Summary
在这里, 我们描述了一个详细的协议, 从诱导部位分离淋巴细胞, 包括肠道相关淋巴组织 Peyer 的补丁和引流肠系膜淋巴结, 和效应部位, 包括固有层和小肠上皮的小肠免疫系统。
Abstract
肠道免疫系统在维持胃肠道屏障功能方面起着至关重要的作用, 通过对膳食抗原和共生细菌进行耐受性反应, 同时对致病进行有效的免疫应答。微生物.此外, 很明显, 局部肠道免疫对远程和全身免疫具有深远的影响。因此, 研究如何诱发肠道免疫应答以及反应的免疫学结果是很重要的。在这里, 描述了一个详细的协议, 用于隔离小肠诱导部位的淋巴细胞, 如肠道相关淋巴组织 Peyer 的补丁和引流肠系膜淋巴结和效应部位, 如固有层和肠上皮。这项技术确保从小肠组织中分离出大量的淋巴细胞, 具有最佳的纯度和生存能力, 并且在可接受的时间限制内区划污染最小。从肠道组织中分离淋巴细胞和其他免疫细胞的技术能力使人们能够理解对胃肠道感染、癌症和炎症性疾病的免疫反应。
Introduction
胃肠道有许多褶皱和突起, 代表着分离内部身体和外部环境的最大界面。肠道免疫系统在维持胃肠道屏障功能方面起着至关重要的作用。它经常接触到膳食抗原、共生细菌和致病微生物。因此, 它必须保持对食物抗原和共生细菌的耐受力, 同时保持对致病微生物的有效免疫反应的能力 (1)。肠道免疫系统可以解剖划分为诱导点, 在那里天真的淋巴细胞由抗原呈现细胞激活, 携带抗原从肠道粘膜, 和效应部位, 其中活化淋巴细胞发挥特定效应函数2。诱导部位包括 Peyer 斑块 (PP) 的组织淋巴结构, 通过专门的 M 细胞和区域引流肠系膜淋巴结 (MLN) 的作用直接调查肠道腔。效应部位由固有层 (LP) 组成, 它是基底膜下面的结缔组织, 肠上皮, 位于基底膜上方的一个细胞, 含有上皮内淋巴细胞 (IEL)。淋巴细胞是适应性免疫的主要参与者, 它可以调节对感染和癌症的保护, 也可能导致炎症性疾病的免疫病理。研究这些明显的解剖黏膜隔室中的淋巴细胞, 以更好地了解它们的诱导和效应功能, 具有重要的意义。
由于探索肠道中发生的免疫事件的调查人员数量正在加速, 因此需要一个相对简单和统一的隔离这些隔间淋巴细胞的协议。几个研究小组发布了一些协议, 它们共享几个类似的过程, 用于隔离来自小鼠小肠隔间的免疫细胞3,4,5,6,7.但是, 它们之间存在着一些技术上的差异, 这取决于个别协议的重点。例如, 重点是将免疫细胞从 LP 中分离出来, 一项协议检查了各种酶消解对细胞活力、细胞表面标记表达和孤立免疫细胞组成的影响5。另一项协议突出了一种快速、可再生的方法, 用于分离无密度离心的淋巴细胞6。最后, 还存在特定的协议, 目的是从小肠的不同组织层分离单个核吞噬7。在这里, 一个高度可重复性的协议, 允许从 MLN, PP, LP, 和 IEL 室的小肠的顺序隔离淋巴细胞的数量。
我们专注于从 LP 和 IEL 隔间隔离高度纯净的人群, 这些舱基本上没有来自其他肠道的污染物。这种广泛使用的协议在可接受的时间限制范围内产生的最大纯和可行的淋巴细胞的高收益率4,8,9,10,11,12。该协议还确保从 LP 和 IEL 室隔离淋巴细胞与最小的交叉区划污染, 使一个真正的机会来研究这些不同的舱室淋巴细胞。分离的淋巴细胞可以受到进一步的操作, 如流细胞分析或功能分析。该协议已成功地应用于分离的小鼠小肠和结肠在细菌感染, 如李斯特菌, 伤寒沙门氏菌和耶尔森氏杆菌假结核菌淋巴细胞。感染和炎症条件, 如化学和病原体引起的结肠炎。该协议也可用于分离先天免疫细胞, 如树突状细胞, 巨噬菌, 中性粒蛋白, 单核, 从小鼠小肠和结肠。
