist i fig. 12A-B). Områder af afsnittet overflader af orgel plader var bestemmes ud fra punkt-tælling, ved hjælp af en overlejrede kryds grid udskrives på en plastik gennemsigtighed, samt planimetric måling af afsnittet områder af orgel plader i et scannet billede af plader (betale opmærksomhed til overdreven projektion af væv placeret bag plader afsnit overflader, fig. 12 G-H). Nøjagtigheden af organ/væv volumen data opnået ved udførelsen af Cavalieri tilgang (trin 1.2, fig. 3) kan anslås til sammenligning til den respektive mængde beregnes ud fra vægt og massefylde af organ/væv. Mængder af nyre undersøgt i figur 12 bestemmes af metoden neddykning og Cavalieri metode(r) varierede mindre end 1% fra hinanden. Som en foranstaltning af nøjagtigheden af Cavalieri volumen skøn, kan dens koefficient af fejl (CE) beregnes, som beskrevet tidligere¹⁵.

Bestemmelse af tre-dimensionelle Embedding-relateret væv krympning under behandling af vævsprøver til histologi

Repræsentative resultater af omfanget af væv svind i forbindelse med integrering af svin vævsprøver (kortikale nyre væv) i plast harpiks (GMA/MMA eller epoxy) for kvantitative histomorphological undersøgelse er vist i tabel 2 (tidligere upublicerede data). De lineære svind faktorer anført i tabel 2 blev fastsat som beskrevet i trin 1.3 (figur 4). De henviser til en tre-dimensionel volumen reduktion af 29% for GMA/MMA indlejring, og 22% for epoxy indlejring af svin kortikale nyre væv. Figur 13 viser repræsentative eksempler på tilstrækkeligt og tilstrækkeligt forberedte prøver af agar-embedded, formalin-fast fedtvæv til måling af prøven afsnittet areal før plast-indlejring.

Volumen-vægtede systematisk tilfældige stikprøver af punkt optælling og forarbejdning af væv delprøver til forskellige Downstream analyse

"Skæring og punkt-tælling" teknikken til volumen-vægtede systematisk stikprøvekontrol af parenkymalt organer (trin 2, figur 5 figur 6, figur 7) repræsenterer en etableret, robust metode til generering af repræsentant prøver til flere efterfølgende typer af analyser^2,7. Repræsentative resultater af generation af systematisk tilfældigt stikprøven, meget overflødige biobank eksemplar af forskellige svin organer og væv, med efterfølgende differentierede behandling af skåret vævsprøver for flere forskellige nedstrøms analysemetoder, der ved hjælp af stikprøver teknik beskrevet i trin 2 (figur 5, figur 7og eksemplarisk demonstreret i figur 6) har tidligere været udgivet². For generation af biobank prøver af levervævet i en tidligere svin biobank studie², eksempelvis svin lever var helt sectioned i ca 20 plader af 2-3 cm tykkelse, overlejret med en med en 3 cm kryds grid, som beskrevet i trin 2 og 16 væv steder i ca. 2 x 2 x 2 cm³ blev systematisk tilfældigt udtages og skåret ud i hvert enkelt tilfælde. Fra hver af de skåret prøver, fem delprøver blev efterfølgende genereret til molekylære analyser (frosne ved-80 ° C) af stikprøven steder, en delprøve til cryohistology, en delprøve var fast i Methacarn løsning, og i formaldehyd løsning for efterfølgende paraffin indlejring og histologisk- og immunhistokemisk undersøgelse. Generation af de 74 forskellige prøver pr. sag (indtil frysning eller overførsel af prøverne til fiksering løsning) blev opnået inden for ca 20 min på gennemsnitlig². Den beskrevne udtagning og undersampling tilgang gennemførlighed/succes kan estimeres ved vurdering af kvaliteten af de genererede prøver (dvs., kvaliteten af RNA- eller protein isolerer, bevarelse af histomorphological og ultrastrukturelle egenskaber af vævsprøver, deres egnethed til immunohistological analyser, etc.)²

Generation af Isotropic ensartede tilfældige (IUR) sektioner og lodret ensartede tilfældige (VUR) sektioner for kvantitative Stereological analyser

Teknikkerne, der demonstrerede for et fremad-orienterede generation af isotropic ensartede tilfældige (IUR) sektioner og VUR sektioner fra svin (biobank) vævsprøver (protokol trin 3, figur 8, fig. 9, figur 10, figur 11), giver mulighed for undersøgelse af de fleste kvantitative stereological parametre, kan hurtigt ske med nogle praksis, og uden rimelig vanskeligheder eller kilder til fejl. Derfor, generation af IUR-prøver vist i figur 9 (isector teknik) og figur 10 (orientering teknik) er fuldt repræsentative for disse metoder.