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Protocol
所有动物实验都是按照国家卫生研究院的指导方针进行的, 并经石溪大学机构动物护理和使用委员会批准。
注: 确保在执行程序之前授予所有批准。
1. 解决方案准备
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HGPG (HEPES, l-谷氨酰胺, 青霉素/链霉素, 庆大霉素), 100×
- 混合59.6 克 HEPES (500 毫米最后), 14.6 克 l-谷氨酰胺 (200 毫米最终), 1×106 U 青霉素 (2000 U/毫升最终), 1 克链霉素 (2 毫克/毫升最终), 和2.5 毫克庆大霉素 (5 µg/毫升最终)。添加 RPMI 1640 至500毫升。使用氢氧化钠调整 ph 值为 7.5 (在调整前, 缓冲器呈黄色/橙色, pH 值约为 6.0)。使用0.45 µm 过滤器进行杀菌消毒。整除和贮存在-20 摄氏度, 可达1年或4摄氏度, 可达1月。
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HEPES-碳酸氢钠缓冲器, 10x
- 混合23.8 克 HEPES (100 mM 决赛), 21 克 NaHCO 3 (250 毫米决赛), 并将水添加到1000毫升。用 HCl 将 pH 值调整为 7.2. 使用0.45 微米过滤器进行杀菌消毒。在室温下贮存。pH 值随时间变化。定期重新调整 pH 值。
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收获媒介 (~ 1 bottle/2 小鼠)
- 500毫升 RPMI 1640, 加入25毫升热灭活胎牛血清 (5% 最后), 和5毫升 100× HGPG。贮存6月至4摄氏度。
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Dithioerythritol (DTE) 解决方案 (40 毫升/小肠)
- 混合50毫升10×汉克斯平衡盐溶液, Ca2+-和 Mg2+无, 50 毫升 10× HEPES-碳酸氢钠缓冲, 50 毫升热灭活胎牛血清 (10% 最后)。添加350毫升 H2O 和15.4 毫克 dithioerythritol/100 mL (1 毫米决赛)。在使用前准备新鲜的。
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乙二胺四乙酸 (EDTA) 溶液 (50 毫升/小肠)
- 混合50毫升10×汉克斯平衡盐溶液, Ca2+-和 Mg2+-免费与5毫升 100× HGPG。添加445毫升 H2o 添加260µL 0.5 M EDTA/100 mL (1.3 毫米决赛)。在使用前准备新鲜的。
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胶原酶溶液 (30 毫升/LP)
- 到500毫升 RPMI, 添加50毫升血清 (10% 血清最后), 5 毫升 100× HPGP, 1 毫升0.5 米氯化镁2 (1 毫米决赛) 和1毫升 0.5 M CaCl2 (1 毫米决赛)。添加胶原酶, I 型 (100 U/毫升最终)。在使用前准备新鲜的。
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密度梯度 (DG) 解决方案
- 通过混合90毫升的 dg 库存解决方案 (参阅材料表) 与10毫升的 10× PBS 一起准备 1× dg 库存解决方案。保持不育的4摄氏度。
- 通过混合44毫升 1× DG 股票溶液和56毫升 RPMI 1640, 准备 44% DG 溶液 (8 毫升/IEL, 8 毫升/LP)。在使用前准备新鲜的。
- 通过混合67毫升 1× DG 股票溶液和33毫升 RPMI 1640, 准备 67% DG 溶液 (5 毫升/IEL, 5 毫升/LP)。在使用前准备新鲜的。
2. 肠系膜淋巴结、肠道和 Peyer 斑块的分离
- 弄死小鼠使用二氧化碳麻醉和继发性颈椎脱位。将鼠标放在背上, 用70% 乙醇喷雾。用剪刀做中线切口, 打开皮肤和腹壁, 露出腹腔。
- 找到盲肠并使用镊子轻轻拉盲肠下来。使用镊子小心地将小肠移动到右侧, 露出整个 MLN 链, 它与结肠对齐。
注: 一张肠系膜淋巴结链和肠道淋巴引流图以前被描述为13。 - 识别链中最靠近盲肠的底部节点。使用一组钳来抓住它周围的肠系膜/脂肪, 并轻轻地删除 MLN 链从底部到顶端通过钳法脂肪从周围的淋巴结与另一套钳。
- 将 MLN 链放在用收获介质浸湿的纸巾上。通过滚动纸塔上的链条, 用两套镊子将脂肪拔开, 以去除肠系膜/脂肪。将 MLN 放在冷收获介质中, 以便以后隔离步骤。
注: (i) 不鼓励直接处理节点。相反, 抓住他们周围的肠系膜/脂肪。(二) 尽可能多地切除肠系膜/脂肪, 以改善细胞的生存能力是至关重要的。 - 用剪刀切开幽门括约肌和盲肠以上的小肠。使用一组钳将小肠从回肠缓慢拉出, 并使用另一组钳去除附加的肠系膜/脂肪。
- 将肚腑放在纸巾上, 用两套镊子蘸上一条沾有收割介质的纸巾, 并戏弄其余的肠系膜/脂肪。
注: (i) 一定要尽可能多地去除肠系膜/脂肪, 以达到最佳的细胞产量和生存能力。(ii) 定期应用收获培养基, 使肠道湿润, 并采取以下步骤。 - 收集 Peyer 的补丁, 从肠道取出他们的弯曲剪刀。如果需要, 使用解剖范围或放大镜 (初学者);大多数 Peyer 的补丁应该是可见的训练有素的眼睛。从小肠收集 5-11 (典型) Peyer 的补丁。将 Peyer 的补丁放在冷收割介质中, 以便以后隔离步骤。
注意: Peyer 的斑块是小的, 主要是圆形突起在外肠壁对面的肠系膜附件。 - 使用钳的平边和轻轻地从十二指肠向回肠滑动, 以排出粪便内容和粘液。重复一次以去除大部分粘液。
注: 不完全清除粘液可降低细胞活力和产量。不过, 一定要轻轻滑动小肠, 以避免剥离绒毛或破坏基底膜。 - 在一个点上使用钝端的细剪刀, 将钝端插入肠道, 并从十二指肠向回肠纵向切开肠道。侧面切开被打开的肚腑入 ~ 2 cm 片断。将肠道部分放置在50毫升圆锥管中, 25 毫升冷收获介质, 用于以后的隔离步骤。
注意: 把剪刀沾上介质会帮助他们毫不费力地滑过肠道。
3. 从感应部位分离淋巴细胞
- 使用3毫升注射器的柱塞, 通过70µm 细胞过滤器轻轻游离, 将淋巴细胞从 MLN 中分离出来。用5毫升的冷收获介质冲洗细胞过滤器。
- 颗粒 MLN 细胞由离心在 400 x g 5 分钟在4°c。并用重悬1毫升冷收获介质中的细胞颗粒。使用台盼蓝排除计数可行细胞。
注: 红细胞溶解缓冲液可用于去除红细胞中的出血。 - 通过在5毫升 prewarmed 胶原酶溶液的15毫升锥形管中孵化 Peyer 的斑块, 在37摄氏度和220转30分钟内, 从 Peyer 的斑块中分离出淋巴细胞。
- 漩涡为十五年代在最大设置和过滤器被消化的组织和上清入50毫升圆锥管通过一个70µm 细胞滤网。用3毫升注射器的柱塞轻轻地将剩余的组织块分开, 用5毫升的冷收获介质冲洗细胞过滤器。