Figur 1: skematisk illustration af "Submersion teknik" til bestemmelse af væv/organ tætheder. (A) måling af prøven vægt (dvs.masse, m_S). (B) skala tareret til vægten af et bægerglas fyldt med 0,9% saltvand på 20 ° C og en prøveholderen neddykket i saltvand til en defineret, markant position. (C) fuldstændig nedsænkning af prøven til prøveholderen uden nogen kontakt til de indre vægge eller bunden af bægerglasset markant position. Vægt vises på balancen er vægten af volumen af saltvand fordrevet af prøven). Tætheden af prøven beregnes som angivet (her: Rho_prøve = m_S/V_S = m_S/ (m_L/1.0048) = 5.153/(4.538/1.0048) = 1.141 g/cm³_). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: "Submersion teknik" til bestemmelse af væv/organ tætheder. (A) forskellige prøve indehavere konstrueret fra tynd ledning. Fra venstre mod højre: en løkke af tynd tråd tråden gennem en tynd injektion kanyle, en spiralformet kurv med ledning til at holde små og skrøbelige prøver, og en simpel slynge af tynd ledning. Pilene i A-C angiver de holdninger, som prøven indehavere er neddykket i saltvand. (B, C) Positionering af prøveholderen under neddykning af prøven i saltvand (Sammenlign med figur 1 C). (B) komplet svin hypofyse kirtel placeret i en kurv-formet prøveholderen. (C) stikprøve af svin myokardiet. Bemærk den fuldstændig neddykning af prøverne i saltvand uden at kontakte væggene eller bunden af bægerglasset. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: skematisk illustration af anvendelsen af Cavalieri metode til bestemmelse af svin orgel diskenheder. (A) mønt stack eksempel for forståelsen af Cavalieri princippet. Se Introduktion til detaljer. (B-H) Skematisk demonstration af volumen estimation af en perfusion-fast nyre. (B) måling af længde (l) af nyre langs sin længdeakse. (C) opskæring af komplet orglet i n lige så tyk (d) parallelle skiver ortogonale i forhold til længderetningen orgel akse. (D) orgel plader placeret på den samme overflade vender nedad. Bemærk at den første (rigtige) væv slab placeres på sin naturlige overflade, dvs., har ikke en punkt overflade. (E-H) Forskellige tilgange til at fastsætte de afsnit overflade væv plader. (E) spore omridset af hvert organ slab med en vandtæt pen på en plastik gennemsigtighed overlay i den skitserede orgel slab profiler med en passende størrelse, kalibreret kryds grid udskrives på en plastik gennemsigtighed, optælling af krydser rammer den profil område. Orgel slab afsnit profil område beregnes ud fra antallet af krydser rammer afsnit profil området og området svarende til et kors. (F,G) Bestemmelse af afsnittet områder af orglet batts i fotobilleder taget i lodret orientering til afsnit overflader (F) eller scannede billeder af væv plader (G), med linealer til kalibrering. (H) bestemmelse i afsnittet områder af væv plader i de digitale billeder af billeder/scanninger ved hjælp af passende morfometri softwareapplikationer. (jeg) beregningen af den anslåede mængde af orglet som et produkt af den samlede område i de tilsvarende sektion overflader af alle orgel plader ganget med den gennemsnitlige tykkelse af orglet batts¹⁵. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: skematisk illustration af bestemmelse af tre-dimensionelle embedding-relateret væv krympning under behandlingen af vævsprøver for histologi. (A) opskæring af en frisk, fly afsnit overflade fra en fast vævsprøve (stabilisering i form af let deformerbare (bløde) væv, såsom fedt eller lunge væv ved at integrere i agar før skæring). Scanning af afsnit overfladen af prøven med en størrelse lineal. (B) Planimetric bestemmelse af området i afsnittet overfladen af den faste vævsprøve (en_f). (C) rutine indlejring af prøven i plast indlejring medium. (D) udarbejdelse af en histologisk del af plast blokken med bevarelse af sektionsplan af prøven. Montering af afsnittet om et glas dias og rutinemæssig farvning af diaset. (E) Scanning af dias med en størrelse lineal. (F) Planimetric bestemmelsen af arealet af afsnittet i eksemplet plast-embedded (en_e). (G) beregning af omfanget af embedding-relateret væv svind som kvotienten mellem de målte områder af tilsvarende sektion profiler af vævsprøver før og efter indkapslet i plast indlejring medium¹⁴. Billeder til højre viser sektion overfladen af en formaldehyd-fast stikprøve af fedtvæv indlejret i blæk-sværtede agar før indkapslet i plast harpiks (øverst) og den tilsvarende sektion profil (HE-farvning) i eksemplet GMA/MMA-embedded (nederst). Skalere barer = 2 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: skematisk illustration af volumen-vægtede systematisk stikprøveudtagning. Eksemplet præsenteres viser systematisk stikprøvekontrol af seks væv steder i den renale cortex af en perfusion-fast nyre. (A) måling af længde (l) af nyre langs sin længdeakse. (B) komplet skæring af hele orglet i lige så tyk (d) parallelle skiver ortogonale i forhold til længderetningen orgel akse. (C) Organ/væv plader placeres på det samme (dvs.enten højre eller venstre) overflade vender nedad. (D) overlejringen af væv plader med en passende størrelse kryds grid udskrives på en plastik gennemsigtighed. Den yderste venstre øverste kryds Grid er placeret over en tilfældig punkt udenfor væv (angivet