- 颗粒 Peyer 的补丁细胞由离心在 400 x g 5 分钟在4°c 和并用重悬细胞颗粒在1毫升冷收获媒介。使用台盼蓝排除计数可行细胞。
注意: Peyer 的斑块分离可能有一些污染的固有的细胞和上皮内淋巴细胞。
4. 小肠上皮内淋巴细胞的分离
- 用25毫升的冷收获培养基将小肠洗净三次, 通过将管反转10次, 让肠道部分沉淀, 并从上清中倾泻而出。
注意: 组织件应容易沉淀到管子的底部。如果他们不这样做, 这表明太多的肠系膜/脂肪仍然附着或与气泡有关。 - 将20毫升的 prewarmed DTE 溶液添加到含有肠道块的50毫升圆锥管中, 并转移到含有搅拌棒的50毫升渗锥形瓶中。搅拌在37°c 和 220 rpm 上的磁力搅拌器20分钟. 使用大磁铁在瓶的外部举行搅拌杆和转移组织和解决方案回到50毫升圆锥管。
- 涡流管在最大设置为十年代. 通过70µm 细胞过滤器将上清液转移到新的50毫升锥形管中, 小心地将组织片放在原管中。不要丢弃上清;上清液含有上皮内淋巴细胞。颗粒细胞通过离心在 400 x g 5 分钟在4°c。在10毫升的冷收获介质中并用重悬细胞颗粒, 储存在冰上。
- 将20毫升的 prewarmed DTE 溶液添加到含有肠道片的50毫升圆锥管中, 然后转回到含有搅拌棒的50毫升渗锥形瓶中。搅拌在37°c 和 220 rpm 上的磁力搅拌器20分钟. 使用大磁铁在瓶的外部举行搅拌杆和转移组织和解决方案回到50毫升圆锥管。
注意: DTE 是一种能丰富上皮内淋巴细胞的还原剂。 - 涡流管在最大设置为十年代. 将上清液通过70µm 细胞过滤器转移到前一管, 其中包含第一个 DTE 治疗的上清液 (从步骤 4.3)。
注意: 其余的肠块用于分离固有层的淋巴细胞。质量控制: 一个组织可以切除和检查组织学, 以确保上皮细胞存在, 基底膜是完整的。 - 颗粒细胞通过离心上清液在 400 x g 5 分钟在4摄氏度。并用重悬细胞颗粒在8毫升 44% DG 溶液室温 (RT)。
- 将8毫升 44% DG 溶液/电池悬浮液转移到17毫米直径 x 100 mm 型14毫升聚丙烯圆底管。衬底与5毫升 RT 67% DG 溶液。离心机在 1600 x 克20分钟的 RT 不使用刹车。
注: 可以用牛血清预处理导管, 防止细胞黏附在管壁上。 - 请注意, 在44% 到67% 界面上, 存活的细胞形成一条带 (粘液), 死细胞和一些上皮细胞位于梯度顶端的一层膜中, 红血球在颗粒中。通过真空吸尘, 将渐变的顶层移至界面的2厘米以内。使用巴斯德吸管在界面上收获菲比涂层, 并将其转移到含有40毫升冷收获介质的50毫升圆锥管上。
- 颗粒细胞通过离心在 400 x g 5 分钟在4°c。并用重悬1毫升冷收获介质中的细胞颗粒。使用台盼蓝排除计数可行细胞。
5. 小肠内固有细胞的分离
- 将25毫升的 prewarmed EDTA 溶液加入含有剩余肠道的烧瓶中, 去除肠道组织块中的上皮细胞。搅拌瓶在37°c 和 220 rpm 上的磁力搅拌器30分钟. 使用大磁铁在瓶的外部举行搅拌杆, 并小心地丢弃上清, 同时保持肠块内的瓶子。
注: (i.) EDTA 是一种钙离子螯合剂, 它靶向钙依赖的结点, 并促进肠道上皮细胞的脱离。(二) 上清应该是多云的, 并可用于隔离 IEC, 如果他们需要收集。 - 重复步骤5.1。
注: 此孵化后上清液应少多云。质量控制: 一个组织可以切除和检查组织学, 以确保肠道上皮细胞已被删除, 基底膜是完整的。从上清液中抽取的样品也可以通过流式细胞仪进行评估, 以确认白细胞 (CD45+细胞) 不存在。 - 在烧瓶中加入50毫升的 RT 收获培养基。用磁铁简单搅拌。让肠道块安定下来, 小心地丢弃上清。
注: 这一步骤确保在胶原酶消化前, 通过螯合钙对胶原酶的作用至关重要的钝化酶去除 edta。 - 添加30毫升的 prewarmed 胶原酶溶液的烧瓶, 并在37°c 和 220 rpm 在一个磁性搅拌器45分钟搅动肠道部分。
- 通过70µm 细胞过滤器, 将消化组织和上清液转移到50毫升锥形管中。使用3毫升注射器的柱塞, 通过过滤器, 轻轻地分离剩余的组织块。用10毫升的冷收获介质冲洗过滤器。
- 颗粒细胞通过离心在 400 x g 5 分钟在4°c。并用重悬8毫升环境温度 44% DG 溶液中的细胞颗粒。
- 将8毫升 44% DG 溶液/电池悬浮液转移到17毫米直径 x 100 mm 型14毫升聚丙烯圆底管。衬底与5毫升的环境温度 67% DG 溶液。离心机的梯度在室温和 1600 x g 20 分钟, 没有刹车。
- 用真空吸尘去除上面的脂肪层。使用巴斯德吸管在界面上收获菲比涂层, 并将其转移到含有40毫升冷收获介质的50毫升圆锥管上。
- 颗粒细胞通过离心在 400 x g 5 分钟在4°c。并用重悬1毫升冷收获介质中的细胞颗粒。使用台盼蓝排除计数可行细胞。
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Representative Results
描述了协议的示意图表示形式 (图 1)。肠道粘膜诱导和效应部位的淋巴细胞有明显的组织。Peyer 的斑块 (PP) 和肠系膜淋巴结 (MLN) 在组织良好的 T 细胞区和 B 细胞卵泡中含有淋巴细胞, 而肠道上皮则含有更弥漫分布的淋巴细胞。固有层 (LP) 包含弥漫分布淋巴细胞和淋巴细胞, 如分离的淋巴滤泡 (ILF) 和 cryptopatches 的组织淋巴结构中。每个肠道免疫室也具有独特的淋巴细胞子集组成 (图 2)。MLN 主要由αβ T 细胞 (~ 70%) 组成, 而 PP 淋巴细胞大多为 B 细胞 (~ 80%)。LP 淋巴细胞组成主要由αβ T 细胞和 B 细胞组成。与其他肠道隔间不同, 住在上皮细胞的淋巴细胞主要是γδ t 细胞 (~ 60%) 和αβ t 细胞, 基本上没有 B 细胞。αβ T 细胞亚群的不同比例也存在于不同的肠道解剖位置。LP 中的αβ t 细胞主要是 CD4+ t 细胞 (~ 70%), 而 CD8α+ t 细胞 (~ 85%) 在上皮内淋巴细胞 (IEL) 室中占主导地位。CD8α中的+ αβ t 单元格在 LP 和 IEL 间隔内表示 CD8αα homodimer 或 CD8αβ heterodimer 而感应站点 CD8α+ αβ T 细胞主要表示 CD8αβ heterodimer (图 3)。IEL 室中的大多数γδ t 细胞也表达 CD8α, 而 MLN 缺少 CD8α的γδ t 细胞 (图 3)。无论是笼统的, 淋巴细胞亚群的组成可以变化的小鼠菌株和可能会改变与年龄或疾病。因此, 应在用于实验操作的背景应变中, 对稳态肠道黏膜内淋巴细胞种群进行细致的分析。
根据小鼠的应变和年龄, 以及所使用的实验条件, 细胞产量可能会有很大差异。单, 活细胞可以计数的 hemocytometer 或自动计数机使用台盼蓝排除。淋巴细胞的数量计算为: 4 号门 (图 2) 中 3 x 淋巴细胞 (%) 中的细胞计数 x CD45+单元格 (%)。大约 15 x 106 MLN 淋巴细胞, 5-10 x 106 PP 淋巴细胞, 2-5 x 106 LP 淋巴细胞, 3-6 x 106 IEL 可以从8到12周的天真 C57Bl/6 或 Balb/c 鼠标获得。或者, 基于流的计数珠可以用来量化细胞的数量, 并告诫说, 细胞损失发生在染色过程中。最后, 在实验室中必须保持计数技术的一致性, 以确保在实验中进行适当的比较。