med en blå prik, •). (E) optælling og nummerering af alle krydser rammer den renale cortex. I det foreliggende eksempel nummereres krydser rammer den renale cortex fortløbende i én nyre slab efter den anden (fra venstre til højre), i hver plade fortsætter i urets retning, begyndende med korset tættest på 12 klokken. Her, ramt 36 krydser den renale cortex. Seks stikprøver positioner er skal udtages. Derfor, hvert sjette position hvor et kors hits væv er stikprøven (36/6 = 6). (F) i det foreliggende eksempel, position af fjerde cross (N ° 4) rammer den renale cortex er tilfældigt valgt som den første prøveudtagning position. Hver følgende cross sjette rammer den renale cortex er markeret på den plast gennemsigtighed ved hjælp af en vandtæt pen. I det foreliggende eksempel er disse positioner 4, 10, 16, 22, 28 og 34. (G) Tagging af de tilsvarende væv steder af små stykker af ren, Tom konfetti papir placeret på overfladen af vævet. (H) Excision af væv prøver fra tilfældigt systematisk indsamlede placeringer og efterfølgende forarbejdning for yderligere analyser. Dette tal er blevet ændret fra Albl et al. (2016), tal S236 og S237, side 186 (kosttilskud)⁷. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6: volumen-vægtede systematisk stikprøvekontrol af den renale cortex af et svin nyre (se figur 5) og regler for punkt-tælling. (A) friske gris nyre. (B) nyrerne sektionerede i lige så tykke parallelle skiver ortogonale i forhold til længderetningen orgel akse, belagt med kryds grid udskrives på en plastik gennemsigtighed. Den røde cirkel angiver placeringen af den tilfældige punkt bruges til at randomisere holdning kryds Grid. (C) Illustration af punkt-tælling regler: en cross/point regnes som rammer væv rum skal stikprøven (reference rum), hvis den øverste højre inderste hjørne af lodret og vandrette bar Kors (pil) dækker væv. (D) mærkning af Kors at ramme den renale cortex og systematisk tilfældige stikprøver af væv steder (her, 119 krydser ramt den renale cortex og 17 steder er systematisk tilfældigt udtaget ved hjælp af en prøveudtagning interval jeg = 7). (E) udtages tilfældigt systematisk placeringer af renal cortex markeret af konfetti papir. (F) skåret ud prøver. (G) yderligere underopdeling af skåret prøver til efterfølgende behandling af delprøver til forskellige downstream Analysetyper. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7: underopdeling af vævsprøver skåret ud fra systematisk tilfældigt stikprøven væv steder og behandling af delprøver til forskellige downstream Analysetyper. (A) skematisk illustration af generation af væv delprøver fra en systematisk tilfældigt stikprøven placering af renal cortex (native væv) til forskellige analyser (f.eks.FF-PE: Formalin-fast, paraffin-embedded prøve og MTC-PE: Methacarn-fast, paraffin-embedded prøve for lys-mikroskopiske histologi; CRYO: Prøve for frossen sektion histologi; -80 ° C: tøris frosne vævsprøver for Molekylær analyse). (B) Excision af systematisk tilfældigt stikprøven placeringer i den renale cortex af en perfusion-fast nyre, yderligere underopdeling af skåret vævsprøver og forarbejdning af delprøver til kvalitative og kvantitative morfologiske analyser. Plader af perfusion-fast svin nyre (1), cross-gitter (2), tilfældige tal tabel (3), equiangular og cosinus-vejet cirkler (4) for generation af IUR sektioner (Se figur 9, fig. 10), forskellige fiksering løsninger (5, 6, 7), og prøven beholder til elektron mikroskopisk prøver (8). Dette tal er blevet ændret fra Albl et al. (2016), finde S239, side 186 (kosttilskud)⁷. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 8: "Isector" afsnittet forberedelse fra formalin-fast svin væv. (A) stikprøve af perfusion-fast svin renal cortex. (B) sfæriske støbning forme. (C) flydende agar. (D-E) Agar-indlejring af prøver i sfæriske støbning forme. (F) Agar sfære med integrerede vævsprøve. (G) Agar sfære med indlejrede væv sectioned på en tilfældig position (IUR sektionsplan). Dette tal er blevet ændret fra Albl et al. (2016), finde S6, side 14 (kosttilskud)⁷. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 9: skematisk illustration af "Orientering" teknik til præparation af IUR sektioner. (A) stikprøveudvælgelsen af faste væv placeres på en equiangular cirkel (ci1) med en kant parallelt med 0-180 ° retning (angivet med en rød linje). (B) Sectioning af prøven i en tilfældig vinkel (grøn linje). (B, C) Nyligt genererede afsnit overfladen af vævsprøve (anført i grøn farve). (D) prøven placeres på en cosinus-vejet cirkel (ci2) med ledhejseporte overfladen genereret i det foregående trin vender ulempe og en kant af den hvilende flade parallelt med 1-1 (angivet med en rød linje). (E) skæring af anden sektion gennem eksemplet på en tilfældig vinkel. (F) resulterende tilfældigt isotropic afsnit plan af prøven (angivet i blå farve). (G) bestemmelsen af arealet af afsnittet IUR i den faste vævsprøve til estimering af embedding-relateret væv svind som beskrevet i trin 1.3. (H) indlejring af vævsprøve i plast harpiks. (jeg) Sectioning af plast blok er sektioneret (parallel med køretøjets IUR) på en mikrotom. (J) montering af IUR plast-sektioner på glas dias. Dette tal er blevet ændret fra Albl et al. (2016), finde S8, side 15 (kosttilskud)⁷. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 10: "Orientering" teknik til forberedelse af IUR sektioner af agar-embedded vævsprøver. (A-D) Eventuelt en kan agar-Integrer en systematisk tilfældigt stikprøven eksemplar af faste væv (agar-indlejring er nyttigt for små vævsprøver, så først eller begge tilfældige sektioner kan placeres inden for agaren uden at skære væv). (E) positionering af agar blok på en equiangular cirkel (ci1) med en kant parallelt med 1-1 (angivet med en rød linje). (F, G) Skæring af blok i en tilfældig vinkel (her: 15-15, grøn linje) bestemmes ved hjælp af en tilfældig nummer tabel (rnt, grøn pil). (H) efterfølgende positionering af agar blok på afsnit overfladen skæres i F på en cosinus-vægtede cirkel (ci2) med den hvilende flades yderkant placeret parallelt med 1-1 (angivet med en rød linje). (jeg) andet afsnit skære igennem prøven på en tilfældig vinkel (her: 20-20, angivet med en blå linje), bestemmes ved hjælp af en tilfældig nummer tabel (rnt, blå pil). (J) resulterende IUR sektion fly af en vævsprøve. Dette tal er blevet ændret fra Albl et al. (2016), finde S9, side 16 (kosttilskud)⁷. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 11: skematisk illustration af VUR afsnittet forberedelse. (A) fast vævsprøve med en defineret (identificerbare) lodret akse (f.eks.lodret til dens naturlige overflade). (B) fast vævsprøve indlejret i agar. (C) positionering af the(agar-embedded) vævsprøve på en udskrift af en equiangular cirkel (ci1). V_A: lodret akse. (D) Sectioning af prøven i en tilfældig vinkel (tilfældig nummer tabel; her: 30-30 retning, angivet med en blå linje) med sektionsplan bliver ortogonalt orienteret til bordet og parallelt med lodret akse af prøven. Resulterende VUR sektionsplan af vævsprøve (angivet i blå farve). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 12: repræsentant volumetry af et svin nyre. (A-B) Neddykning teknik. (A) bestemmelse af nyre vægt (m_kid). (B) bestemmelse af vægten af volumen af saltvand fordrevet af nyre (m_displ.saline). Nyrerne er hang på en snor og fuldt neddykket i saltvand uden at røre bunden eller væggene i bægerglasset. Den beregnede mængde af nyrerne er 92.6 cm³. (C-D) Cavalieri teknik, planimetry ved optælling af point. (C) måling af længde (l) af nyre langs sin længdeakse. (D) bestemmelse af afsnit profil områder af nyre plader af punkt tælle efter overlejring af et gitter med jævnt fordelt krydser trykt på en plastik gennemsigtighed. Her, er den anslåede mængde af nyrerne 93.3 cm³. (E-F) Cavalieri teknik, planimetry scannede billeder af afsnit profil områder af nyre plader (F). Her, er den anslåede mængde af nyre 92.8 cm³. I sag C-E, naturligt runde overfladen af først eller den sidste plade af nyre placeret i scanneren eller overlejret af kryds grid gennemsigtighed er ikke en punkt overflade og derfor ingen afsnit areal er målt i dette væv slab. (G-H) Demonstration af overprojection i scannede billeder af organ/væv plader (G) og organ/væv plader belagt med et kryds grid gennemsigtighed (H). Overprojecting dele af væv af orgel plader er angivet med punkteret hvide og sorte linjer. Kun områderne af de faktiske sektion profiler (dvs., vævet omgivet af den delvist angivet hvide stiplede linje) bestemmes. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 13: repræsentative illustration af passende (A) og suboptimal (B) forberedelsen af agar-embedded vævsprøver til bestemmelse af væv svind relateret til indlejring af prøver i histologiske plast indlejring media. (A) scannede billede af afsnit overfladen af en fast stikprøve af svin subkutane fedtvæv inden indkapslet i plast harpiks. Prøven er indlejret i blæk-sværtede agar til stabilisering i form af prøven og klare identifikation af afsnit overflade konturer. (B) utydelige omrids af afsnit overflade og fanget luftboble (pil) i agaren. Skalere barer = 5 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Analyse		Stikprøve	Forarbejdning
Type	Metode(r)
Molekylære analyser	RNA udskrift, protein, metabolit, og lipid profilering, metabolomics analyse, DNA-analyse	Små stykker * frisk (native) væv	Fryse på tøris eller flydende nitrogen. Opbevares ved-80 ° C.
Kvalitative morfologiske analyser	Histologi [lysmikroskopi, incl. Immunhistokemi (IHC) & in situ hybridisering]	Frisk (native) — eller i situ - fast * vævsprøver	Bruge forskellige fikseringsmidler (fx, 4% formaldehyd løsning) og indlejring medier (paraffin, GMA/MMA, epoxy), som passende.
	Cryohistology (frosne dele, incl. IHC)	Frisk (native) vævsprøver	Integrere prøve i blokerende medium og fryse i flydende nitrogen-kølet isopentane.
	Ultrastrukturelle analyse [elektronmikroskopi, incl. transmission-(TEM) og scanning elektronmikroskopi]	Små stykker af frisk (native) — eller i situ- fast * vævsprøver	Lave prøve i 2.5 – 6,25% glutaraldehyd løsning og integrere i epoxy plast harpiks.
Kvantitative morfologiske analyser	Lysmikroskopi	Frisk (native)- eller i situ - fast * vævsprøver	Forberede IUR-sektioner (apparater-, isector-sektioner) og/eller VUR-dele af plast integrerede vævsprøver.
	TEM	Små stykker af frisk (native) — eller i situ - fast * væv	Forberede IUR (apparater-, isector-sektioner) dele af epoxy-embedded vævsprøver.