在本协议中, DTE 治疗用于丰富 IEL, 其次是 EDTA 治疗, 以去除 IEC, 以最佳隔离高浓缩淋巴细胞。两个 DTE 治疗足以隔离 > 95% 的 IEL。在 EDTA 治疗中也可以找到极少量的淋巴细胞。这些淋巴细胞类似于 IEL 和 LP 淋巴细胞的混合物 (图 4)。还对 dte 治疗和 dte-EDTA 联合治疗分离 IEL 进行了比较。DTE-EDTA 联合治疗增加了 IEL 制剂中的 IEC 污染 (图 5), 并降低了密度梯度离心后活免疫细胞的最终产量。密度梯度离心是建议, 以隔离淋巴细胞的肠道间隔。它去除死细胞, 许多上皮细胞和粘液, 促进高度丰富的淋巴细胞的分离和大幅减少流式细胞采集时间 (图 6)。
图 1.隔离协议流程图.DTE, dithioerythritol。EDTA, 乙二胺乙酸。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2.肠道组织淋巴细胞群的流式细胞术门策略.从肠系膜淋巴结 (MLN)、固有层 (LP)、Peyer 斑块 (PP) 和上皮内淋巴细胞 (IEL) 室中制备的单细胞悬浮液染色, 其活性染料 (如活/死) 和以下荧光标记抗体: CD45 用于鉴定造血细胞、CD19 B 细胞、CD3ε t 细胞、t 细胞受体 (TCR) βαβ t 细胞、TCRδγδ t 细胞、CD8α CD8α+ αβ t 细胞和 CD4 CD4+ αβ t 细胞。0号门显示了前向散射 (FSC)--a/侧散射 (SSC)--属性。1号门识别出单个细胞。2号门识别活细胞。3号门发现了造血细胞。4号门基于 FSC-a/SSC 的特性确定的淋巴细胞。5号门识别出 T 细胞和 B 细胞。6号门确定αβ t 细胞和γδ t 细胞之间的总 t 细胞。7号门在αβ t 细胞群中确定了 CD8α+和 CD4+ t 细胞。假彩色地块内的百分比 (以红色字体表示) 对应于前面的父母群体中所指明门内的细胞频率。0号门和1号门显示全部事件。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3.表型 ofCD8α+ αβ t 细胞和肠道组织中的γδ t 细胞.CD8β的表达 CD8α+ αβ t 细胞和 CD8α的表达γδ t 细胞描述。直方图内的百分比 (以红色字体表示) 对应于表示父母群体中表示标记的单元格的频率。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4.从 DTE、EDTA 和胶原酶治疗淋巴细胞的组成。家长门策略与在图 2中的相同。5号门识别出 T 细胞和 B 细胞。6号门确定αβ t 细胞和γδ t 细胞之间的总 t 细胞。7号门在αβ t 细胞群中确定了 CD8α+和 CD4+ t 细胞。假彩色地块内的百分比 (以红色字体表示) 对应于前面的父母群体中所指明门内的细胞频率。EDTA 分离的淋巴细胞与从 DTE 和胶原酶治疗分离的 IEL 和 LP 淋巴细胞的混合物相似。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5.dte 治疗与联合 dte-EDTA 治疗 IEL 分离的比较.DTE 治疗根据这项协议执行。IEL 在 DTE 治疗和 EDTA 治疗之前被收集了。DTE-EDTA 联合治疗是在相同浓度的情况下进行的, 但同时使用。CD45+造血细胞的属性、生存能力和百分比显示为 FSC/SSC。请单击此处查看此图的较大版本.