Tabel 1: forarbejdning af væv delprøver skåret ud fra systematisk tilfældigt stikprøven placeringer for forskellige downstream analyser typer. Afhængigt af den eksperimentelle design af en undersøgelse og organ/væv under undersøgelsen, forskellige numre af delprøverne skåret ud fra hver systematisk tilfældigt stikprøven væv placering og forarbejdet til forskellige typer af downstream analyser. Detaljerede protokoller for mest svin organer/væv og undersøgelse typer leveres i "Væv prøveudtagning vejledninger for svin biomedicinsk modeller"⁷. GMA/MMA: Glycolmethacrylate/methylmethacrylate. IUR: Isotropic uniform tilfældige. VUR: Lodret uniform tilfældige. * max. 2 x 2 x 2 mm³. fx, perfusion faste væv eller pulmonal væv af lungerne indpodet med fiksering løsning.

Metode	Repræsentative resultater
Neddykning teknik til bestemmelse af væv/organ tætheder (trin 1.1, figur 1, figur 2)	Svin organ/væv		Rho (g/cm³)
	Leveren		1.071 ± 0,007
	Bugspytkirtlen		1.062 ± 0.016
	Ventrikel myokardiet		1.036 ± 0.014
	Nyre		1.044 ± 0.006
	Abdominal viscerale fedtvæv *		0.921 ± 0,032
	Skjoldbruskkirtlen		1.061 ± 0,007
	Hjernen		1.051 ± 0,007
	Binyrerne		1.063 ± 0,025
	Skelet muskel **		1.074 ± 0,003
	Data er middel ± SD. specifikke organ/væv vægte blev fastsat i n = 18 svin (14 kvindelige og 4 mandlige svin; alder 60 dage til 2 år; kroppen vægt 30-250 kg). * Fedtvæv fra jejunal mesenteriet. ** Middelværdier for M. longissimus dorsi, M. tibialis cranialis, M. triceps brachii og M. gluteobiceps.
Bestemmelse af tre-dimensionelle embedding-relateret væv krympning under behandlingen af vævsprøver for histologi (trin 1.3, figur 4)	Organ/væv	Indlejring medium	fS
	Renal cortex (gris)	GMA/MMA	0,89 ± 0,02
		Epoxy	0.92 ± 0,02
	Data er middel ± SD målinger af 24 prøver af 12 grise. fS: lineær svind korrektionsfaktor.