图 6.密度梯度离心对 IEL 和 LP 淋巴细胞制剂纯度的影响.根据该协议隔离的单细胞悬浮液受密度梯度离心或流式细胞仪直接分析。CD45+造血细胞的属性、生存能力和百分比显示为 FSC/SSC。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
本文提出了一种从肠道黏膜诱导 (MLN 和 PP) 和效应器 (LP 和 IEL 室) 中分离淋巴细胞的详细协议。该议定书已制定, 以平衡投入 (时间) 和产出 (可行性和产量), 以最大限度地提高生产率和成果。该协议还确保了 LP 和 IEL 隔间之间的最小交叉区划污染。
从小鼠小肠中分离免疫细胞的几项协议已发布3,4,5,6,7。这些协议大多集中于将免疫细胞从 LP 中分离出来。肠道上皮是由 LP 直接暴露于外部环境中的独特的隔间, 由淋巴细胞的独特成分组成。最近的方法通过检查不同的肠道间隔, 寻求对肠道免疫功能进行更全面的分析, 以了解这些车厢内发生的免疫应答的独特之处和关系他们之间。因此, 需要一个可靠的协议, 以隔离所有这些车厢的免疫细胞。两个 DTE 治疗足以隔离 > 95% 的 IEL 和一些 IEC。EDTA 靶向钙依赖的结, 是有效的分离 IEC。因此, 从随后的 EDTA 治疗中清液主要包括 IEC。在 EDTA 治疗后上清液中可发现少量淋巴细胞;然而, 大约20倍多的淋巴细胞是从 DTE 分数获得的。此外, EDTA 治疗的淋巴细胞类似于 IEL 和 LP 淋巴细胞的混合种群 (图 4), 这表明来自绒毛和隐窝损伤的 LP 污染。因此, 在本协议中, IEL 是在 EDTA 处理之前从 DTE 处理中收集的, 通过最小化跨室污染来最大限度地提高纯度。其他协议使用顺序 dithiothreitol (德勤)-edta 治疗或联合德勤-edta 治疗隔离 IEL5,6,7。epimer 是 DTE 的一项重要的行动, 两者都作为减少剂。在这些协议中, 据报道, 德勤只去除粘液, EDTA 被用来隔离 IEL。虽然在 dte 治疗或联合 dte-EDTA 治疗以后没有直接地比较 IEL 和 dte 的作用被评估了。毫不奇怪的是, DTE-EDTA 联合处理增加了 IEL 制剂中的 iec 污染 (图 5), 并且大量 iec 在密度梯度离心后的 IEL 产量下降。由于 EDTA 可能会损害一些绒毛和墓穴, 联合 DTE-EDTA 治疗也可能导致 lp 淋巴细胞在 IEL 准备或丢失 lp 细胞从 lp 隔离。此外, 由于 > 95% 的 IEL 从 dte 分数分离, 单独 DTE 和 EDTA 治疗是优选的。有些协议隔离淋巴细胞而不使用密度梯度离心来丰富免疫细胞6。密度梯度离心需要额外的时间和一些细胞的损失可能发生。然而, 它去除死的细胞, 上皮细胞和粘液, 导致高度丰富的淋巴细胞种群 (图 6), 这有助于加强检测小群体的细胞, 并大大减少了流动的采集时间细胞.密度梯度离心报告导致单核吞噬子集的变化率为7;然而, 淋巴细胞子集组成似乎正常。对 IEL 的分离进行密度梯度离心是特别有帮助的。总体上, 提出了一个完整的协议, 以分离高度丰富和最佳可行的淋巴细胞从所有肠道组织, 包括 LP 和 IEL 与最小的交叉区划污染。
在组织隔离步骤中必须大量的时间和注意, 以限制制剂之间的污染。不完全去除 PP 可大大扭曲 LP 淋巴细胞。ILF 也会污染 LP 的准备工作。然而, 肉眼看不到 ILF, 因此在消化前不能手术切除。不同的小鼠株有不同数量的 ILF14, 这可能会极大地促进小鼠株间 LP 淋巴细胞的可变成分。当去除粘液时, 一定要轻轻滑动肠道, 避免损伤基底膜和 lp, 这可能导致 IEL 的 lp 污染。污染的一个征兆是在 IEL 制剂中存在大量的 B 细胞。IEL 含有少量 B 细胞 (约1% 或更少), 而 LPL 可以有多达 60% B 细胞, 取决于小鼠的应变。CD19 但不 B220 应用于识别 LP 和 IEL 室中的 B 细胞, 因为肠道 T 细胞也可能表达 B22015。此外, 许多肠道 T 细胞可能会表达传统的巨细胞和 DC 标记, 如 CD11b 和 CD11c, 分别为16。因此, 应利用适当的转储浇注策略来确保适当的分析。
可以修改步骤以适应研究人员的需要。机械消化可以满足聚丙烯淋巴细胞在稳态状态下的分离, 或胶原酶消化可促进炎症过程中某些亚白细胞的分离。所使用的胶原酶的类型可能对细胞表面标记表达和 LP 淋巴细胞的活力和纯度有很大的影响5,17。肠道可以切成小块, 用于胶原酶消化, 这可能会增加细胞的产量。然而, 它也降低了生存能力。胶原酶的潜伏期可以优化, 以最大限度地提高产量, 同时尽量减少细胞死亡, 导致活细胞的最大恢复。不同的实验室使用略微不同的密度梯度来分离淋巴细胞。本文介绍了一种建立完善的 44%/67% 密度梯度协议。研究人员可以测试不同的密度梯度, 以最适合他们的个人需求。如果需要更多的淋巴细胞, 两个小肠可以结合 DTE 治疗, EDTA 治疗和胶原酶消化。如果需要两个以上的肠道来检查极其罕见的事件, 那么建议在隔离后将单个细胞悬浮液汇集在一起。
孤立淋巴细胞可用于进一步的表型, 功能, 和基因组分析。在进行流细胞分析时, 最好始终使用活性染料和 anti-CD45 抗体排除死细胞和非造血细胞, 这将大大加强分析。如果需要纯淋巴细胞种群, 则可以执行 CD45+单元格的细胞排序以及其他选择标记。anti-CD8α-coated 板上的平移也可用于分离纯 t 细胞与 IEL 制备, 因为这些 t 细胞的大多数表达 CD8α。IEL 的培养通常需要平移或细胞分类, 因为污染的上皮细胞可以抑制 IEL 的生长。还可以增加饲养单元, 如天真的脾, 以促进 IEL 在文化中的生存。如果使用馈线, 重要的是利用 congenically 不匹配的细胞来区分人群。由于收获培养基含有青霉素、链霉素和庆大霉素, 细菌污染在短期功能研究中很少出现问题。另外, 许多洗涤步骤和密度梯度离心去除多数细菌。
隔离过程是耗时的, 需要平衡的照顾, 精度和速度的最佳结果。必须花费足够的时间来确保每个步骤的正确操作, 同时尽量减少鼠标牺牲和获得单个细胞悬浮的时间, 从而最大限度地提高细胞的生存能力和产量。这是一个微妙的平衡, 这也是一个瓶颈, 初学者试图获得一致性的隔离淋巴细胞, 高生存能力和产量。一个整个隔离过程从老鼠安乐死开始获得计数的唯一细胞悬浮采取一位老练的研究员大约 8 h 为8只老鼠。建议获得8多只老鼠的帮助, 以产生高质量和可重现的结果。在比较这些组织与脾脏、血液或其他淋巴组织中的淋巴细胞时, 需要小心, 因为广泛的孵化可能导致与隔离过程相关的人工变化17。常规比较 LP 和 IEL 人口到相似地被处理的淋巴组织将评估兴趣标记是否调控在淋巴细胞分离从肠道组织。类似的问题也是一个主要的关注, 当比较的 RNA 剖面从肠道与那些从淋巴组织。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
学理学士由 NIH 赠款 (R01 AI076457) 和石溪大学提供的资金支持。Z.Q. 得到 NIH 赠款 (K12 GM102778) 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| L-glutamine | Sigma-aldrich | G3126-100G | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15710-072 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 21870-076 | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 26140-079 | |
| 10x Hanks' balanced salt solution | Sigma-aldrich | H4641-500ML | |
| 1,4-Dithioerythritol | Sigma-aldrich | D9680-5G | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575-020 | |
| Calsium chloride hexahydrate | Sigma-aldrich | 21108-500G | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-aldrich | M2670-100G | |
| Collagenase, Type I | Life Technologies | 17100-017 | |
| DG gradient stock solution (Percoll) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Biolegend | 420301 | |
| 70-µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Corning | 352059 | |
| Erlenmeyer flask | Kimble | 26500R-50mL | |
| Magnetic stirrer | Thermo Fisher | 50094596 | |
| Stir bar | Fisher Scientific | 14-512-148 |
References
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