Tabel 2: Repræsentative resultater af tætheder af udvalgte svin organer og væv⁷og lineær svind korrektionsfaktorer for indlejring-relateret væv svind af svin kortikale nyrevæv i forskellige plast indlejring medier.

Discussion

Generation af biobank prøve samlinger fra svin dyremodeller kræver robust teknikker og protokoller til bestemmelse af organ/væv diskenheder, den reproducerbare generation af repræsentant, redundant vævsprøver egnet til en bred vifte af forskellige analysemetoder og randomisering af orientering af prøven sektioner for kvantitative stereological analyser. De metoder, der beskrives i denne artikel er tilpasset størrelsen på svin organer og væv, og er blevet udviklet for at effektivt opfylder disse krav^2,7. De er baseret på godt anerkendte metodologiske principper, og har tidligere bevist deres anvendelighed i forskellige publicerede undersøgelser^2,7,12,21. De fremhævede metoder er vigtige for forskellige typer af undersøgelser undersøger væv/organ prøver, da de giver et grundlag for generation af repræsentative prøver, og til erhvervelse af en række parametre, som ellers ikke kunne fastslås. Disse metoder kan hurtigt udføres med lille indsats, og er kompatibel med næsten alle former for downstream analyser. Derfor, de anses for velegnet ikke kun for svin dyremodel biobank projekter, men er også nyttigt i undersøgelser, hvor kvantitative histomorphological analyser af vævsprøver af andre store dyremodel arter (f.eks., får), som samt i veterinære undersøgelser. Hensyntagen til de tekniske aspekter af de forskellige metoder, skal et par kritiske trin og begrænsninger overvejes under implementering af protokollerne for de respektive teknikker.

Neddykning teknik til bestemmelse af væv/organ densitet

Under fastsættelsen af væv tætheder ved hjælp af submersion metode (trin 1.1, figur 1, figur 2), pleje skal tages ikke at røre den indvendige vægge eller bunden af bægerglasset med vævsprøve eller prøveholderen mens vævet er prøve neddykket i saltvand. Ellers, skalaen vil vise vægten af prøven og ikke vægten af volumen af saltvand fordrevet af prøven. For meget små/lys vævsprøver (et par mg) er neddykning metode til bestemmelse af væv tæthed begrænset på grund af surface tension af saltvand og negativt høj kvotienten af sample volumen til volumen af submersion væske i bægerglasset, som er hindrer nøjagtighed i målingen. Her, kan vægten af prøven, der anvendes til yderligere beregninger i stedet for den tæthed beregnede volumen. Bestemmelse af væv tætheder ved neddykning er heller ikke effektive for friske (ikke optagne) lungevæv, på grund af den inkonsekvente indhold af luft i vævet, og i nogle tilfælde, hvor organer er eksperimentelt perfunderet/indpodet med fikseringsmidler.

Cavalieri metode til bestemmelse af orgel diskenheder

Metoden til Cavalieri volumetry af svin organer og væv er mere besværligt i forhold til bestemmelse af orgel volumen fra orgel vægt og massefylde. Det er dog velegnet til organer, der ikke kan passende vejes på grund af deres eksperimentelle behandling (f.eks., perfusion-fast organer eller lungerne indpodet med fiksering løsning). Cavalieri volumetry metode kombineres her, ideelt med volumen-vægtede systematisk stikprøver teknik beskrevet i trin 2 (figur 5 figur 6, fig. 12). Under forkalkulationen af organ/væv diskenheder fra områder af sektion profiler for parallelle, ækvidistante skiver af organ/væv (Cavalieri tilgang, trin 1.2, fig. 3) plader vedligeholdelse af orientering af væv (øvre og nedre sektionsplan ), samt en nøjagtig bestemmelse af området i alle afsnit profiler er af stor betydning. Især, hvis digitale billeder eller scanninger af orgel plader er analyseret planimetrically, skal overprojections af væv (uden for sektioneret væv flyet) af væv slab (fig. 12G-H) omhyggeligt anses at give pålidelige volumen skøn.

Bestemmelse af tre-dimensionelle embedding-relateret væv krympning under behandlingen af vævsprøver for histologi

Udstrækningen af integrering-relateret væv svind afhænger indlejring medium og typen væv, og kan også variere mellem varierende forarbejdede prøver af de samme væv.

Frosne dele er at vise næsten ingen svind i X-Y plane, og plast indlejring generelt forårsager lille svind af væv, er embedding-relateret væv svind særligt omfattende i paraffin-embedded vævsprøver , og vil normalt væsentligt forringer kvantitative morfologiske analyser af dimensionelle parametre i histologiske sektioner af disse prøver. Ud over omfang af samlet set tre-dimensionelle svind forårsager paraffin-embedding også en uensartet, differential, anisotrope og variable svind af prøven og af forskellige anatomiske strukturer, vævstyper og celletyper i det væv prøve^8,13. Desuden, især i tykkere histologiske sektioner af paraffin-embedded vævsprøver, omfanget af væv svind afvige også betydeligt i X-Y og Z-retningen af afsnittet. Dette kan skyldes en differentieret svind af området afsnit (i X-Y-retning) og afsnit højde (dvs, den lodrette snittykkelsen) under udspænding af afsnittet i varm væv flotation vandbad efter afsnittet er klippet fra vævet blokere, og under de efterfølgende forarbejdning, farvning og coverslipping procedurer i afsnittet monteret på en glas dias (dvs., en homogen sammenbrud af sektioner z-aksen)⁸. Derudover i tyk sektioner, der kan være et sammenligneligt stærkere komprimering af afsnit-fly-nær væv regioner inden for afsnittet mens afsnittet er klippet fra væv blok (fører til en differentieret deformation af sektioner z-aksen)¹⁹ . Disse virkninger kan derefter også fordreje skøn over antallet af væv strukturer inden for del af særskilte kvantitative stereological analysemetoder, som den optiske disector. Forudsigelse, overvågning og korrektion af embedding-relateret væv svind er derfor ikke muligt for paraffin-embedded væv prøver⁸.

Derimod er omfanget af volumen svind af vævsprøver indkapslet i plast harpiks, epoxy, f.eks GMA/MMA betydeligt lavere, og vigtigst, mere ensartet. Derfor, indkapslet i plast harpiks med en formodet homogen, isotropic og globale svind af væv er fordelagtig for adskillige analysemetoderne for forskellige kvantitative morfologiske parametre^17,18. Under forkalkulationen af væv svind relateret til indlejring i plast harpiks, bør form af faste væv desuden være fordrejes under indlejring procedure, at give mulighed for sammenligning af tilsvarende afsnit profil områder af faste og integrerede prøver. Dette kan være vanskeligt i blødt eller let Komprimerbar vævsprøver som fedt eller lunge væv, eller i vævsprøver med et højt indhold af væske. Her, integrering af faste prøven i agar før skæring af væv er nyttigt at stabilisere form af vævsprøve under den efterfølgende plast indlejring procedure (protokol trin 1.3., figur 4). For at opnå pålidelige data, skal gentagne målinger af embedding-relateret væv svind udføres, ved hjælp af forskellige prøver af de samme væv. Udstrækningen af integrering-relateret væv svind er udtrykt som den lineære væv svind faktor f_s (protokol trin 1.3.9., figur 4 g). Eksempler på ligninger ved hjælp af f_s for svind korrektion af forskellige længde, areal og volumen parametre af forskellige væv strukturer findes i flere kvantitative stereological studier^{14, 21,27}.

Volumen-vægtede systematisk tilfældige stikprøver af punkt optælling og forarbejdning af væv delprøver til forskellige downstream analysetyper

Præsenteres volumen-vægtede prøveudtagning teknik til svin organer bestemmer stikprøveudtagning steder inden for væv, der en gang, og efterfølgende genererer alle nødvendige prøver til yderligere forskellige analyser af undersampling af vævsprøver skåret ud fra disse steder⁷. I volumen-vægtede systematisk stikprøveudtagning regimer, hver muligt prøveudtagning placering inden for den samlede mængde af organ/væv under undersøgelse har præcis den samme tilfældige chance kan udtages, og generalizability sikres ved indsamling af en tilstrækkeligt antal eksemplarer. Ved hjælp af lydstyrke-vægtede systematisk stikprøveudtagning designs for generation af prøver fra parenkymalt organer, derfor, forhindrer effektivt analyseresultater måske forudindtaget af (potentielt uventede og ukendt) ulige distributioner af særskilte funktionelle eller morfologiske væv egenskaber i forskellige steder af et organ, som er blevet påvist, f.eks., for den gennemsnitlige volumen og numeriske volumen tætheden af svin hepatocytter i forskellige regioner af leveren parenkym²⁸ . Fremhævede "væv-slabbing og undersampling" strategien for svin organer kan er let forståelige, opfylder de tekniske krav i de efterfølgende analyser metoder, og hurtigt gennemføres og tilpasses kravene til en særlig undersøgelse, dermed undgå systematisk prøveudtagning bias, at reducere eksperimentel variation, og øger præcisionen af den samlede eksperiment, mens er mere effektive end prøveudtagning strategier, hvor hver enkelt prøveudtagning placering afgøres tilfældigt^{9 ,15}. Antallet af prøver, der skal fremskaffes, naturligvis afhænge af den undersøgte parameter og dens variation inden for prøver fra forskellige steder i stikprøven organ/væv. For generation af biobank prøve samlinger designet til at give mulighed for undersøgelse af et maksimum af forskellige parametre (ikke angivet på tidspunktet for prøveudtagningen) af en række forskellige analytiske metoder, tidsplaner sådan en fremadskuende prøvetagningsmetode normalt generation af relativt høje antal overflødige prøver pr. organ/væv.

Generation af Isotropic ensartede tilfældige (IUR) sektioner og lodret ensartede tilfældige (VUR) sektioner for kvantitative stereological analyser

Nogle af de teknikker, der anvendes for generation af IUR og VUR sektioner for kvantitative stereological analyser har noget kompliceret teoretiske baser, og forklaringerne er derfor ofte (unødvendigt) undgået mange videnskabsfolk, selv om deres praktiske gennemførelse er rimelig let. VUR sektioner er særlig let at generere, og er optimal for areal tæthed skøn i kombination med cycloid test systemer^8,9,20. De er ofte at foretrække på grund af den velkendte orientering af sektionsplan. I modsætning til IUR sektioner er VUR sektioner ikke egnet til estimering af længde-parametre^8,9.

Forberedelsen af afsnittene IUR og VUR de kritiske trin er, dybest set, at opretholde IUR eller VUR afsnit overfladen af faste prøven under indkapslet i plast harpiks, og at sikre, at den lodrette akse af VUR sektioner altid kan identificeres (trin 3, Figur 9, figur 10, Figur 11).

I fremtiden, en bredere anvendelse af de metoder, der er beskrevet ovenfor kan bidrage væsentligt til at etablere konsekvent høj kvalitet standarder for generation af sammenlignelige, multi-purpose biobank prøver fra svin og andre store dyremodeller.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Carl Roth GmbH, Germany	Agar (powder), Cat.: 5210.3	Dissolve approximately 1 g of agar in 10 ml cold water in a glass or plastic beaker, heat in microwave-oven at 700 W, boil the solution twice with rigorous stirring. Cast into mold while still warm and let solidify. Caution: While handling with hot liquid agar, wear protective goggles and gloves.
Caliper	Hornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, Germany	Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902	Any kind of caliper (mechanical or electronic) will do as well.
Casting molds (metal)	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany	Einbettschälchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Cat.: 14302b	Any other kind of metal casting mold used for paraffin-embedding will do as well.
Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm)	n.a.	n.a.	Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm) are provided in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)
Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles	n.a.	n.a.	Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles are provided in Nyengaard & Gundersen. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) and in Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists. In: Haschek and Rousseaux´s Handbook of Toxicologic Pathology. 3rd ed, 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013).
Foldback clamps (YIHAI binder clips, 15 mm and 19 mm)	Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., China	Y10006 and Y10005	Any other type of standard office foldback clamps will do as well.
Forceps (anatomical)	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	neoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811	Any type of anatomical forceps will do.
Formaldehyde-solution 4%	SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Germany	Formaldehyd 37/40 %, Cat.: 1000411525005	Dilute to 4% from concentrated solution. Buffer to neutral pH. Wear appropriate eye-, hand- and respiratory protection. Process tissue samples fixed in formaldehyde solution under an exhaust hood and wear protective goggles and laboratory gloves.
Graph paper (for calibration)	Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de	Penig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514	Any type of graph paper (scaled in millimeter) will do.
Laboratory beakers (5ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml)	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	Becherglas SIMAX® , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Cat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036	Any kind of glass- or plastic beakers of 5 – 100 ml volume will do.
Laboratory scale(s)	Mettler Toledo GmbH, Gießen, Germany	PM6000	Any standard laboratory scales with measuring ranges between 0.1 mg to approximately 20 g, respectively between 100 mg to approximately 500 g will do
	Sartorius AG, Göttingen, Germany	BP61S
Microtome blades	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany	FEATHER Microtome blasdes S35, Cat.:14700	Any kind of single-use microtome blades will do.
Morphometry/planimetry software/system	National Institute of Health (NIH)	ImageJ	Download from https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997).
Zeiss-Kontron, Eching, Germany	VideoplanTM image analysis system	Out of stock
Photo camera	Nikon	D40	Any kind of digital photocamera that can be mounted to a tripod  will do.
Plastic transparencies	Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Germany	Laser Overhead-Folie DINA4 Cat.:  3562	Any (laser)-printable plastic transparency will do.
Random number tables	n.a.	n.a.	Random number tables can conveniently be generated (with defined numbers of random numbers and within defined intervals), using random number generators, such as: https://www.random.org/
Razor blades	Plano GmbH, Wetzlar, Germany	T5016	Any kind of razor blades will do.
Ruler	Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de	Office-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, transparent, Cat.: ln30	Any kind of cm-mm-scaled ruler will do as well.
Saline (0.9%)	Carl Roth GmbH, Germany	Natriumchlorid, >99% Cat.: 0601.1	To prepare 0.9% saline, dissolve 9 g NaCl in 1000 ml of distilled water at 20°C.
Scalpel blades	Aesculap AG & Co KG, Tuttlingen, Germany	BRAUN Surgical blades N°22	Any kind of scalpel blades will do.
Scanner	Hewlett-Packard	hp scanjet 7400c	Any type of standard office scanner capable of scanning with resolutions from 150-600 dpi will do.
Slicing devices	n.a.	n.a.	Examples forself constructed slicing devices can be found in Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) and in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016).
Spherical casting molds (e.g., in 25.5 mm diameter)	Pralinen-Zutaten.de, Windach, Germany	Pralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25.5 mm	Spherical casting molds can as well be be self-constructed, or obtained from other confectioner suppliers (for for pralines). The casting molds indicated here are actually the package/wrapping of hollow pralines bodies (first eat the pralines and then use the package for generation of i-sector sections)
Thin wire	Basteln & Hobby Schobes, Straßfurth, Germany. www,bastel-welt.de	Messingdraht (0.3 mm) Cat.: 216464742	Any other kind of thin wire will also do.
Tissue paper	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	Declcate Task Wipes-White, Cat.: 1-5305	Any other kind of laboratory tissue paper will do as well.
Waterproof pen	Staedler Mars GmbH & Co KG, Nürnberg, Grmany	Lumocolor permanent 313, 0.4 mm, S, black, Cat.: 313-2	Any other kind of waterproof pen will do as well.